本發(fā)明涉及組織工程學生物材料技術領域，具體為一種可體外替代牙齦上皮進行牙科護理產(chǎn)品、醫(yī)療器械、牙科材料、化學品、小分子化合物、活性蛋白等產(chǎn)品的安全性與功效性檢測及其他與牙齦上皮接觸的材料的安全性與功效性評價的牙齦上皮模型及其構建方法。
背景技術：
目前，牙齦上皮在牙科護理產(chǎn)品的安全性及功效性檢測，煙草成分致癌能力檢測，口腔致病菌致病機理研究等各方面得到越來越多的關注。但目前研究中牙齦上皮來源主要是動物牙齦上皮、患者手術切除牙齦上皮組織。兩者都存在一定的應用弊端，動物來源的牙齦上皮組織不能準確的反應人體實驗；此外，大量動物用于各項試驗的倫理問題受到質疑，國際上已禁止化妝品、化學品等的動物實驗。人體來源的牙齦上皮組織主要存在取材困難、來源有限，不能滿足牙齦相關產(chǎn)品安全性體外評價數(shù)量需求。
因此，體外重建三維人牙齦上皮模型成為安全性及功效性等檢測的重要評價工具。目前的牙齦上皮模型開發(fā)主要有兩種類型：一種是應用材料學和生物工程學原理構建的牙齦上皮替代物，該類模型不利于細胞生長，難以實現(xiàn)細胞功能的檢測與評價。另一類是應用細胞復合材料培養(yǎng)的方法，以膠原等材料為支架，構建形成牙齦上皮結構。lauer等人用牙齦上皮，利用3t3細胞為滋養(yǎng)層，在體外培養(yǎng)3~4周可形成完整的包含3~6層細胞的上皮膜片，檢測結果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的上皮分化良好，與正常組織類似，但異種滋養(yǎng)層細胞的應用，對檢測結果的準確性有一定影響。
從以上的分析中可以看出，雖然現(xiàn)在已有相關的牙齦上皮模型被開發(fā)，但這些模型存在一系列的缺陷：一，模型支架常采用外源細胞，在后期應用中存在一定的局限性；二、構建時間長，體外構建一批模型需長達一個月時間，過長的構建時間會增加過程中的不可控因素，影響模型的穩(wěn)定性；三，培養(yǎng)體系單一不能適應細胞不同階段的營養(yǎng)需求，導致模型復層化較差，結構不均一完整，屏障功能減弱，嚴重降低模型的應用。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所解決的技術問題在于提供一種牙齦上皮模型及其體外構建方法，是應用細胞生物學和工程學原理，使用人牙齦上皮細胞，經(jīng)體外擴增后，采用氣液面培養(yǎng)法，在不同階段使用不同培養(yǎng)體系，使其復層化，形成體外牙齦上皮模型，以解決上述背景技術中的缺點。
本發(fā)明所解決的技術問題采用以下技術方案來實現(xiàn)：一種牙齦上皮模型的體外構建方法，包括以下方法步驟：
步驟一、牙齦上皮細胞的原代培養(yǎng)及擴增
將正常人牙齦組織，用含100iu/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的pbs0.01m在ph=7.4的條件下進行沖洗。修整組織塊，去除皮下結締組織,將組織塊剪成約10mm3大小，用含100iu/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的pbs0.01m在ph=7.4的條件下進行沖洗，使用dispase液在4℃條件下消化16-18h。分離組織上皮層和皮下結締組織層，將分離得到的上皮層轉入預置1.5ml0.25%胰蛋白酶的離心管中，37℃條件下孵育5min，消化獲得單細胞懸液。加入角化細胞無血清培養(yǎng)基重新懸浮細胞，轉至培養(yǎng)瓶中，12h后換液，以后隔天換液一次。使用p4~p20代細胞，以胰酶消化制成單細胞懸液，調整細胞密度5.0×105個/ml～5.0×106個/ml，接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液ⅰ培養(yǎng)，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使細胞分散均勻后，置于37℃、5%co2條件下培養(yǎng)；
步驟二、牙齦上皮細胞液下接種培養(yǎng)
使用p4~p20代細胞，以培養(yǎng)液ⅱ制成單細胞懸液，調整細胞密度為5.0×105個/ml～5.0×106個/ml，進行接種，置于37℃、5%co2條件下培養(yǎng)1～5小時；后轉入液下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為1～10天，每天換液；
步驟三、牙齦上皮模型氣液面的增殖分化培養(yǎng)
將上述小室內(nèi)的培養(yǎng)液棄掉，更換為培養(yǎng)液ⅲ，進行氣液面培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為1～10天，每天換液；再更換為培養(yǎng)液ⅳ，繼續(xù)進行氣液面培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為1～10天，每天換液；最后更換為培養(yǎng)液ⅴ，繼續(xù)進行氣液面培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為1～10天，每天換液，培養(yǎng)結束，牙齦上皮模型的體外構建結束；
本發(fā)明中，所述培養(yǎng)液ⅰ，為dmem，其所含葡萄糖含量為1.0～4.5g/l，谷氨酰胺含量為1.0～10.0mm；
本發(fā)明中，所述培養(yǎng)液ⅱ，為在培養(yǎng)液ⅰ中，添加人表皮生長因子濃度為0.1～150.0ng/ml，胰島素濃度為0.1～150.0ng/ml，氫化可的松濃度為0.1～20.0μg/ml，三磷酸腺苷濃度為1.0～150.0μg/ml，轉鐵蛋白濃度為1.0～150.0ng/ml，孕酮濃度為1.0～100.0nm，對羥基苯甲酸丁酯濃度為0.1～10.0μg/ml，牛腦垂體浸提物濃度為1.0～100.0μg/ml，腺嘌呤10～100μg/ml，硒酸鈉1.0～50.0nm；
本發(fā)明中，所述培養(yǎng)液ⅲ，為在培養(yǎng)液ⅱ中，添加cacl2濃度為20.0～100.0μg/ml，維生素c濃度為10.0～50.0μg/ml；
本發(fā)明中，所述培養(yǎng)液ⅳ，為在培養(yǎng)液ⅱ中，添加cacl2濃度為50.0～150.0μg/ml，維生素c濃度為50.0～100.0μg/ml；
本發(fā)明中，所述培養(yǎng)液ⅴ，為在培養(yǎng)液ⅱ中，添加cacl2濃度為150.0～300.0μg/ml，維生素c濃度為1.0～10.0μg/ml。
本發(fā)明中，進一步地，該模型應用于牙科護理產(chǎn)品、醫(yī)療器械、牙科材料、化學品、小分子化合物、活性蛋白等產(chǎn)品的安全性及功效性檢測，煙草成分致癌能力檢測，口腔致病菌致病機理研究。
本發(fā)明的有益效果：
一，人源牙齦上皮細胞的使用，使模型結構及功能更接近正常人體牙齦上皮組織，能更加真實的反應檢測指標；
二、體外構建重復性佳，可實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化制備；
三、氣液面分段培養(yǎng)法，保證了細胞在不同階段的不同營養(yǎng)需求，縮短了構建時間、降低生產(chǎn)成本；
四、培養(yǎng)基中因子的添加，保證了模型的正常復層化，從而形成了和人體牙齦上皮高度類似的連接結構，并正常表達了牙齦上皮相關蛋白，這種自身結構和細胞外微環(huán)境的影響可進一步提升模型的屏障功能，最終構建的體外牙齦上皮模型與人牙齦上皮組織具有高度相似的結構及功能。
附圖說明
圖1為為牙齦上皮模型構建結束后進行組織學切片h&e染色照片。
具體實施方式
為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合具體圖示，進一步闡述本發(fā)明。
實施例1：本實施例著重介紹一種牙齦上皮模型的體外構建方法步驟：
步驟一、人牙齦上皮細胞的原代培養(yǎng)及擴增：
將正常人牙齦組織，用含100iu/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的0.01mpbs在ph=7.4的條件下進行沖洗。修整組織塊，去除皮下結締組織,將組織塊剪成約10mm3大小，用含100iu/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的0.01mpbs在ph=7.4的條件下進行沖洗，使用dispase液在4℃條件下消化16h。分離組織上皮層和皮下結締組織層，將分離得到的上皮層轉入預置1.5ml0.25%胰蛋白酶的離心管中，37℃條件下孵育5min，消化獲得單細胞懸液。加入角化細胞無血清培養(yǎng)基重新懸浮細胞，轉至培養(yǎng)瓶中，12h后換液，以后隔天換液一次。
使用p8代細胞，以胰酶消化制成單細胞懸液，調整細胞密度5.0×105個/ml，接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液ⅰ培養(yǎng)，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使細胞分散均勻后，置于37℃、5%co2條件下培養(yǎng)；
所述培養(yǎng)液ⅰ，為dmem，其所含葡萄糖含量為1.0g/l，谷氨酰胺含量為1.0mm；
步驟二、牙齦上皮細胞液下接種培養(yǎng)
取p8代細胞，以培養(yǎng)液ⅱ制成單細胞懸液，調整細胞密度為5.0×105個/ml，進行接種，接種量為0.1ml，置于37℃、5%co2條件下培養(yǎng)1小時；后轉入液下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為2天，每天換液；
所述培養(yǎng)液ⅱ，為在培養(yǎng)液ⅰ中添加人表皮生長因子0.1ng/ml，胰島素0.1ng/ml，氫化可的松0.1μg/ml，三磷酸腺苷10.0μg/ml，轉鐵蛋白10.0ng/ml，孕酮1.0nm，對羥基苯甲酸丁酯0.2μg/ml，牛腦垂體浸提物10.0μg/ml，腺嘌呤10.0μg/ml，硒酸鈉2.0nm；
步驟三、牙齦上皮模型氣液面的增殖分化培養(yǎng)
將上述小室內(nèi)的培養(yǎng)液棄掉，更換為培養(yǎng)液ⅲ，進行氣液面培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為9天，每天換液；再更換為培養(yǎng)液ⅳ，繼續(xù)進行氣液面培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為9天，每天換液；最后更換為培養(yǎng)液ⅴ，繼續(xù)進行氣液面培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為9天，每天換液，培養(yǎng)結束，牙齦上皮模型的體外構建結束；
所述培養(yǎng)液ⅲ，為在培養(yǎng)液ⅱ中添加cacl230.0μg/ml，維生素c10.0μg/ml；
所述培養(yǎng)液ⅳ，為在培養(yǎng)液ⅱ中添加cacl2100.0μg/ml，維生素c50.0μg/ml；
所述培養(yǎng)液ⅴ，為在培養(yǎng)液ⅱ中添加cacl25.0μg/ml，維生素c100.0μg/ml。
實施例2：
本實施例著重介紹一種牙齦上皮模型的體外構建方法步驟：
步驟一、人牙齦上皮細胞的原代培養(yǎng)及擴增：
將正常人牙齦組織，用含100iu/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的pbs0.01m在ph=7.4的環(huán)境下沖洗。修整組織塊，去除皮下結締組織,將組織塊剪成約10mm3大小，用含100iu/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的pbs0.01m在ph=7.4的環(huán)境下沖洗，使用dispase液在4℃條件下消化16h。分離組織上皮層和皮下結締組織層，將分離得到的上皮層轉入預置1.5ml0.25%胰蛋白酶的離心管中，37℃條件下孵育5min，消化獲得單細胞懸液。加入角化細胞無血清培養(yǎng)基重新懸浮細胞，轉至培養(yǎng)瓶中，12h后換液，以后隔天換液一次。
使用p8代細胞，以胰酶消化制成單細胞懸液，調整細胞密度5.0×105個/ml，接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液ⅰ培養(yǎng)，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使細胞分散均勻后，置于37℃、5%co2條件下培養(yǎng)；
所述培養(yǎng)液ⅰ，為dmem，其所含葡萄糖含量為1.0g/l，谷氨酰胺含量為1.0mm；
步驟二、牙齦上皮細胞液下接種培養(yǎng)
取p8代細胞，以培養(yǎng)液ⅱ制成單細胞懸液，調整細胞密度為5.0×105個/ml，進行接種，接種量為0.1ml，置于37℃、5%co2條件下培養(yǎng)1小時；后轉入液下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為2天，每天換液；
所述培養(yǎng)液ⅱ，為在培養(yǎng)液ⅰ的基礎上，添加人表皮生長因子50.0ng/ml，胰島素50.0ng/ml，氫化可的松8.0μg/ml，三磷酸腺苷100.0μg/ml，轉鐵蛋白100.0ng/ml，孕酮75.0nm，對羥基苯甲酸丁酯8.0μg/ml，丁二胺75.0μm，牛腦垂體浸提物75.0μg/ml，腺嘌呤50.0μg/ml，硒酸鈉20.0nm;
步驟三、牙齦上皮模型氣液面的增殖分化培養(yǎng)
將上述小室內(nèi)的培養(yǎng)液棄掉，更換為培養(yǎng)液ⅲ，進行氣液面培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為3天，每天換液；再更換為培養(yǎng)液ⅳ，繼續(xù)進行氣液面培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為3天，每天換液；最后更換為培養(yǎng)液ⅴ，繼續(xù)進行氣液面培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為3天，每天換液，培養(yǎng)結束，牙齦上皮模型的體外構建結束；
所述培養(yǎng)液ⅲ，為在培養(yǎng)液ⅱ中添加cacl230.0μg/ml，維生素c10.0μg/ml；
所述培養(yǎng)液ⅳ，為在培養(yǎng)液ⅱ中添加cacl2100.0g/ml，維生素c50.0μg/ml；
所述培養(yǎng)液ⅴ，為在培養(yǎng)液ⅱ中添加cacl25.0μg/ml，維生素c100.0μg/ml。
實施例3：
本實施例著重介紹一種牙齦上皮模型的體外構建方法步驟：
步驟一、人牙齦上皮細胞的原代培養(yǎng)及擴增：
將正常人牙齦組織，用含100iu/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的pbs0.01m在ph=7.4的環(huán)境下沖洗。修整組織塊，去除皮下結締組織,將組織塊剪成約10mm3大小，用含100iu/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的pbs0.01m在ph=7.4的環(huán)境下沖洗，使用dispase液在4℃條件下消化16h。分離組織上皮層和皮下結締組織層，將分離得到的上皮層轉入預置1.5ml0.25%胰蛋白酶的離心管中，37℃條件下孵育5min，消化獲得單細胞懸液。加入角化細胞無血清培養(yǎng)基重新懸浮細胞，轉至培養(yǎng)瓶中，12h后換液，以后隔天換液一次。
使用p16代細胞，以胰酶消化制成單細胞懸液，調整細胞密度5.0×105個/ml，接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液ⅰ培養(yǎng)，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使細胞分散均勻后，置于37℃、5%co2條件下培養(yǎng)；
所述培養(yǎng)液ⅰ，為dmem，其所含葡萄糖含量為1.0g/l，谷氨酰胺含量為1.0mm；
步驟二、牙齦上皮細胞液下接種培養(yǎng)
取p16代細胞，以培養(yǎng)液ⅱ制成單細胞懸液，調整細胞密度為5.0×105個/ml，進行接種，接種量為0.1ml，置于37℃、5%co2條件下培養(yǎng)1小時；后轉入液下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為2天，每天換液；
所述培養(yǎng)液ⅱ，為在培養(yǎng)液ⅰ的基礎上，添加人表皮生長因子50.0ng/ml，胰島素50.0ng/ml，氫化可的松8.0μg/ml，三磷酸腺苷100.0μg/ml，轉鐵蛋白100.0ng/ml，孕酮75.0nm，對羥基苯甲酸丁酯8.0μg/ml，丁二胺75.0μm，牛腦垂體浸提物75.0μg/ml，腺嘌呤100.0μg/ml，硒酸鈉50.0nm;
步驟三、牙齦上皮模型氣液面的增殖分化培養(yǎng)
將上述小室內(nèi)的培養(yǎng)液棄掉，更換為培養(yǎng)液ⅲ，進行氣液面培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為3天，每天換液；再更換為培養(yǎng)液ⅳ，繼續(xù)進行氣液面培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為3天，每天換液；最后更換為培養(yǎng)液ⅴ，繼續(xù)進行氣液面培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為3天，每天換液，培養(yǎng)結束，牙齦上皮模型的體外構建結束；
所述培養(yǎng)液ⅲ，為在培養(yǎng)液ⅱ中添加cacl230.0μg/ml，維生素c10.0μg/ml；
所述培養(yǎng)液ⅳ，為在培養(yǎng)液ⅱ中添加cacl2100.0μg/ml，維生素c50.0μg/ml；
所述培養(yǎng)液ⅴ，為在培養(yǎng)液ⅱ中添加cacl210.0μg/ml，維生素c100.0μg/ml。
具體的說，上述步驟中采用正常人牙齦上皮細胞，相比傳統(tǒng)的種子細胞來源，人源牙齦上皮細胞的使用，使模型結構及功能更接近正常人體牙齦上皮組織，能更加真實的反應檢測指標，成為體外測試的核心工具而得到廣泛的應用。
上述步驟中采用的培養(yǎng)液ⅱ，在傳統(tǒng)培養(yǎng)液的基礎上，添加了各種因子，其中人表皮生長因子能夠刺激細胞生長遷移，抑制衰老基因的出現(xiàn)，延緩上皮細胞衰老；胰島素可刺激細胞對尿苷和葡萄糖的吸收以合成rna、蛋白質和脂質，胰島素還能與細胞膜上的胰島素受體結合而調控細胞內(nèi)的多種代謝途徑，增加脂肪酸和葡萄糖的合成，對細胞生長起重要作用；氫化可的松可能兼有促細胞貼附和增殖作用，細胞密度高時可誘導細胞發(fā)生分化。針對傳統(tǒng)培養(yǎng)所使用的單一培養(yǎng)基只能夠提供氨基酸、維生素、無機鹽、有機化合物、微量元素的缺陷，這些因子的添加，保證了細胞的營養(yǎng)需求，促進了細胞的生長。
上述步驟中采用氣液面分段培養(yǎng)的方法，在不同階段使用不同培養(yǎng)體系，使其復層化，形成體外牙齦上皮模型,如圖1所示。該方法中氣液面培養(yǎng)分為三個階段，使用的培養(yǎng)液分別為培養(yǎng)液ⅲ、ⅳ、ⅴ，與培養(yǎng)液ⅱ的區(qū)別在于，在培養(yǎng)液ⅱ中添加了cacl2及維生素c，且在各培養(yǎng)階段cacl2及維生素c的濃度不同。cacl2在不同濃度下可對牙齦上皮細胞的增殖、分化產(chǎn)生不同影響；維生素c可刺激鞘磷脂的生成和板層小體內(nèi)容成熟，如增加糖基化神經(jīng)酰胺的合成，促進上皮細胞分化，有利于角質層的形成，進而提高上皮屏障功能。在培養(yǎng)液ⅲ階段，cacl2及維生素c的濃度較低，此時上皮細胞形成的細胞間連接較少，細胞處于迅速擴增狀態(tài)，而人表皮生長因子、胰島素、氫化可的松等因子也促進了細胞的增殖，該條件保證了細胞增殖所需的因子濃度，并使上皮細胞開始復層化。在培養(yǎng)液ⅳ階段，cacl2及維生素c的濃度升高，在該條件下，cacl2及維生素c誘導上皮細胞發(fā)生多種變化，包括誘導細胞復層化、形成角質層、橋粒、半橋粒和黏著連接，并正常表達角蛋白、絲聚合蛋白、兜甲蛋白等牙齦上皮相關蛋白，ca2+是細胞分化過程的重要條件，尤其是復層及橋粒、半橋粒的形成和聚集；此時人表皮生長因子、胰島素、氫化可的松等因子也保證了細胞的正常增殖，同時在細胞密度增加的情況下，氫化可的松也發(fā)揮了誘導細胞分化的作用。不同階段各因子的添加，保證了模型完整復層化。
綜上所述，與傳統(tǒng)的單一培養(yǎng)基、單一培養(yǎng)方式的構建方法相比：第一，該方法不同階段添加的因子種類及含量均不同，保證了細胞在復層化過程中不同階段的不同營養(yǎng)需求，使模型培養(yǎng)時間極大縮短。第二，氣液面分段培養(yǎng)及因子的添加，也保證了模型的正常復層化，從而形成了和人體牙齦上皮高度類似的連接結構：首先可以使基底層形成和正常牙齦上皮生理結構高度相似的半橋粒結構，使模型與濾膜結合緊密；其次，模型的正常復層還可以形成細胞與細胞間較好的橋粒結構，保證細胞間緊密連接；橋粒和半橋粒使組織具有較強抗張、抗壓能力，結構更加均一完整，最終使模型屏障功能增強；第三，正常的復層化可保證牙齦上皮相關蛋白的正常表達，例如角蛋白、絲聚合蛋白、兜甲蛋白等，這些蛋白的正常表達對牙齦上皮的結構穩(wěn)態(tài)具有重要作用，這種細胞外的微環(huán)境影響可進一步提升模型的屏障功能。最終構建的體外牙齦上皮模型與人牙齦上皮組織具有高度相似的結構及功能，彌補了傳統(tǒng)模型構建方法的缺陷，在縮短構建時間、降低成本的同時，保證了模型的安全性與功效性。
使用本發(fā)明構建的牙齦上皮模型、人牙齦上皮組織、鼠牙齦上皮組織對《全球化學品統(tǒng)一分類和標簽制度》中部分化學品進行檢測，結果顯示，使用本發(fā)明提供的方法制備的牙齦上皮模型能夠準確判定該化學品是否具有刺激性，其結果與使用人牙齦上皮組織的判定結果一致，而使用鼠牙齦上皮組織的判定出現(xiàn)假陽性及假陰性結果，因此，牙齦上皮模型能夠客觀真實的反映檢測結果，能夠很好的替代動物模型，成為體外測試的核心工具。
使用本發(fā)明提供的方法制備的牙齦上皮模型，能夠滿足目前市場對體外檢測的需求，極大的擴充了市場應用方向，其應用主要包括：一，口腔護理產(chǎn)品如牙膏、漱口水、口腔噴霧等配方及牙科材料的刺激性、毒性檢測，以及配方中功效成分的功效性檢測。二，醫(yī)療器械、牙科材料、小分子化合物、活性蛋白、化學品等產(chǎn)品的安全性及功效性檢測。三，煙草成分刺激性、致癌性的檢測，研究吸煙對人牙齦牙周疾病的影響。五，口腔致病菌致病機理研究等。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點，本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)，本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。