專利名稱：熱休克蛋白27在制備血清學(xué)判別、診斷肝癌藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種熱休克蛋白27的醫(yī)用用途，具體涉及熱休克蛋白27在制備血清學(xué)判別、診斷肝癌藥物中的用途。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是一種多基因參與的復(fù)雜疾病。其基因表達(dá)分析涉及轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組學(xué)方法。由于蛋白質(zhì)的表達(dá)或功能從轉(zhuǎn)錄到翻譯間有多點(diǎn)調(diào)控，轉(zhuǎn)錄的mRNA豐度與翻譯的蛋白質(zhì)數(shù)量間相關(guān)不明顯，因此用蛋白質(zhì)組學(xué)方法從整體上研究腫瘤地發(fā)病機(jī)制，尋找腫瘤診斷和預(yù)后地特異性標(biāo)記以及藥物治療的靶標(biāo)已成為近期研究的熱點(diǎn)(Lancet Oncol，2001，2(11)698-704；BMJ.2000，320424-7)。
腫瘤標(biāo)志物通常是指腫瘤組織自身特有的可反映腫瘤存在和生長(zhǎng)的物質(zhì)，可在腫瘤患者組織、體液和排泄物中檢出?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志物包括腫瘤特異性抗原及相關(guān)抗原、激素類受體、酶類、癌基因、抗癌基因及其產(chǎn)物等。理想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)具備1)唯腫瘤細(xì)胞所特有，不存在于正?；蚍前┙M織中；2)與腫瘤的大小、分期及治療預(yù)后和轉(zhuǎn)歸有關(guān)；3)可采用高靈敏的方法可定性或定量地檢測(cè)。
肝癌已成為目前我國(guó)癌癥病人死亡第二位的原因，全世界45％的原發(fā)性肝癌發(fā)生在我國(guó)。目前仍以外科手術(shù)為首選和主要治療方案。術(shù)后總體5年生存率只有62.9％，大肝癌術(shù)后5年生存率僅為34.6％。目前臨床主要依靠定期復(fù)查AFP、異常凝血酶原、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和B超，加上CT等高分辨的影像學(xué)診斷。由于AFP的診斷陽(yáng)性率僅為56％，故AFP異質(zhì)體、血清AFP mRNA、異常凝血酶原、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶均用于肝癌診斷的補(bǔ)充，同時(shí)涉及胃腸道腫瘤的相關(guān)抗原，如CEA、CA199的輔助診斷。近來(lái)的研究顯示，血清CK19、ICAM、E-selectin，VAGF等亦可用于AFP陰性病人的鑒別診斷。發(fā)現(xiàn)具有預(yù)測(cè)、診斷價(jià)值的新型原發(fā)性肝癌標(biāo)志物的研究十分必要。
HCC常表現(xiàn)為早期的血管侵犯，包膜侵犯和肝內(nèi)、肝外的轉(zhuǎn)移。盡管采取了免疫治療、預(yù)防性TAE、中藥治療等手段來(lái)預(yù)防肝癌切除術(shù)后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，但總體術(shù)后5年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)61.5％，即使是小肝癌術(shù)后5年復(fù)發(fā)率也高達(dá)45.5％。目前臨床主要依靠定期復(fù)查AFP、異常凝血酶原、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和B超來(lái)發(fā)現(xiàn)術(shù)后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，但應(yīng)用于肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)和判斷仍有相當(dāng)?shù)睦щy。判斷腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性和早期診斷轉(zhuǎn)移的發(fā)生，并采取有效的手段預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生，誘發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移休眠狀態(tài)或延遲轉(zhuǎn)移的發(fā)生，成為當(dāng)前肝癌研究的主要課題之一。
蛋白質(zhì)組學(xué)研究涉及蛋白質(zhì)表達(dá)模式研究和進(jìn)一步的功能研究，目前以前者研究較為集中。高通量的蛋白質(zhì)表達(dá)研究技術(shù)主要有蛋白質(zhì)的分離、鑒定技術(shù)和生物信息學(xué)。蛋白質(zhì)的鑒定技術(shù)主要為質(zhì)譜法(MS)，即利用樣品離子化后，離子間的質(zhì)荷比(m/z)的差異來(lái)分析確定樣品的分子質(zhì)量。常用的有兩種，即電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)和基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)。生物技術(shù)的發(fā)展對(duì)新的腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)起了非常的作用，2D電泳結(jié)合MS、高壓液相分析(HPLC)、表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)，LC-MS-MS等技術(shù)使人們可以從蛋白質(zhì)水平分析潛在的腫瘤標(biāo)志物，從而使新標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提升到一個(gè)更高的水平(DDT 2003，8(10)4411-44316；Lancet，2002，359(16)572-577；.Proteomics，2001，1，1205-1215)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的的目的是提供一種熱休克蛋白27的醫(yī)用用途，具體涉及熱休克蛋白27在制備血清學(xué)判別、診斷肝癌藥物中的用途。
本發(fā)明涉及的熱休克蛋白27(Heat shock protein 27)簡(jiǎn)稱HSP27(王萬(wàn)銀HSP27研究現(xiàn)狀.國(guó)外醫(yī)學(xué)生理病理科學(xué)與臨床分冊(cè).2001，21467-469；KingKL，Li AF，Chau GY，et al.Prognostic significance of heat shock protein-27expression in hepatocellular carcinoma and its relation to histologic grading andsurvival.Cancer，2000，88(11)2464-2470)。
本發(fā)明應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對(duì)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，比較研究了不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌裸鼠模型LCID20和LCID35的全蛋白表達(dá)譜，結(jié)果表明HSP27高表達(dá)；免疫組織化學(xué)檢測(cè)有轉(zhuǎn)移的和未發(fā)生轉(zhuǎn)移的HCC組織蛋白，結(jié)果顯示HSP27定位于肝細(xì)胞胞漿內(nèi)，驗(yàn)證了其表達(dá)水平的高低與肝癌轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)；血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在存在的差異性蛋白質(zhì)中，HSP27為肝癌特有；血清的WesternBlot鑒定結(jié)果顯示HCC病人血清有較強(qiáng)的HSP27(100％，20/20)；血清雙盲法驗(yàn)證，正常人血清不顯示HSP27(0/10)，HCC患者陽(yáng)性率為100％(30/30)。
結(jié)果證實(shí)，血清HSP27蛋白可以成為一種潛在的、有應(yīng)用價(jià)值的測(cè)定肝癌及其轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物蛋白?？捎糜谥苽浒ˋFP陰性HCC及其轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)和診斷藥物。


圖1是非轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移HCC組織2-DE銀染圖，其中，N非轉(zhuǎn)移HCC組織；M轉(zhuǎn)移HCC組織(以下同)。
圖2是HSP27在6對(duì)N、M組織中的表達(dá)差異，圖3是HSP27在非轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移HCC組織中的免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果(SP×400)，細(xì)胞核染成藍(lán)色，N2和N3胞漿呈現(xiàn)淡棕黃色，M2和M3為棕褐色。
圖4是Western blot分析檢測(cè)HSP27的表達(dá)差異。
圖5是RT-PCR檢測(cè)HSP27在非轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移HCC組織中的表達(dá)，其中A6對(duì)N、M組織HSP27的RT-PCR結(jié)果，L，100bp DNA ladder；HSP27片段長(zhǎng)576bp，GAPDH長(zhǎng)251bp；B以GAPDH為內(nèi)參，6對(duì)N、M組織的HSP27相對(duì)表達(dá)量比較。
圖6是血清蛋白質(zhì)的2DE圖譜(A血清B去白蛋白和球蛋白的血清)。
圖7是部分差異蛋白質(zhì)的2DE局部放大圖。
圖8是差異性蛋白質(zhì)在正常血清、HBV患者和HCC患者血清中相對(duì)含量，其中*p＜0.05 #p＜0.01。
圖9是60例血清的Western Blot鑒定結(jié)果(顯示HSP27)，其中，A、B行正常人血清，未顯示HSP27；C、D行HBV患者血清(僅1例顯示HSP27)E、F行HCC患者血清(全部顯示HSP27)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
采用本領(lǐng)域常規(guī)方法，比較研究了不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌裸鼠模型LCID20和LCID35的全蛋白表達(dá)譜2D電泳圖譜顯示的蛋白質(zhì)數(shù)目高達(dá)2500-3000個(gè)，進(jìn)行了差異蛋白的分析和驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)HSP27高表達(dá)。
實(shí)施例2應(yīng)用雙向凝膠電泳(2-DE)對(duì)6例臨床和病理上均有轉(zhuǎn)移的HCC組織和6例未發(fā)生轉(zhuǎn)移的HCC組織蛋白進(jìn)行分離，用Image Master軟件匹配分析兩組2-DE圖譜間異同性，尋找在3對(duì)及3對(duì)以上存在的差異蛋白點(diǎn)，應(yīng)用MALDI-TOF-MS和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定出差異顯著的16個(gè)蛋白點(diǎn)。結(jié)果顯示這些蛋白為S100鈣結(jié)合蛋白(S100)、27KDa熱休克蛋白(HSP27)、角蛋白18(CK18)等，分別與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，能量代謝等有關(guān)。對(duì)在6例轉(zhuǎn)移性HCC組織中表達(dá)均顯著高于6例非轉(zhuǎn)移HCC組織的HSP27，應(yīng)用western blotting分析進(jìn)一步驗(yàn)證了2-DE結(jié)果，RT-PCR檢測(cè)的兩組間mRNA水平也存在差異，但不顯著，免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示HSP27定位于肝細(xì)胞胞漿內(nèi)(圖1、2、3)。驗(yàn)證了HSP27的表達(dá)增高主要在蛋白質(zhì)表達(dá)水平，而并非mRNA轉(zhuǎn)錄水平。其表達(dá)水平的高低與肝癌轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)(圖4、圖5)實(shí)施例3進(jìn)行血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究，在清除了高豐度的白蛋白和球蛋白后的血清蛋白的2DE圖譜上，采用二維電泳結(jié)合Maldi-TOF-MS方法比較研究正常人、HBV病人和肝癌病人的蛋白質(zhì)的差異性表達(dá)，發(fā)現(xiàn)至少8種差異性蛋白質(zhì)，Transferrin(轉(zhuǎn)鐵蛋白，TF)，Transthyretin(TTR)，α1-antitrypsin(抗胰蛋白酶α1)，Clusterin(CLU)，Haptoglobinchain(肝球蛋白α2鏈，HP)，Ceruloplasmin(CP)，Heat shockprotein 27(熱休克蛋白27，HSP27)，alpha-fetoprotein(甲胎蛋白)；半定量發(fā)現(xiàn)HSP27為肝癌特有。
對(duì)60例血清的Western Blot鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常人血清未發(fā)現(xiàn)HSP27(0/20)，HBV患者中僅1例發(fā)現(xiàn)HSP27(95％，1/20)；20例HCC病人血清全部有較強(qiáng)的HSP27(100％，20/20)。提示HSP27可用于HCC的診斷。
對(duì)80例血清進(jìn)行雙盲法驗(yàn)證，結(jié)果顯示，正常人血清不顯示HSP27(0/10)，HBV患者為95％不顯示(38/40)，假陽(yáng)性率為5％(2/40)；HCC患者陽(yáng)性率為100％(30/30)。
表1是差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)。
表1

權(quán)利要求
1.熱休克蛋白27在制備血清學(xué)判別肝癌藥物中的用途。
2.熱休克蛋白27在制備血清學(xué)診斷肝癌藥物中的用途。
3.熱休克蛋白27在制備血清學(xué)預(yù)測(cè)肝癌轉(zhuǎn)移藥物中的用途。
4.熱休克蛋白27在制備血清學(xué)診斷AFP陰性肝癌藥物中的用途。
5.熱休克蛋白27在制備血清學(xué)診斷AFP陰性肝癌轉(zhuǎn)移藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種熱休克蛋白27的醫(yī)用用途，本發(fā)明應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對(duì)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明HSP27高表達(dá)；免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示HSP27定位于肝細(xì)胞胞漿內(nèi)，驗(yàn)證了其表達(dá)水平的高低與肝癌轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)；血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在差異性蛋白質(zhì)中，HSP27為肝癌特有；血清的Western Blot鑒定結(jié)果顯示HCC病人血清有較強(qiáng)的HSP27(100％，20/20)；血清雙盲法驗(yàn)證，正常人血清不顯示HSP27(0/10)，HCC患者陽(yáng)性率為100％(30/30)。結(jié)果證實(shí)，血清HSP27蛋白可成為有應(yīng)用價(jià)值的測(cè)定肝癌及其轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物蛋白。可用于制備包括AFP陰性HCC及其轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)和診斷藥物。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1851461SQ200510025340
公開日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2005年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月22日
發(fā)明者劉銀坤, 馮鉅濤, 崔杰鋒, 宋海燕, 湯釗猷, 楊芃原 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院