本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種B族鏈球菌熒光定量PCR產(chǎn)前檢測(cè)引物、探針、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1938年Fry首次報(bào)告3例感染B族鏈球菌(Group B streptococci,GBS)引起產(chǎn)后心內(nèi)膜炎的死亡，證實(shí)B族鏈球菌為人類的致病菌。經(jīng)過(guò)幾十年的研究，發(fā)現(xiàn)B族鏈球菌可引起新生兒敗血癥、肺炎、腦膜炎，甚至死亡。在感染后存活的新生兒，還有可能有嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，包括腦積水、智力障礙、小頭畸形、耳聾等。同時(shí)，B族鏈球菌還可引起孕婦感染、引起早產(chǎn)、胎兒發(fā)育不良(低體重兒)、胎膜早破及晚期流產(chǎn)。

GBS，正常寄居于陰道和直腸，它是一種條件致病菌，一般正常健康人群感染GBS并不致病。

據(jù)統(tǒng)計(jì)約10％～30％的孕婦有感染GBS，其中40％～70％在分娩過(guò)程中會(huì)傳遞給新生兒。如果新生兒帶了這種菌，大約有1％～3％會(huì)出現(xiàn)早期侵入性感染，其中有5％會(huì)導(dǎo)致死亡。

孕婦感染表現(xiàn)為菌血癥、泌尿系統(tǒng)感染、胎膜感染、子宮內(nèi)膜感染以及創(chuàng)傷感染。

有報(bào)道顯示，在2745例產(chǎn)婦中，尿中有感染GBS的胎膜早破發(fā)生率為35％。據(jù)研究報(bào)道GBS陽(yáng)性的孕婦中有21％發(fā)生絨毛膜羊膜炎和產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎，分析表明GBS陽(yáng)性是引起絨毛膜羊膜炎的重要危險(xiǎn)因素。

研究表明，GBS陽(yáng)性孕婦早產(chǎn)合并低出生體重兒、極低體重兒的可能性增加20％-60％。

新生兒感染GBS能夠?qū)е聰⊙Y，肺炎和腦膜炎，發(fā)病率和死亡率較高，也可能遺留長(zhǎng)期病理狀態(tài)如耳聾、視力受損、發(fā)育障礙以及腦癱等。

依據(jù)美國(guó)新哈芬地區(qū)10年調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)果，其新生兒敗血癥年發(fā)生率為千分之二點(diǎn)七。其新生兒敗血癥有一半左右都是因B族鏈球菌感染引起的。

基于GBS感染引起孕婦和新生兒相關(guān)癥狀、疾病的嚴(yán)峻性，產(chǎn)前篩查GBS顯得尤為重要。

常規(guī)細(xì)菌分離鑒定方法(祝璟琳等,2010)檢測(cè)周期長(zhǎng),達(dá)不到對(duì)感染樣本快速診斷的要求；靶向于菌體基因組的核酸雜交技術(shù)(Rosa et al,1995；Yancey et al,1993),受操作復(fù)雜和成本昂貴等因素的制約,也很難用于對(duì)疑似感染樣本的診斷；靶向于某些編碼基因的PCR診斷方法(Mawn et al,1993；Ahmet et al,1999),也僅局限于對(duì)某些特定類型菌株的檢測(cè),而對(duì)其他血清型菌株或溶血型菌株的檢測(cè)則極易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。無(wú)乳鏈球菌也極易與其它鏈球菌屬成員菌產(chǎn)生診斷混淆。因此,建立一種快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌,且具有良好特異性和敏感性的檢測(cè)方法是十分必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種B族鏈球菌熒光定量PCR檢測(cè)引物、探針、試劑盒及其應(yīng)用。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明的第一方面提供了一種B族鏈球菌熒光定量PCR檢測(cè)引物及對(duì)應(yīng)探針，所述引物及對(duì)應(yīng)探針包括用于擴(kuò)增檢測(cè)B族鏈球菌的sip上下游引物、sip Taqman探針和用于擴(kuò)增檢測(cè)人β-actin的人β-actin上下游引物、人β-actin Taqman探針，sip上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具體為：5’-ttgacatcgacaatggcagc-3’；sip下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具體為：5’-taacacttgccactctaggg-3’；sip Taqman探針的核苷酸序列如：SEQ ID NO：3所示，具體為：5’--aacagatacgacgtggacag-3’；人β-actin上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，具體為5’-atcagcaagcaggagtatgacg-3’；人β-actin下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，具體為:5’-tgtgcaatcaaagtcctcgg-3’；人β-actin Taqman探針的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，具體為：5’--acctaacttgcgcagaaaac-3’。

本發(fā)明探針的合成為現(xiàn)有技術(shù)，探針一端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，探針另一端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。

優(yōu)選的，所述sip Taqman探針5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。更優(yōu)選的，所述sip Taqman探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1。

優(yōu)選的，所述人β-actin Taqman探針5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記熒光淬滅基 團(tuán)。更優(yōu)選的，人β-actin Taqman探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為HEX熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1。

本發(fā)明的第二方面提供了前述B族鏈球菌熒光定量PCR檢測(cè)引物、探針在制備B族鏈球菌檢測(cè)試劑中的用途。

本發(fā)明的第三方面提供了一種B族鏈球菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中含有前述引物和探針。

本發(fā)明的試劑盒采用高靈敏性的熒光定量PCR技術(shù)來(lái)進(jìn)行B族鏈球菌檢測(cè)。不同血清型的S.agalactiae基因組中sip基因高度保守,于是選擇sip基因(登錄號(hào)為DQ650634)為模板分別進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。采用所述引物進(jìn)行熒光PCR,進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增情況可分析來(lái)判斷B族鏈球菌感染情況。因此，引物組的設(shè)計(jì)是本發(fā)明試劑盒的關(guān)鍵。

基于試劑盒采用的是熒光PCR技術(shù)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的，所以試劑盒中還可以包括其他一些PCR所需要的常規(guī)試劑，如：Taq酶、PCR反應(yīng)緩沖液、MgCl2、dNTPs等常用PCR反應(yīng)試劑中的一種或多種。由于此類PCR常用試劑均可經(jīng)市場(chǎng)途徑單獨(dú)購(gòu)得或者自行配置，因此具體需要將哪些試劑裝配入試劑盒，可以根據(jù)客戶實(shí)際需要配置，為方便起見(jiàn)，也可全部裝配入試劑盒。

所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中，引物、Taq酶、PCR反應(yīng)緩沖液、MgCl₂、dNTPs均為常見(jiàn)組分，其含量亦為常規(guī)。

較優(yōu)的，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液的組成中，sip上游引物的終濃度為0.2pmol/μL，sip下游引物的終濃度為0.2pmol/μL，sip Taqman探針的終濃度為0.4pmol/μL。

較優(yōu)的，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液的組成中，人β-actin上游引物的終濃度為0.2pmol/μL，人β-actin下游引物的終濃度為0.2pmol/μL，人β-actin Taqman探針的終濃度為0.4pmol/μL。

更優(yōu)的，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液的組成及濃度為：每13.2ulPCR擴(kuò)增反應(yīng)液中含go Taq Probe qPCR Master 10μL，sip上游引物的終濃度為0.2pmol/μL，sip下游引物的終濃度為0.2pmol/μL，sip Taqman探針的終濃度為0.4pmol/μL，人β-actin上游引物的終濃度為0.2pmol/μL，人β-actin下游引物的終濃度為0.2pmol/μL，人β-actin Taqman探針的終濃度為0.4pmol/μL。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR擴(kuò)增反應(yīng)液加入引物及探針配置獲得。

所述試劑盒中還含有陽(yáng)性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照含有B族鏈球菌保守序列，可為含有B族鏈球菌保守序列的質(zhì)粒。所述的陽(yáng)性對(duì)照也可以為滅活的B族鏈球菌培養(yǎng)液。還可采用現(xiàn)有B族鏈球菌檢測(cè)試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照，也可單獨(dú)市購(gòu)或根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)自行構(gòu)建。

所述試劑盒中還可含有陰性對(duì)照。陰性對(duì)照可為各種不含有B族鏈球菌的溶液，如PCR緩沖液、無(wú)菌水(DEPC-H₂O)、生理鹽水等。

本發(fā)明第三方面公開(kāi)了前述試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

1)提取樣本DNA，即制備DNA模板；

2)加樣：將樣本DNA、陽(yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照分別加入裝有PCR擴(kuò)增反應(yīng)液的PCR管中，獲得對(duì)應(yīng)的樣本反應(yīng)管、陽(yáng)性反應(yīng)管或陰性反應(yīng)管；

3)PCR擴(kuò)增：反應(yīng)管置于定量熒光PCR儀上，設(shè)置循環(huán)參數(shù)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

4)PCR反應(yīng)結(jié)束后，檢測(cè)PCR反應(yīng)體系的熒光信號(hào)值，熒光通道選用FAM、HEX。

步驟1)中，樣本DNA的提取為現(xiàn)有技術(shù)。較優(yōu)的，提取DNA樣本，即制備DNA模板，包括以下步驟：(1)將試子樣本放入100ul 5％chelex-100溶液中，在振蕩器上反復(fù)振蕩，放入56℃保溫30分鐘；(2)取出后振蕩，100℃保溫8分鐘，振蕩后，13000rpm離心3分鐘，上清用于PCR擴(kuò)增，或放4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

步驟2)中，各反應(yīng)管中的反應(yīng)體系為20ul，其中，樣本反應(yīng)管中含樣本DNA2ul，PCR擴(kuò)增反應(yīng)液13.2ul，滅菌水4.8ul。

步驟3)中，PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋侯A(yù)變性95度5分鐘；變性95度10秒；退火55度20秒；延伸72度45秒(采集熒光)；從第二步開(kāi)始39個(gè)循環(huán)。

試劑盒質(zhì)量控制：試劑盒各對(duì)照品須達(dá)到以下表1中的要求，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

表1 試劑盒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

樣本DNA提取結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)如表2所示：

表2 檢測(cè)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明采用的引物組和Taqman熒光探針，能特異性擴(kuò)增B族鏈球菌sip基因和人類β-actin基因；采用不同熒光標(biāo)記，能同時(shí)進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增。若沒(méi)有任何DNA的存在，則就檢測(cè)不到任何熒光；若只有人類β-actin基因擴(kuò)增，則為B族鏈球菌陰性；若有兩種熒光(綠色，藍(lán)色)同時(shí)出現(xiàn)，才是B族鏈球菌陽(yáng)性。我們的陰性結(jié)果，必須有人β-actin基因擴(kuò)增(綠色)，因而，本發(fā)明方法的結(jié)果更可靠，準(zhǔn)確率為100％。

附圖說(shuō)明

圖1：只有人β-actin基因擴(kuò)增而沒(méi)有B族鏈球菌sip基因擴(kuò)增的樣品，為陰性(即沒(méi)有B族鏈球菌感染)；

圖2：人β-actin基因和B族鏈球菌sip基因二個(gè)同時(shí)能擴(kuò)增的樣品，為陽(yáng)性(即有B族鏈球菌感染)。

具體實(shí)施方式

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特 定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說(shuō)明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說(shuō)明，具體可參見(jiàn)Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

實(shí)施例1 B族鏈球菌熒光定量PCR檢測(cè)引物、探針的合成

在sip Taqman探針的5’標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，人β-actin Taqman探針的5’標(biāo)記HEX熒光基團(tuán)。合成B族鏈球菌熒光定量PCR檢測(cè)引物、探針。

sip上游引物：5’-ttgacatcgacaatggcagc-3’(SEQ ID NO：1)

sip下游引物：5’-taacacttgccactctaggg-3’(SEQ ID NO：2)

sip Taqman探針：5’-FAM--aacagatacgacgtggacag-BHQ1-3’(SEQ ID NO：3)

人β-actin上游引物：5’-atcagcaagcaggagtatgacg-3’(SEQ ID NO：4)

人β-actin下游引物：5’-tgtgcaatcaaagtcctcgg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：5)

人β-actin Taqman探針：5’-HEX-acctaacttgcgcagaaaac-BHQ1-3’(SEQ ID NO：6)

實(shí)施例2 B族鏈球菌的檢測(cè)

1)提取樣本DNA，即制備DNA模板，包括以下步驟：(1)將試子樣本放入100ul5％chelex-100溶液中，在振蕩器上反復(fù)振蕩，放入56℃保溫30分鐘；(2)取出后振蕩，100℃保溫8分鐘，振蕩后，13000rpm離心3分鐘，上清用于PCR擴(kuò)增，或放4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)配置PCR擴(kuò)增反應(yīng)液：每13.2ulPCR擴(kuò)增反應(yīng)液中含go Taq Probe qPCR Maeter 10μL，sip上游引物的終濃度為0.2pmol/μL，sip下游引物的終濃度為0.2pmol/μL，sip Taqman探針的終濃度為0.4pmol/μL，人β-actin上游引物的終濃度為0.2pmol/μL，人β-actin下游引物的終濃度為0.2pmol/μL，人β-actin Taqman探針的終濃度為0.4pmol/μL。

3)加樣：將樣本DNA、陽(yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照分別加入裝有PCR擴(kuò)增反應(yīng)液的PCR管中，獲得對(duì)應(yīng)的樣本反應(yīng)管、陽(yáng)性反應(yīng)管或陰性反應(yīng)管；各反應(yīng)管中的反應(yīng)體系為20ul，其中，樣本反應(yīng)管中含樣本DNA2ul，PCR擴(kuò)增反應(yīng)液13.2ul，滅菌水4.8ul；

4)PCR擴(kuò)增：反應(yīng)管置于定量熒光PCR儀上，設(shè)置循環(huán)參數(shù)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋侯A(yù)變性95度5分鐘；變性95度10秒；退火55度20秒；延伸72度45秒(采集熒光)；從第二步開(kāi)始39個(gè)循環(huán)；

5)PCR反應(yīng)結(jié)束后，檢測(cè)PCR反應(yīng)體系的熒光信號(hào)值，熒光通道選用FAM、HEX。

結(jié)果判定：如圖所示1和2所示，其中：

1.如圖1所示，只有人β-actin基因擴(kuò)增而沒(méi)有B族鏈球菌sip基因擴(kuò)增的樣品，為陰性(即沒(méi)有B族鏈球菌感染)；

3.如圖2所示，人β-actin基因和B族鏈球菌sip基因二個(gè)同時(shí)能擴(kuò)增的樣品，為陽(yáng)性(即有B族鏈球菌感染)。

實(shí)施例3 特異性和準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)

本發(fā)明針對(duì)B族鏈球菌的sip基因，采用Taqman探針擴(kuò)增。Sip基因是B族鏈球菌特有基因，可以避免與其他細(xì)菌的干擾，加上Taqman探針，就可以非常特異地?cái)U(kuò)增B族鏈球 菌的sip基因。

為評(píng)價(jià)本發(fā)明方法的準(zhǔn)確性，對(duì)采集的14例未感染B族鏈球菌的陰性樣品，采用本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1所示：

表1

根據(jù)本發(fā)明方法，只有人β-actin基因擴(kuò)增的樣品，為陰性樣品，表1中的檢測(cè)結(jié)果顯示，樣品A-N均為陰性樣品，與實(shí)際結(jié)果吻合，正確率為100％。

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)本發(fā)明方法的準(zhǔn)確性，采用本發(fā)明的方法和臨床采用的熒光PCR檢測(cè)方法一起對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。所述臨床采用的熒光PCR檢測(cè)方法采用的試劑盒為T(mén)IB的B族鏈球菌核酸檢測(cè)試劑盒。本次對(duì)比試驗(yàn)采用的臨床標(biāo)本包括1個(gè)采集未感染B族鏈球菌的陰性樣品(9號(hào))和16個(gè)采集的確認(rèn)感染B族鏈球菌的陽(yáng)性樣品。

表2

根據(jù)本發(fā)明方法，只有人β-actin基因和sip基因能夠同時(shí)擴(kuò)增的樣品，為陽(yáng)性樣品，表2中的檢測(cè)結(jié)果顯示，樣品1-8及10-17均為陽(yáng)性樣品，9號(hào)樣品為陰性樣品，與實(shí)際結(jié)果吻合，正確率為100％。而臨床上所用的熒光PCR方法卻將9號(hào)樣品判讀成了假陽(yáng)性。從上述表2結(jié)果還可以看出，本發(fā)明方法采用的樣本DNA量要低于對(duì)比方法所采用的樣本DNA量(ct值越小，DNA量越多)，說(shuō)明本發(fā)明的方法能夠?qū)Ω土康腄NA樣本進(jìn)行正確地檢測(cè)。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容而做出的些許更動(dòng)、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實(shí)施例；同時(shí)，凡依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對(duì)上述實(shí)施例所作的任何等同變化的更動(dòng)、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。