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一種含血清的口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液的制作方法

文檔序號(hào):12857872閱讀:445來源:國(guó)知局
一種含血清的口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液的制作方法與工藝

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,尤其涉及一種含血清的口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液。



背景技術(shù):

近年來,隨著體外器官培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展,基于體外細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)建的3d重組角膜上皮模型,在眼刺激風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)領(lǐng)域表現(xiàn)出特有的趨勢(shì),類似于人體角膜上皮的細(xì)胞三維結(jié)構(gòu),不僅可以更為真實(shí)的反映人體對(duì)化學(xué)物的響應(yīng),準(zhǔn)確給出化學(xué)物刺激性的預(yù)測(cè),對(duì)于化合物篩選的種類也具有更寬的應(yīng)用范疇,不僅適用于化妝品原料的危害評(píng)價(jià),還可以用于不同劑型的化妝品成品的危害評(píng)估。目前,角膜上皮細(xì)胞是構(gòu)建體外三維角膜上皮組織模型最理想的種子細(xì)胞,但是,可用角膜組織的有限來源,加之角膜細(xì)胞自身短暫的生命周期以及快速的分化,使得角膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)難度大,且非常耗時(shí)。所以開發(fā)多種其他種子細(xì)胞來構(gòu)建角膜組織,研究發(fā)現(xiàn)口腔黏膜上皮細(xì)胞與角膜上皮細(xì)胞特征相似,可以用于構(gòu)建角膜樣模型。

口腔黏膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)大多是參照皮膚kc的培養(yǎng)技術(shù),早期多采用有血清培養(yǎng)基和組織塊法,血清成份占10-20%。souhtgaet等綜合分析了培養(yǎng)基中的各種成份對(duì)原代口腔黏膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)分化的影響,研究發(fā)現(xiàn)含血清10%的培養(yǎng)基成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)明顯,對(duì)正常的口腔黏膜上皮細(xì)胞造成嚴(yán)重的污染,影響口腔黏膜上皮細(xì)胞在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。隨后許多口腔黏膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)采用酶解培養(yǎng)法,即用胰酶和dispaseⅱ酶酶解方法分離口腔黏膜上皮細(xì)胞,然后以3t3作為滋養(yǎng)層的技術(shù)來進(jìn)行的,但由于滋養(yǎng)細(xì)胞的存在影響試驗(yàn)結(jié)果的分析。而且,許多研究者相信3t3細(xì)胞和人細(xì)胞共同培養(yǎng)有可能引起突變或異種蛋白對(duì)人kc的轉(zhuǎn)染,強(qiáng)調(diào)在選擇性手術(shù)中盡量不用滋養(yǎng)層培養(yǎng)上皮細(xì)胞。為了避免使用滋養(yǎng)層,人們開發(fā)了多種方法:如培養(yǎng)皿表面涂細(xì)胞基質(zhì)成份;不同濃度的鈣和各種生物提取物的添加;促分裂物和微量元素的添加。例如,arehnoltibdnslev應(yīng)用含10%血清的無滋養(yǎng)層培養(yǎng)方法培養(yǎng)口腔黏膜上皮細(xì)胞,但是結(jié)果顯示口腔黏膜上皮細(xì)胞僅可傳代兩次,細(xì)胞形成復(fù)層。

針對(duì)上述情況,許多學(xué)者正尋求和使用無血清培養(yǎng)液,目前已有商品化的無血清培養(yǎng)基如k-sfm和mcdb153。盡管在無血清體系中添加多種類型的細(xì)胞生長(zhǎng)因子如egf、胰島素、牛垂體提取液、氫化潑尼松、轉(zhuǎn)鐵蛋白和霍亂毒素,但是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足血清中復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)成份,所以無血清培養(yǎng)體系下培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,原有的干細(xì)胞特性下降,容易出現(xiàn)老化現(xiàn)象,很難大量擴(kuò)增,從而限制了其在大規(guī)模的組織工程構(gòu)建中的應(yīng)用。另外,無血清培養(yǎng)基缺乏通用性,一種無血清培養(yǎng)基只能做到為一種或少數(shù)幾種細(xì)胞株設(shè)計(jì)或優(yōu)化出高密度生長(zhǎng)或高水平目的產(chǎn)物表達(dá)的培養(yǎng)基。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種含血清的口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液,針對(duì)含10%血清的無滋養(yǎng)層培養(yǎng)方法培養(yǎng)口腔黏膜上皮細(xì)胞時(shí),最多可傳代兩代并復(fù)層化的問題,以及無血清培養(yǎng)體系下,口腔黏膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、原有的干細(xì)胞特性下降、容易出現(xiàn)老化現(xiàn)象、很難大量擴(kuò)增等一系列問題,本發(fā)明實(shí)施例提供的一種含血清的口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液,既能夠滿足細(xì)胞增殖又不影響細(xì)胞分化,增加細(xì)胞的傳代代次,使得口腔黏膜上皮細(xì)胞的大量擴(kuò)增,以滿足臨床和組織工程構(gòu)建的需求。

為達(dá)到上述目的,本發(fā)明實(shí)施例采用如下技術(shù)方案:

本發(fā)明實(shí)施例提供一種含血清的口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液,含血清的口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液、血清、必需補(bǔ)充因子、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子以及細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)因子。

本發(fā)明提供的一種含血清的口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中,基礎(chǔ)培養(yǎng)液均為k-sfm培養(yǎng)液或者mcdb153培養(yǎng)液或者f12/dmem培養(yǎng)液,其中,f12/dmem培養(yǎng)液是f12培養(yǎng)液和dmem培養(yǎng)液以體積比1:3的比例混合的。

本發(fā)明提供的一種含血清的口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液,包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液、濃度為0.5%-5%的胎牛血清、濃度為5-15μg/ml的胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白、濃度為5-20ng/ml的表皮生長(zhǎng)因子egf、胰島素生長(zhǎng)因子igf-i、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子tgfβ和bpe、濃度為5-20ng/ml的貼壁因子纖連蛋白以及濃度為1-5μm的細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)因子維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632和cacl2。

本發(fā)明還提供一種含血清的口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液的配制方法,包括以下步驟:

在k-sfm培養(yǎng)液或mcdb153培養(yǎng)液或體積比為1∶3的f12和dmem三種培養(yǎng)液中的任意一種中,依次添加濃度為5-15μg/ml的胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白、濃度均為5-20ng/ml的表皮生長(zhǎng)因子egf、胰島素生長(zhǎng)因子igf-i、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子tgfβ和bpe、濃度為5-20ng/ml的貼壁因子纖連蛋白,以及濃度均為1-5μm的維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632和cacl2。最后再添加0.5%~5%的胎牛血清后形成的。

本發(fā)明提供的一種含血清的口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液的有益效果有:

(1)低濃度血清和其他細(xì)胞因子協(xié)同提供細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)成份:

與無血清培養(yǎng)基相比,低濃度的血清能夠?yàn)榧?xì)胞提供外界無法補(bǔ)充的未知的血清成份,從而避免了無血清培養(yǎng)體系下細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,原有的干細(xì)胞特性下降,容易出現(xiàn)老化現(xiàn)象等弊端;與含10%血清的培養(yǎng)基相比,低濃度血清加外加其他細(xì)胞因子的方法既能提供充足的營(yíng)養(yǎng),保證細(xì)胞高密度增殖,又能避免口腔黏膜上皮細(xì)胞的過度分化,從而可以實(shí)現(xiàn)口腔黏膜上皮細(xì)胞的體外大規(guī)模擴(kuò)增,用于組織工程模型的構(gòu)建。

(2)多種細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)劑實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)

本發(fā)明將維甲酸、甘醇酸、rock激酶抑制劑這三種作用機(jī)理各不相同的細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)因子共同添加到培養(yǎng)體系中,協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié),從而使得細(xì)胞保持原有的特性,避免過度分化。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的不同培養(yǎng)體系下,p6代口腔黏膜上皮細(xì)胞增殖曲線的比較結(jié)果;

圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的不同培養(yǎng)體系下,原代口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞增殖分化指標(biāo)ki67、profilaggrin、k13和k19蛋白的mrna水平比較結(jié)果;

圖3(a)為本發(fā)明實(shí)施例提供的不同培養(yǎng)基體系下培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細(xì)胞所構(gòu)建的角膜樣模型的組織學(xué)染色圖片一;

圖3(b)為本發(fā)明實(shí)施例提供的不同培養(yǎng)基體系下培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細(xì)胞所構(gòu)建的角膜樣模型的組織學(xué)染色圖片二。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖,對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)地描述。

需要說明的是,本發(fā)明實(shí)施例中使用的k-sfm、f12/dmem、mcdb153均購自gibco公司,胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長(zhǎng)因子egf、胰島素生長(zhǎng)因子igf-i、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子tgfβ、纖連蛋白、cacl2、甘醇酸、維甲酸以及rock抑制劑y27632均購自sigma公司,bpe為本公司自行提取的。

實(shí)施例1

本發(fā)明實(shí)施例提供一種含血清的口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液,包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液、血清、必需補(bǔ)充因子、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子以及細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)因子。

其中,血清為濃度為0.5%-5%的胎牛血清,必需補(bǔ)充因子包括濃度為5-15μg/ml的胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白,細(xì)胞生長(zhǎng)因子包括濃度均為5-20ng/ml的表皮生長(zhǎng)因子egf、胰島素生長(zhǎng)因子igf-i、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子tgfβ和bpe、貼壁因子為濃度為5-20ng/ml的纖連蛋白、細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)因子為濃度均為1-5μm的維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632和cacl2。

需要說明的是,基礎(chǔ)培養(yǎng)液為k-sfm培養(yǎng)液或者mcdb153培養(yǎng)液或者f12/dmem培養(yǎng)液,其中,f12/dmem培養(yǎng)液是f12培養(yǎng)液和dmem培養(yǎng)液以體積比1:3的比例混合的。

示例性的,在第一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中,本發(fā)明實(shí)施例提供的含血清的口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液可以包括:

以f12/dmem(1:3)作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液配制1l含血清的口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液,具體步驟如下:

(1)在超凈工作臺(tái)中用無菌去離子水配制必需補(bǔ)充因子、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子以及細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)因子的母液,其中胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白的母液濃度均為15mg/ml,表皮生長(zhǎng)因子egf、胰島素生長(zhǎng)因子igf-i、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子tgfβ、bpe和貼壁因子纖連蛋白的母液濃度均為20mg/ml,細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)因子維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632和cacl2的母液濃度為10mm;

(2)將f12/dmem(1:3)粉末培養(yǎng)基倒入裝有800ml去離子水的2l燒杯中,然后將燒杯置于攪拌機(jī)上,攪拌2h待溶解后,用0.22μm的過濾器過濾除菌,得基礎(chǔ)培養(yǎng)液;

(3)在超凈工作臺(tái)中向上述步驟2所得基礎(chǔ)培養(yǎng)液中依次添加步驟1所得必需補(bǔ)充因子、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子以及細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)因子的母液,使得胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為10μg/ml;表皮生長(zhǎng)因子egf、胰島素生長(zhǎng)因子igf-i、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子tgfβ、bpe和貼壁因子纖連蛋白的濃度為20ng/ml;維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632的濃度為2.5μm,攪拌均勻;

(4)再添加濃度為1μm的cacl2,攪拌均勻;

(5)最后,在超凈臺(tái)中添加濃度為2%的胎牛血清,密封好后放置于4℃冰箱中備用。

示例性的,在第二種可能的實(shí)現(xiàn)方式中,本發(fā)明實(shí)施例提供的含血清的口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液可以包括:

以k-sfm作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液配制1l含血清的口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液,具體步驟如下:

(1)在超凈工作臺(tái)中用無菌去離子水配制必需補(bǔ)充因子、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子以及細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)因子的母液,其中胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白的母液濃度均為15mg/ml,表皮生長(zhǎng)因子egf、胰島素生長(zhǎng)因子igf-i、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子tgfβ、bpe和貼壁因子纖連蛋白的母液濃度均為20mg/ml,細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)因子維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632和cacl2的母液濃度為10mm;

(2)將k-sfm粉末培養(yǎng)基倒入裝有800ml去離子水的2l燒杯中,然后將燒杯置于攪拌機(jī)上,攪拌2h待溶解后,用0.22μm的過濾器過濾除菌,得基礎(chǔ)培養(yǎng)液;

(3)在超凈工作臺(tái)中向上述步驟2所得基礎(chǔ)培養(yǎng)液中依次添加步驟1所得必需補(bǔ)充因子、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子以及細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)因子的母液,使得胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為5μg/ml;表皮生長(zhǎng)因子egf、胰島素生長(zhǎng)因子igf-i、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子tgfβ、bpe和貼壁因子纖連蛋白的濃度為12ng/ml;維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632的濃度為1μm,攪拌均勻;

(4)再添加濃度為5μm的cacl2,攪拌均勻;

(5)最后,在超凈臺(tái)中添加濃度為5%的胎牛血清,密封好后放置于4℃冰箱中備用。

示例性的,在第三種可能的實(shí)現(xiàn)方式中,本發(fā)明實(shí)施例提供的含血清的口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液可以包括:

以mcdb153作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液配制1l含血清的口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液,具體步驟如下:

(1)在超凈工作臺(tái)中用無菌去離子水配制必需補(bǔ)充因子、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子以及細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)因子的母液,其中胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白的母液濃度均為15mg/ml,表皮生長(zhǎng)因子egf、胰島素生長(zhǎng)因子igf-i、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子tgfβ、bpe和貼壁因子纖連蛋白的母液濃度均為20mg/ml,細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)因子維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632和cacl2的母液濃度為10mm;

(2)將mcdb153粉末培養(yǎng)基倒入裝有800ml去離子水的2l燒杯中,然后將燒杯置于攪拌機(jī)上,攪拌2h待溶解后,用0.22μm的過濾器過濾除菌,得基礎(chǔ)培養(yǎng)液;

(3)在超凈工作臺(tái)中向上述步驟2所得基礎(chǔ)培養(yǎng)液中依次添加步驟1所得必需補(bǔ)充因子、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子以及細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)因子的母液,使得胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為15μg/ml;表皮生長(zhǎng)因子egf、胰島素生長(zhǎng)因子igf-i、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子tgfβ、bpe和貼壁因子纖連蛋白的濃度為5ng/ml;維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632的濃度為5μm,攪拌均勻;

(4)再添加濃度為2μm的cacl2,攪拌均勻;

(5)最后,在超凈臺(tái)中添加濃度為0.5%的胎牛血清,密封好后放置于4℃冰箱中備用。

實(shí)施例2

采用無血清培養(yǎng)基mcdb153、含10%血清的培養(yǎng)體系和本發(fā)明實(shí)施例提供的含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)口腔黏膜上皮細(xì)胞,p6代口腔黏膜上皮細(xì)胞增殖曲線的比較研究:

實(shí)驗(yàn)操作方法:

取生長(zhǎng)狀況良好的p6代口腔黏膜上皮細(xì)胞,待口腔黏膜上皮細(xì)胞為80%~90%融合時(shí),pbs清洗細(xì)胞,用胰蛋白酶37℃消化約2min,終止消化,然后平均分裝到兩個(gè)離心管中離心。分別采用本發(fā)明實(shí)施例提供的培養(yǎng)液、含10%血清的培養(yǎng)體系和無血清培養(yǎng)基mcdb153重懸細(xì)胞,并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),按照3e4的細(xì)胞量接種于24孔板,然后將孔板置于37℃5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔24h計(jì)數(shù)一次,連續(xù)計(jì)數(shù)5天,根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,采用本發(fā)明實(shí)施例提供的培養(yǎng)液培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線接近于含10%血清的培養(yǎng)體系培養(yǎng)的細(xì)胞的增殖曲線,在接種第1d為細(xì)胞潛伏適應(yīng)期,第2d開始生長(zhǎng)曲線開始上升,第2~4d生長(zhǎng)曲線基本為線性曲線,表明這段時(shí)間是細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。第5d后曲線逐漸變得平緩,細(xì)胞增殖明顯減慢,進(jìn)入平臺(tái)期,細(xì)胞生長(zhǎng)曲線近似“s”形。無血清培養(yǎng)基mcdb153體系下培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細(xì)胞在接種1d也為細(xì)胞潛伏適應(yīng)期,第2天開始生長(zhǎng)曲線開始上升,但上升速度明顯落后于本發(fā)明實(shí)施例提供的培養(yǎng)液(附圖1)。

實(shí)施例3

采用無血清培養(yǎng)基mcdb153、含10%胎牛血清的f12/dmem(1:3)培養(yǎng)基體系和本發(fā)明實(shí)施例提供的培養(yǎng)液培養(yǎng)原代口腔黏膜上皮細(xì)胞,細(xì)胞增殖分化相關(guān)蛋白含量變化的比較研究:實(shí)驗(yàn)操作方法:

無菌條件下切取出生后1d的昆明小鼠口腔黏膜,修剪去除黏膜下組織并剪成約1mm×1mm大小的組織塊,用含雙抗的pbs沖洗3~4次。將標(biāo)本放入4mg/mldispaseⅱ中,37℃消化約15min,然后分離上皮層。pbs輕輕沖洗上皮層后,置于0.25%胰蛋白酶中,37℃消化約10min,終止消化,吹打成單細(xì)胞懸液,離心棄掉上清后,分別接種于三種不同培養(yǎng)基體系的25ml培養(yǎng)瓶中,其中三種不同培養(yǎng)基體系分別為含10%胎牛血清的f12/dmem(1:3)培養(yǎng)基體系、無血清的mcdb153培養(yǎng)基體系和本發(fā)明實(shí)施例提供的的培養(yǎng)體系,然后置于37℃,5%co2培養(yǎng)箱培養(yǎng),每2d更換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)至第7天時(shí),對(duì)細(xì)胞分化標(biāo)志物profilaggrin、細(xì)胞非角化蛋白k13和k19以及細(xì)胞增殖標(biāo)志物ki67等蛋白的mrna含量進(jìn)行分析。

結(jié)果顯示,與無血清培養(yǎng)基mcdb153相比,采用本發(fā)明實(shí)施例提供的培養(yǎng)液培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細(xì)胞,其細(xì)胞增殖標(biāo)志物ki67的mrna水平顯著性升高;與含10%血清的培養(yǎng)體系相比,采用本發(fā)明實(shí)施例提供的的培養(yǎng)液下的細(xì)胞分化標(biāo)志物profilaggrinmrna水平顯著性降低,而細(xì)胞非角化蛋白k13和k19的mrna水平顯著性升高,同時(shí)細(xì)胞增殖的標(biāo)志物ki67的mrna水平也有一定程度的升高,但沒有顯著性差異,主要原因是高濃度血清體系下,細(xì)胞的過度分化抑制了細(xì)胞的增殖(附圖2)。

實(shí)施例4

采用無血清培養(yǎng)基mcdb153和本發(fā)明實(shí)施例提供的培養(yǎng)液培養(yǎng)的p5代口腔黏膜上皮細(xì)胞用于構(gòu)建角膜樣模型的比較研究:

復(fù)蘇p4代口腔黏膜上皮細(xì)胞,然后分別用本發(fā)明實(shí)施例提供的培養(yǎng)液和無血清培養(yǎng)基mcdb153培養(yǎng)擴(kuò)增口腔黏膜上皮細(xì)胞,待口腔黏膜上皮細(xì)胞為80%~90%融合時(shí),pbs清洗細(xì)胞,用胰蛋白酶37℃消化約2min,終止消化,離心棄掉上清液,然后采用培養(yǎng)液sk1重懸口腔黏膜上皮細(xì)胞,接種于細(xì)胞小室中液下培養(yǎng),接種密度為0.2×105~0.5×105個(gè)/cm2,在5%co2、36~37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24~48小時(shí)。

培養(yǎng)2~3d后,更換成構(gòu)建培養(yǎng)液sk2,并進(jìn)行氣液面培養(yǎng),將細(xì)胞小室內(nèi)的培養(yǎng)液吸去,保持構(gòu)建模型表面的干燥,隨后在4.5%~5.5%co2、37±1℃的孵箱中培養(yǎng)2~3d,每天換液一次;

再培養(yǎng)2~3d后,更換成構(gòu)建培養(yǎng)液sk3,并進(jìn)行氣液面培養(yǎng),在4.5%~5.5%co2、37±1℃的孵箱中培養(yǎng)2~3d,每天換液一次,得到體外重組角膜樣模型。

圖3(a)為本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細(xì)胞構(gòu)建的角膜樣模型的組織學(xué)染色圖片;圖3(b)為mcdb153培養(yǎng)基培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細(xì)胞構(gòu)建的角膜樣模型的組織學(xué)染色圖片。結(jié)果顯示,用無血清培養(yǎng)基mcdb153體系擴(kuò)增的口腔黏膜上皮細(xì)胞構(gòu)建的角膜樣模型出現(xiàn)空洞現(xiàn)象,主要原因是口腔黏膜細(xì)胞失去干細(xì)胞特性,細(xì)胞老化導(dǎo)致的,而相比之下,采用用本發(fā)明實(shí)施例提供的培養(yǎng)液擴(kuò)增的口腔黏膜上皮細(xì)胞構(gòu)建的角膜樣模型生長(zhǎng)分化良好,沒有空洞現(xiàn)象(附圖3)。

本發(fā)明實(shí)施例提供一種含血清的口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液,包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液、血清、必需補(bǔ)充因子、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子以及細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)因子。針對(duì)含10%血清的無滋養(yǎng)層培養(yǎng)方法培養(yǎng)口腔黏膜上皮細(xì)胞時(shí),最多可傳代兩代并復(fù)層化的問題,以及無血清培養(yǎng)體系下,口腔黏膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、原有的干細(xì)胞特性下降、容易出現(xiàn)老化現(xiàn)象、很難大量擴(kuò)增等一系列問題,本發(fā)明實(shí)施例提供的一種含血清的口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液,既能夠滿足細(xì)胞增殖又不影響細(xì)胞分化,增加細(xì)胞的傳代代次,使得口腔黏膜上皮細(xì)胞的大量擴(kuò)增,以滿足臨床和組織工程構(gòu)建的需求。

以上所述,僅為本申請(qǐng)的具體實(shí)施方式,但本申請(qǐng)的保護(hù)范圍并不局限于此,任何在本申請(qǐng)揭露的技術(shù)范圍內(nèi)的變化或替換,都應(yīng)涵蓋在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此,本申請(qǐng)的保護(hù)范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。

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