本發(fā)明屬于分子檢測領(lǐng)域，涉及一種精確定量hivdna的檢測試劑盒，具體涉及一種聯(lián)合多種pcr方法精準(zhǔn)定量hivdna檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：目前art治療可以將hivrna降低到檢測不到的水平，由于hiv病毒儲存庫的存在，使得art治療不能停藥，hiv病毒儲存庫主要以hivdna的形式存在，以hivdna形式存在的病毒儲存庫成為hiv根治的障礙。研究表明hivdna水平與停藥后病毒反彈時間密切相關(guān)。hivdna水平越低，停藥后病毒反彈時間越長。因此對hivdna的精確定量非常重要。由于hivdna的量非常低，對其精確定量非常困難。目前對hivdna定量的pcr方法主要有實時定量pcr技術(shù)及digitalpcr技術(shù)。目前所有這些技術(shù)均使用通用引物，由于hiv變異度非常高，hiv的亞型也非常多，不同亞型之間的基因差異在30％左右，不同地區(qū)流行的亞型不同，歐美主要流行的是b亞型，我國流行的主要有b’，b’c及ae重組亞型，目前實時定量pcr及digitalpcr所用的通用引物一般對b亞型敏感，定量b亞型相對準(zhǔn)確，而對我國流行的亞型尤其是ae亞型不敏感。與實時定量pcr技術(shù)相比，digitalpcr技術(shù)的優(yōu)點為可以對大量的dna模板進行定量，缺點為每次都需要芯片，價格比較昂貴。另外，巢式pcr因其在第一輪pcr產(chǎn)物內(nèi)部用第二對引物進行擴增，在定性方面，其擴增的特異性和靈敏性都會大大提高，但由于巢式pcr引物是結(jié)合在第一次pcr產(chǎn)物內(nèi)部進行的第二輪擴增，其無法實現(xiàn)精確定量。本申請首次將實時定量pcr、digitalpcr及巢式pcr的技術(shù)結(jié)合，并利用中國艾滋病流行毒株的特點，建立了巢式pcr-實時定量pcr-digitalpcr相結(jié)合精準(zhǔn)定量hivdna的方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種聯(lián)合多種pcr精確定量hivdna的檢測方法，并且根據(jù)該檢測方法開發(fā)了精確定量hivdna的檢測試劑盒。由于hivdna在人體內(nèi)量比較少，hiv變異度特別高，不同亞型之間hiv基因序列的差異非常大。而digitalpcr由于需要特殊的芯片，價格比較貴。通過三種pcr方法的結(jié)合，設(shè)計特異的針對各個亞型的特異引物，達到對hivdna進行精準(zhǔn)定量和節(jié)約成本的目的。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種精確定量hivdna的檢測方法，所述方法包括如下步驟：(1)利用巢式pcr對樣本進行特異性擴增以鑒定hivdna的有無；(2)將巢式pcr陽性樣本進行實時熒光定量pcr以確定hivdna量和亞型；(3)將巢式pcr陽性、實時定量pcr陰性的樣本進行digitalpcr定量hivdna拷貝數(shù)。進一步，所述巢式pcr使用兩組引物進行兩輪pcr，每組引物包括外套和內(nèi)套兩對引物。在具體的實施方案中，第一組引物中，所述外套引物中上游引物的堿基序列如seqidno.1所示，所述外套引物中下游引物的堿基序列如seqidno.2所示，所述內(nèi)套引物中上游引物是seqidno.3所示的引物和seqidno.4所示的引物的混合，所述內(nèi)套引物中下游引物的堿基序列如seqidno.5所示；第二組引物中，所述外套引物中上游引物的堿基序列如seqidno.6所示，所述外套引物中下游引物是seqidno.7所示的引物和seqidno.8所示的引物的混合，所述內(nèi)套引物中上游引物是seqidno.9所示的引物和seqidno.10所示的引物的混合，所述內(nèi)套引物中下游引物的堿基序列如seqidno.11所示。進一步，所述實時熒光定量pcr使用針對hiv不同亞型的dna序列設(shè)計亞型特異性引物。在具體的實施方案中，針對hiv的ae亞型設(shè)計的引物序列為：上游引物序列如seqidno.17所示，下游引物序列如seqidno.18所示；針對hiv的bc亞型設(shè)計的引物序列為：上游引物是seqidno.19所示的引物和seqidno.20所示的引物的混合，下游引物序列如seqidno.21所示；針對hiv的b亞型設(shè)計的引物序列為：上游引物序列如seqidno.22所示，下游引物是seqidno.23所示的引物和seqidno.24所示的引物的混合。進一步，所述digitalpcr使用hivdna的通用擴增引物。在具體的實施方案中，上游引物序列如seqidno.15所示，下游引物序列如seqidno.16所示。優(yōu)選地，所述樣本是血液。本發(fā)明還提供了一種精確定量hivdna的檢測試劑盒，所述試劑盒包括巢式pcr所需的試劑、和/或?qū)崟r熒光定量pcr所需的試劑、和/或digitalpcr所需的試劑。進一步，巢式pcr所需的試劑包括進行兩輪pcr使用的兩組引物，每組引物包括外套和內(nèi)套兩對引物。第一組引物中，所述外套引物中上游引物的堿基序列如seqidno.1所示，所述外套引物中下游引物的堿基序列如seqidno.2所示，所述內(nèi)套引物中上游引物是seqidno.3所示的引物和seqidno.4所示的引物的混合，所述內(nèi)套引物中下游引物的堿基序列如seqidno.5所示；第二組引物中，所述外套引物中上游引物的堿基序列如seqidno.6所示，所述外套引物中下游引物是seqidno.7所示的引物和seqidno.8所示的引物的混合，所述內(nèi)套引物中上游引物是seqidno.9所示的引物和seqidno.10所示的引物的混合，所述內(nèi)套引物中下游引物的堿基序列如seqidno.11所示；所述實時熒光定量pcr所需的試劑包括針對hiv不同亞型的dna序列設(shè)計的亞型特異性引物，其中，針對hiv的ae亞型設(shè)計的引物序列為：上游引物序列如seqidno.17所示，下游引物序列如seqidno.18所示；針對hiv的bc亞型設(shè)計的引物序列為：上游引物是seqidno.19所示的引物和seqidno.20所示的引物的混合，下游引物序列如seqidno.21所示；針對hiv的b亞型設(shè)計的引物序列為：上游引物序列如seqidno.22所示，下游引物是seqidno.23所示的引物和seqidno.24所示的引物的混合；所述digitalpcr所需的試劑包括hivdna的通用擴增引物，其中，上游引物序列如seqidno.15所示，下游引物序列如seqidno.16所示。進一步，所述試劑盒還包括pcr反應(yīng)液、dntps、mgcl2、taqdna聚合酶。進一步，所述試劑盒還包括樣本dna提取液、和/或陽性對照品、和/或陰性對照品。本發(fā)明還提供了針對hiv不同亞型的dna序列設(shè)計的亞型特異性引物在制備hivdna精確定量檢測試劑中的用途。在具體的實施方案中，所述針對hiv不同亞型的dna序列設(shè)計的亞型特異性引物包括：針對hiv的ae亞型設(shè)計的引物序列為：上游引物序列如seqidno.17所示，下游引物序列如seqidno.18所示；針對hiv的bc亞型設(shè)計的引物序列為：上游引物是seqidno.19所示的引物和seqidno.20所示的引物的混合，下游引物序列如seqidno.21所示；針對hiv的b亞型設(shè)計的引物序列為：上游引物序列如seqidno.22所示，下游引物是seqidno.23所示的引物和seqidno.24所示的引物的混合。本發(fā)明根據(jù)hiv病毒基因序列設(shè)計2對特異性引物(外套引物1對、內(nèi)套引物1對)，經(jīng)過大量篩選實驗，優(yōu)化確定了最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，實現(xiàn)了對hiv病毒的快速、準(zhǔn)確、靈敏檢測。較之現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明所提供的巢式pcr檢測試劑盒及其檢測方法有益效果在于：(1)特異性強：由于使用內(nèi)外2對特異性引物，大大提高了pcr擴增的特異性，有效避免了非目的片段的擴增；(2)靈敏度高：與普通pcr相比，本發(fā)明經(jīng)過2輪pcr反應(yīng)，檢測靈敏度得到了顯著提高，這對于hiv病毒含量低的樣本檢測具有極其重要的意義；(3)檢測用時短：本發(fā)明檢測時間快，能夠克服電鏡觀察和血清學(xué)檢測方法存在的不足，實現(xiàn)對hiv病毒的快速、準(zhǔn)確和高效檢測。實時熒光定量pcr檢測技術(shù)與目前已報道的其它檢測技術(shù)相比，該技術(shù)具有巨大的優(yōu)越性，主要體現(xiàn)在：(1)通過熒光信號，能實時觀察pcr過程中待檢測樣品模板dna(或cdna)擴增情況，無需進行染色、電泳和紫外檢測，大大簡化了檢測程序并縮短檢測時間；(2)采用熒光信號放大功能，其檢測的靈敏度得到了大大提高；(3)全封閉的操作系統(tǒng)，減少了pcr產(chǎn)物對試驗室環(huán)境的染污和樣品間的交叉染污，有效降低和避免了假陽性結(jié)果。但是一般國內(nèi)外建立的用于檢測hiv病毒的實時定量pcr技術(shù)都使用的通用引物，由于hiv的變異度非常高，這些通用引物對不同亞型的敏感度是不同的，一般檢測的結(jié)果對以前流行的b亞型和bc重組亞型比較敏感，而對ae亞型不敏感。為此，本申請針對不同亞型的hiv設(shè)計了亞型特異性引物，使得實時熒光pcr檢測技術(shù)更加靈敏的區(qū)別不同亞型的hiv。與實時熒光定量pcr擴增相比，digitalpcr利用芯片技術(shù)可以對大量的dna進行定量，提高了定量的準(zhǔn)確度。因此本申請利用digitalpcr的方法，精確定量hivdna拷貝數(shù)。本發(fā)明的創(chuàng)新點在于：首次將巢式pcr、實時熒光定量pcr和digitalpcr聯(lián)合應(yīng)用以精確定量hivdna。巢式pcr在樣本中hivdna含量極低的情況下即可確定hivdna的有無。實時熒光定量pcr對含有hivdna的樣本進行亞型的確定，同時初算特定細(xì)胞群體中hivdna的總量。digitalpcr在實時熒光定量pcr無法精確定量的情況下，可以對大量的dna進行精確定量，確定hivdna拷貝數(shù)，最終實現(xiàn)精準(zhǔn)定量hivdna的目的。附圖說明圖1顯示hivdna標(biāo)準(zhǔn)品巢式pcr的電泳圖；圖2顯示利用實時定量pcr擴增ccr5得到細(xì)胞數(shù)的擴增反應(yīng)圖；圖3顯示利用實時定量pcr擴增hivdna標(biāo)準(zhǔn)品的擴增反應(yīng)圖；圖4顯示利用digitalpcr對hivdna標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)檢測圖；圖5顯示hiv感染者臨床樣本中hivdna巢式pcr的電泳圖，其中，a代表編號為1-7的hiv感染者臨床樣本的電泳圖；b代表編號為8-14的hiv感染者臨床樣本的電泳圖；c代表編號為15-20的hiv感染者臨床樣本的電泳圖；圖6顯示hiv感染者臨床樣本中hivdna的實時定量pcr擴增反應(yīng)圖；圖7顯示實時定量pcr的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖8顯示digitalpcr對hiv感染者臨床樣本的hivdna拷貝數(shù)檢測圖，其中，a：編號為3的hiv感染者臨床樣本；b：編號為9的hiv感染者臨床樣本；c：編號為4的hiv感染者臨床樣本；d：編號為15的hiv感染者臨床樣本；e：編號為17的hiv感染者臨床樣本；f：編號為18的hiv感染者臨床樣本；g：編號為16的hiv感染者臨床樣本；h：正常對照。具體實施方式實施例1巢式pcr方法的建立1、dna制備將標(biāo)準(zhǔn)品細(xì)胞系-jurket細(xì)胞系按照106、105、104、103、102倍比稀釋后，提取dna，最后一步收集dna時用60μl的體系來溶解，1μl中含hivdna拷貝數(shù)分別為17000、1700、170、17、1.7作為標(biāo)準(zhǔn)品；2、pcr擴增2.1引物設(shè)計在巢式pcr中，共設(shè)計a、b兩組引物(如表1)，每組由outer(外套)和inner(內(nèi)套)兩對引物組成，目的是提高實驗的靈敏度和特異性，引物終濃度為0.4μmol/l。表1巢式pcr引物序列2.2反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按照表2配制反應(yīng)體系根據(jù)表3和表4中的反應(yīng)條件(均為30個循環(huán))進行兩輪pcr，驗證標(biāo)準(zhǔn)品中hivdna的存在。表2巢式pcr反應(yīng)體系單位(微升)第一輪第二輪2*mix12.512.5a組引物outera上游0.5innera上游0.5outera下游0.5innera下游0.5b組引物outerb上游0.5innerb上游0.5outerb下游0.5innerb下游0.5h2o9.59.5模板11總量2525表3巢式pcr第一輪反應(yīng)條件第一輪預(yù)變性變性復(fù)性延伸后延伸溫度94℃94℃52℃72℃72℃時間2min30s30s90s5min表4巢式pcr第二輪反應(yīng)條件第一輪預(yù)變性變性復(fù)性延伸后延伸溫度94℃94℃52℃72℃72℃時間3min30s30s30s5min3、實驗結(jié)果如圖1所示，巢式pcr產(chǎn)物進行3％的瓊脂糖凝膠電泳，在122bp和264bp兩個目標(biāo)條帶中的任何一個出現(xiàn)陽性，結(jié)果則判斷為陽性，否則判斷為陰性。其中，圖1中1泳道為空白對照，2泳道為陰性對照，3泳道為含hivdna1.7個拷貝的標(biāo)準(zhǔn)品，4泳道為含hivdna17個拷貝的標(biāo)準(zhǔn)品，5泳道為含hivdna170個拷貝的標(biāo)準(zhǔn)品，6泳道為含hivdna1700個拷貝的標(biāo)準(zhǔn)品，7泳道為含hivdna17000個拷貝的標(biāo)準(zhǔn)品。實施例2實時熒光定量pcr方法的建立1、dna制備同實施例12、引物和探針設(shè)計設(shè)計p1-p5共五對引物，分別對應(yīng)hivdna、ccr5及ae、bc、b三個hiv亞型(如表5)。利用每個細(xì)胞含有兩個拷貝的ccr5的特點，通過擴增ccr5定量細(xì)胞數(shù)量，從而計算出每106個細(xì)胞中平均所含hivdna的量。表5實時熒光定量pcr引物及探針序列備注：①p5上游引物與p2上游引物相同②108探針使用fam熒光，136探針使用vic熒光③p1引物使用136探針，p2、p3、p4、p5引物均使用108探針④136探針下劃線部分為發(fā)卡結(jié)構(gòu)。3、進行實時熒光定量pcr檢測根據(jù)表6配制反應(yīng)體系，利用表7中的反應(yīng)條件(40個循環(huán))進行hivdna及細(xì)胞數(shù)量的pcr擴增，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線ct值算出hivdna/106的拷貝數(shù)。表6實時熒光定量pcr體系單位(微升)p3p4p5p12*mix12.512.512.512.5上游引物0.50.50.50.5下游引物0.50.50.50.5探針0.1250.1250.1250.125h2o10.37510.37510.37510.375模板1111總量25252525表7實時熒光定量pcr反應(yīng)條件預(yù)變性變性復(fù)性&延伸溫度95℃95℃60℃時間10min15s1min4、實驗結(jié)果(1)實時定量pcr擴增標(biāo)準(zhǔn)品細(xì)胞數(shù)量的結(jié)果經(jīng)過40輪循環(huán)后，1微升中含hivdna拷貝數(shù)分別為17000、1700、170、17、1.7的標(biāo)準(zhǔn)品通過擴增ccr5得到細(xì)胞數(shù)的pcr擴增反應(yīng)如圖2所示。(2)實時定量pcr擴增標(biāo)準(zhǔn)品hivdna的結(jié)果經(jīng)過40輪循環(huán)后，1微升中含hivdna拷貝數(shù)分別為17000、1700、170、17、1.7的標(biāo)準(zhǔn)品擴增hivdna的pcr擴增反應(yīng)如圖3所示。(3)利用實時定量pcr計算標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品計算的拷貝數(shù)如表8所示，結(jié)果表明實時定量pcr能夠精確計算hivdna的拷貝數(shù)。表8標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)計算標(biāo)本品編號hivdnacopies/μlcells/μlhiv-1dnacopies/106cells11.71.7106copies/106cells21717106copies/106cells3170170106copies/106cells417001700106copies/106cells51700017000106copies/106cells實施例3digital-pcr方法的建立按照表9配制反應(yīng)體系，最后加入25x的穩(wěn)定劑，采用raindance成熟的rainstromtm皮液滴專利技術(shù)進行油滴的制備。完成油滴制備后進行pcr擴增，反應(yīng)條件如表7。pcr擴增后利用儀器檢測熒光計數(shù)。digitalpcr在擴增結(jié)束后對每個反應(yīng)單元的熒光信號進行采集。有熒光信號記為1，無熒光信號記為0。因digitalpcr通過終點檢測計算目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，所以無需采用內(nèi)參和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以進行精確的絕對定量檢測。此外，由于digitalpcr采用終點檢測，因此也不依賴于ct值，所以digitalpcr反而受擴增效率的影響大大降低，對于pcr反應(yīng)抑制物的耐受能力也大大提高，具有很高的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。對于標(biāo)準(zhǔn)品檢測的結(jié)果如圖4所示，檢測的標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的結(jié)果如表10所示。表9digital-pcr反應(yīng)體系單位(微升)p3/p1p4/p1p5/p12*mix757575上游引物3/33/33/3下游引物3/33/33/3探針(fam)0.750.750.75探針(vic)0.750.750.75模板61.561.561.525x穩(wěn)定劑666總量156156156表10digital-pcr擴增后標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)量的計數(shù)標(biāo)本品編號hivdnacopies/反應(yīng)體系cell/反應(yīng)體系hiv-1dnacopies/106cells11111106copies/106cells2394394106copies/106cells343884388106copies/106cells44282842828106copies/106cells5133029133029106copies/106cells實施例4巢式pcr、實時熒光定量pcr、digitalpcr在臨床檢測上的聯(lián)合應(yīng)用1、臨床樣本來源：hiv陰性健康人標(biāo)本3例，因hiv感染治療后，hivdna水平會有不同程度的降低，art治療后的hivdna更難檢測到。本申請入組未治療病人50例及抗病毒治療兩年以上的病人20例。50例沒有治療的病人巢式pcr、實時定量pcr及digitalpcr檢測結(jié)果值均非常高，結(jié)果未在本申請中呈現(xiàn)。對于art治療兩年后的病人，所有病人巢式pcr定量血液中的hivdna均陽性，實時定量pcr對20例病人hivdna進行了定量，其中13例病人通過實時定量pcr得到了hivdna拷貝數(shù)，另外7例病人通過實時定量pcr沒有檢測到(實時定量pcr起跳的循環(huán)數(shù)均高于35個循環(huán))，沒有檢測到的這7例病人進一步通過digitalpcr得到了結(jié)果。所有檢測樣本均來自解放軍302醫(yī)院感染三科采集的edta抗凝血。2、hivdna制備：利用ficoll淋巴細(xì)胞分離液從樣本中分離出pbmc，然后利用qiagen提取試劑盒說明書的方法提取dna。3、巢式pcr對臨床樣本hivdna的檢測方法同實施例1。結(jié)果：通過巢式pcr對20例抗病毒治療兩年以上的hiv感染者外周血樣本進行定性檢測的結(jié)果如圖5所示，所有病人巢式pcr定量血液中的hivdna均陽性。圖5中，hc：正常對照；blank：空白對照；1-20為病人的編號；由于對人的基因組的非特異性擴增其中正常人及病人都會在122和264之間會出現(xiàn)一條非特異性條帶，只有出現(xiàn)122及264的位置出現(xiàn)的條帶認(rèn)為是hiv特異性的。4、實時定量pcr對hiv感染者樣本的擴增使用bio-rad公司的cfx96real-timesystem進行pcr擴增反應(yīng)，步驟同實施例2。結(jié)果：結(jié)果如圖6和圖7所示；圖7中兩條線中上面的為hiv標(biāo)準(zhǔn)曲線，下面的為ccr5標(biāo)準(zhǔn)曲線，×為樣品有ct值起跳，對于樣品有多個亞型結(jié)果的，取ct值最小的為匹配亞型。利用兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線所得ct值計算出檢測樣本hivdna/106的拷貝數(shù)(表11)。通過實時定量pcr對20例病人hivdna進行檢測的結(jié)果。其中13例病人得到了hivdna拷貝數(shù)，7例病人通過實時定量pcr沒有得到結(jié)果，進一步通過digitalpcr進行檢測。表11實時定量pcr對20例病人hivdna拷貝數(shù)的檢測結(jié)果5、digitalpcr對hiv感染者樣本的擴增對于巢式pcr陽性而實時定量pcr陰性的病人樣本，則提取20ml以上全血中pbmc的hivdna，按照表9配制反應(yīng)體系，最后加入25x的穩(wěn)定劑，采用raindance成熟的rainstromtm皮液滴專利技術(shù)進行油滴的制備。完成油滴制備后進行pcr擴增，反應(yīng)條件如表7。digitalpcr在擴增結(jié)束后對每個反應(yīng)單元的熒光信號進行采集。有熒光信號記為1，無熒光信號記為0。digitalpcr對通過實時定量pcr沒有得到結(jié)果的7例病人的檢測結(jié)果如圖8所示，拷貝數(shù)計算結(jié)果如表12所示。表12digitalpcr得到的hivdna拷貝數(shù)病人編號體系中hivdna拷貝數(shù)體系中細(xì)胞數(shù)hivdnacopies/106cells315784013829366412411221535410371705171047167424181143107510463769531816514612684雖然以上僅描述了本發(fā)明的具體實施方式范例，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些僅是舉例說明，本發(fā)明的保護范圍是由所附權(quán)利要求書限定的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的原理和實質(zhì)的前提下，可以對這些實施方式做出多種變更或修改，但這些變更或修改均落入本發(fā)明的保護范圍。當(dāng)前第1頁12