本發(fā)明涉及生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究及臨床診斷領(lǐng)域，具體涉及微小RNA熒光定量檢測試劑盒，及其在組織標(biāo)本或血液樣品中微小RNA的熒光定量檢測等方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

微小RNA，包括microRNA(miRNA)、small interfering RNA(siRNA)以及piwi-interacting RNA(piRNA)，是一類長約18-30個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA。

miRNA廣泛存在于動物、植物、線蟲等真核生物中，通過與靶基因mRNA的3’非編碼區(qū)特異性結(jié)合，降解靶mRNA或者抑制靶基因翻譯，從而導(dǎo)致靶基因表達(dá)減少。miRNA參與機體諸多生理過程及病理變化，調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、器官形成、細(xì)胞分裂、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、干細(xì)胞更新和分化等生理過程。大量研究表明，miRNA的異常表達(dá)與疾病發(fā)生密切相關(guān)，miRNA具有潛力，可作為基因干預(yù)靶點或者基因藥物用于臨床治療，也可作為分子標(biāo)志物用于疾病早期診斷或者預(yù)后。

siRNA也廣泛存在于真核細(xì)胞中，但內(nèi)源性siRNA較少，大多是合成的外源性siRNA，導(dǎo)入細(xì)胞，達(dá)到基因沉默的目的。siRNA作為基因治療手段，國外已批準(zhǔn)多項臨床試驗。

piRNA大量存在于生殖細(xì)胞，曾經(jīng)被認(rèn)為是生殖細(xì)胞特異表達(dá)，近期研究表明piRNA在腫瘤細(xì)胞和干細(xì)胞也有微量表達(dá)。piRNA對保障生殖細(xì)胞遺傳信息的穩(wěn)定性具有重要作用。

可見，微小RNA功能廣泛，具有重要的臨床應(yīng)用價值。微小RNA不論在科學(xué)研究或在臨床應(yīng)用，不論是作為疾病治療靶點，還是作為疾病早期診斷標(biāo)志物，都需要一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的定量檢測方法。

目前微小RNA表達(dá)的檢測方法主要有四種：(1)Northern blot技術(shù)、(2)原位雜交技術(shù)、(3)基因芯片技術(shù)、和(4)熒光定量PCR技術(shù)。Northern blot技術(shù)因為樣本RNA需求量大，需要同位素標(biāo)記探針才能達(dá)到高靈敏度檢測，無法做到絕對定 量，所以大多數(shù)用于研究所和實驗室，不適于臨床快速定量檢測。原位雜交技術(shù)因為程序復(fù)雜，探針雜交特異性低，微小RNA表達(dá)信號弱，也無法實現(xiàn)液體樣本的檢測，這些都限制了其應(yīng)用和推廣?；蛐酒夹g(shù)適于表達(dá)譜的高通量檢測，但因為假陽性率高，對其結(jié)果需要有一種更準(zhǔn)確的方法驗證。只有熒光定量PCR方法，準(zhǔn)確性好，靈敏度高，檢測速度快，被廣泛應(yīng)用于微小RNA的定量檢測。

微小RNA屬于RNA，根據(jù)基因擴增原理，RNA必須經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)，催化反應(yīng)變成cDNA，才能作為模板實現(xiàn)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增以及定量檢測。

與常規(guī)mRNA不同，微小RNA具有以下關(guān)鍵特征：(1)長度很短，只有18-30個堿基；(2)缺乏poly(A)尾巴；(3)序列差異小，有些miRNA之間只有1個堿基差別。鑒于這些特征，常規(guī)的mRNA逆轉(zhuǎn)錄方法和PCR擴增條件都不適于miRNA，這是因為：一方面oligo(dT)引物不能完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，另一方面，太短序列無法設(shè)計前后兩條引物。

現(xiàn)有技術(shù)中，一種對微小RNA進(jìn)行熒光定量檢測方法是莖環(huán)(stem-loop)引物法。該方法需要一條特殊結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物，一端序列可自體形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，另一端序列可與待測miRNA 3’端互補配對。然而，在該方法中，為了使逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)具有微小RNA特異性，對于每種微小RNA都需要設(shè)計特異的逆轉(zhuǎn)錄引物，所以檢測成本高，不適于廣泛應(yīng)用。

另一種對微小RNA進(jìn)行熒光定量檢測方法是poly(A)聚合酶加尾法。在該方法中，先在微小RNA 3’端人為添加poly(A)尾巴，再以O(shè)ligo(dT)引物完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。該方法靈敏度高、一次逆轉(zhuǎn)錄就可以合成所有微小RNA的cDNA，尤其適合于微小RNA的表達(dá)譜檢測和高通量篩選。然而，該方法存在以下缺點：(1)需要兩步反應(yīng)完成cDNA的合成，第一步是給微小RNA進(jìn)行poly(A)加尾，第二步是利用Oligo(dT)引物完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；(2)一次檢測過程耗時長，通常需要約4-6小時；(3)僅用于miRNA檢測，尚未用于其他微小RNA(包括siRNA及piRNA)的檢測；(4)3’端通用引物特異性不夠高，容易產(chǎn)生非特異擴增。

因此，本領(lǐng)域尚迫切需要開發(fā)更為簡便、高效、特異性地對微小RNA進(jìn)行熒光定量檢測方法和試劑盒。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是提供一種更簡便、高效、特異性地對微小RNA進(jìn)行熒光定量檢測方法和試劑盒。

本發(fā)明的第一方面，提供一種用于檢測微小RNA的試劑盒，所述試劑盒包含：

(a)用于對微小RNA進(jìn)行polyA加尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的第一試劑組，

其中，所述第一試劑組包括：用于催化加尾反應(yīng)的酶、用于催化逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的酶、用于加尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的緩沖液、以及逆轉(zhuǎn)錄引物；

所述的逆轉(zhuǎn)錄引物具有式I所示的從5’至3’的結(jié)構(gòu)：

X-Y-Z (I)

式中，

X為長度為15-30個堿基的通用序列區(qū)；

Y為長度為10-20個堿基的oligo(dT)區(qū)；

Z為分別選自下組的三種單核苷酸區(qū)：dA、dC、dG；

(b)用于進(jìn)行PCR熒光定量檢測的第二試劑組，

其中，所述的第二試劑組包括：用于PCR擴增反應(yīng)的下游通用引物，

并且，所述的下游通用引物特異性結(jié)合于所述逆轉(zhuǎn)錄引物的通用序列區(qū)。

在另一優(yōu)選例中，所述的下游通用引物的序列與所述逆轉(zhuǎn)錄引物的通用序列區(qū)完全互補。

在另一優(yōu)選例中，所述的下游通用引物的序列與所述逆轉(zhuǎn)錄引物的通用序列區(qū)不完全互補。

在另一優(yōu)選例中，所述的下游通用引物的長度為15-30個堿基，較佳地為17-25個堿基，更佳地為18-22個堿基。

在另一優(yōu)選例中，X為長度為17-25個堿基(較佳地18-22個堿基)的通用序列區(qū)；和/或

Y為長度為12-18個堿基(較佳地13-17個堿基)的oligo(dT)區(qū)。

在另一優(yōu)選例中，所述的Z的長度為1個堿基。

在另一優(yōu)選例中，所述的逆轉(zhuǎn)錄引物為間并引物，其中含dA、dC、dG的三種引物的摩爾比為1～2：1～2:1～2。

在另一優(yōu)選例中，所述的用于催化加尾反應(yīng)的酶選自下組：RNA poly(A)聚合酶；和/或

所述用于催化逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的酶選自下組:SuperScript逆轉(zhuǎn)錄酶。

在另一優(yōu)選例中，所述Poly A聚合酶和RNA逆轉(zhuǎn)錄酶的比例改為3：1-1：2，較佳地2.5：1至1：1.5。

在另一優(yōu)選例中，所述的用于加尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的緩沖液為5X緩沖液，其中所述5X緩沖液中鉀離子的濃度為200-600mM，較佳地為300-500mM，更佳地為 400±40mM。

在另一優(yōu)選例中，所述的用于加尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的5X緩沖液中鎂離子的濃度為50-200mM，較佳地為100-200mM，更佳地為150±20mM。

在另一優(yōu)選例中，所述的用于加尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的緩沖液中鉀離子與鎂離子的摩爾比為2～6:0.5～2，較佳地為3-5：1-2。

在另一優(yōu)選例中，所述的用于加尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的緩沖液具有選自下組的一個或多個特征：

(i)緩沖液含有的緩沖成分包括或由下組構(gòu)成：

250mM Tris；

400mM KCl；和

150mM MgCl₂；

(ii)pH為8.3。

在另一優(yōu)選例中，所述的第一試劑組還包括選自下組的一種或多種成分：

(a1)加尾反應(yīng)的底物；

(a2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的底物。

在另一優(yōu)選例中，所述的第一試劑組還包括選自下組的底物成分：

5-20nM Oligo(dT)間并引物；

0.5-5mM dATP；

5-20mM dNTP。

在另一優(yōu)選例中，所述的第一試劑組還含有DTT，較佳地DTT的濃度為0.5-5mM，較佳地為0.8-1.5mM。

在另一優(yōu)選例中，所述的第一試劑組含有：

10nM Oligo(dT)間并引物；

1mM dATP；

10mM dNTP；和

1mM DTT。

在另一優(yōu)選例中，所述的第二試劑組還包括選自下組的一種或多種成分：

(b1)用于擴增微小RNA的特異性上游引物；

(b2)用于催化聚合酶鏈反應(yīng)的酶；

(b3)用于PCR擴增反應(yīng)的緩沖液；

(b4)用于PCR擴增反應(yīng)的底物；

(b5)熒光劑。

在另一優(yōu)選例中，所述的熒光劑選自下組：SYBR Green。

在另一優(yōu)選例中，所述的特異性上游引物的長度為15-30個堿基，較佳地為17-25個堿基。

在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中，第一試劑組包括：

生物催化酶混合液，其中所述的生物催化酶混合液含有用于催化加尾反應(yīng)的酶和用于催化逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的酶；

催化反應(yīng)底物混合物，其中，所述催化反應(yīng)底物混合物含有用于加尾反應(yīng)的底物dATP和用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的底物dN，其中dNTP包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP。

在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中，第二試劑組包括：PCR熒光擴增反應(yīng)預(yù)混液，所述PCR熒光擴增反應(yīng)預(yù)混液中含有用于催化聚合酶鏈反應(yīng)的酶、用于PCR擴增反應(yīng)的緩沖組分、用于PCR擴增反應(yīng)的底物、和熒光劑；

在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括：第三容器以及位于所述第三容器內(nèi)的不含核酸酶的水。

在另一優(yōu)選例中，所述的第一試劑組和/或第二試劑組中的一種或多種成分分別放置于不同或相同的容器中。

在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括：

(c)陽性對照。

在另一優(yōu)選例中，所述的陽性對照為特異性擴增5s rRNA的前引物。

在另一優(yōu)選例中，所述的5s rRNA的前引物的序列如下：5’TCTACGGCCATACCACCCTGAA 3’；

用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的特殊引物序如下：

5’GCCATGGGATAACACTAAGCTTTTTTTTTTTTTTT(A/C/G)3’(SEQ ID NO.:2)和/或

用于熒光定量PCR反應(yīng)的通用后引物序列如下：

5’GCCATGGGATAACACTAAGC 3’(SEQ ID NO.:3)

在另一優(yōu)選例中，所述的微小RNA包括miRNA、siRNA和piRNA。

在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒可檢測源自動物、植物和微生物樣本的微小RNA。

在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒用于細(xì)胞、組織和體液的微小RNA檢測。

在另一優(yōu)選例中，所述的體液包括血液、尿液、組織分泌液、或其組合。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種本發(fā)明第一方面中用于檢測微小RNA的試劑盒的用途，它被用于制備用于腫瘤或心血管疾病的早期診斷和/或預(yù)后的檢測產(chǎn) 品。

在本發(fā)明的第三方面，提供了一種非診斷性和非治療性地體外檢測微小RNA的方法，所述方法包括以下步驟：

(i)提供一含微小RNA的待測樣品；

(ii)將所述含微小RNA的待測樣品加入加尾反應(yīng)/逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)催化體系，在一步反應(yīng)中進(jìn)行加尾反應(yīng)/逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，從而形成逆轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物；

所述催化體系含有：用于催化加尾反應(yīng)的酶、用于催化逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的酶、用于加尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄引物、用于加尾反應(yīng)的底物、和用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的底物和水；

其中，所述的逆轉(zhuǎn)錄引物具有式I所示的從5’至3’的結(jié)構(gòu)：

X-Y-Z (I)

式中，

X為長度為15-30個堿基的通用序列區(qū)；

Y為長度為10-20個堿基的oligo(dT)區(qū)；

Z為分別選自下組的三種單核苷酸區(qū)：dA、dC、dG；

(iii)對上一步驟中形成的cDNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，進(jìn)行PCR擴增，形成擴增產(chǎn)物；其中，所述PCR擴增所采用的引物對包括：用于PCR擴增反應(yīng)的下游通用引物和用于擴增微小RNA的特異性上游引物；

其中，所述的下游通用引物特異性結(jié)合于所述逆轉(zhuǎn)錄引物的通用序列區(qū)；

(iv)在步驟(iii)進(jìn)行中或之后，檢測所述擴增產(chǎn)物的存在與否和/或數(shù)量，從而獲得所述微小RNA的檢測結(jié)果。

在另一優(yōu)選例中，所述的檢測結(jié)果為定量檢測結(jié)果。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(ii)中，將所述的生物催化酶混合物、催化反應(yīng)緩沖液、催化反應(yīng)底物混合物以及不含核酸酶的水與總RNA混合物后發(fā)生反應(yīng)，在微小RNA 3’端添加poly(A)尾且逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(iii)之前，還包括：將步驟(ii)得到的cDNA用去離子水進(jìn)行稀釋(如稀釋1-1000倍)。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(iii)中，將PCR擴增反應(yīng)通用后引物、5s rRNA PCR擴增反應(yīng)前引物、待測微小RNA PCR擴增反應(yīng)前引物、PCR熒光擴增反應(yīng)預(yù)混液、以及不含核酸酶的水進(jìn)行混合，形成PCR擴增體系，然后進(jìn)行PCR擴增。

在另一優(yōu)選例中，通過熒光檢測，確定擴增產(chǎn)物的數(shù)量，進(jìn)而確定微小RNA的數(shù)量。

在另一優(yōu)選例中，所述方法具有選自下組的一個或多個特征：

(1)所述的生物催化酶混合物、催化反應(yīng)緩沖液、催化反應(yīng)底物混合物以及不含核酸酶的水的體積比為0.5-1.5:2-10:2-10:8-25；

(2)所述步驟(ii)的反應(yīng)條件為37±1℃水浴反應(yīng)30-60分鐘，之后90-98℃反應(yīng)2-8分鐘；

(3)所述步驟(ii)的反應(yīng)體系中含有0.5pg-200ng總RNA；

(4)所述步驟(ii)的反應(yīng)容器、取樣槍頭、反應(yīng)環(huán)境均不含核酸酶；

(5)所述的體系中含有0.5pg-10ng總RNA，1pg-1ng總RNA，更佳地1pg-100pg總RNA；最佳地1pg-50pg總RNA。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了本發(fā)明用于微小RNA定量檢測的流程示意圖。

圖2顯示了本發(fā)明用于微小RNA定量檢測的技術(shù)原理圖。

圖3顯示了本發(fā)明一次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可完成多種微小RNA的定量檢測示意圖。

圖4顯示了本發(fā)明一個實施例中，本發(fā)明用于人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231微小RNA let-7b,let-7c和5s rRNA定量檢測的擴增曲線圖(上)和溶解曲線圖(下)(三孔重復(fù))。

圖5顯示了本發(fā)明一個實施例中，用于人血漿樣本微小RNA miR-16的結(jié)果。其中圖5上顯示了血漿樣本的微小RNA稀釋十倍前后擴增曲線圖；圖5下顯示了血漿樣本的微小RNA稀釋后檢測結(jié)果與稀釋倍數(shù)一致。

圖6顯示了本發(fā)明一個實施例中，本發(fā)明用于實驗動物小鼠脂肪墊組織樣本微小RNA let-7b,let-7f和5s rRNA定量檢測的擴增曲線圖(上)和溶解曲線圖(下)(三孔重復(fù))。

具體實施方式

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入地研究，通過對檢測試劑和檢測條件的大量篩選，首次意外地開發(fā)了一種將polyA加尾反應(yīng)與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合二為一的微小RNA 檢測方法。通過特殊設(shè)計的引物和緩沖體系，本發(fā)明的微小RNA檢測方法能夠更簡便、更精確、更高效地對多種微小RNA進(jìn)行熒光定量檢測,因而可更廣泛地應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)研究及臨床疾病早期診斷等領(lǐng)域。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。

試劑盒

本發(fā)明提供了一種用于檢測微小RNA的試劑盒，所述試劑盒含有：

(a)用于對微小RNA進(jìn)行polyA加尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的第一試劑組，

其中，所述第一試劑組包括：用于催化加尾反應(yīng)的酶、用于催化逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的酶、用于加尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的緩沖液、以及逆轉(zhuǎn)錄引物；

所述的逆轉(zhuǎn)錄引物具有式I所示的從5’至3’的結(jié)構(gòu)：

X-Y-Z (I)

式中，

X為長度為15-30個堿基的通用序列區(qū)；

Y為長度為10-20個堿基的oligo(dT)區(qū)；

Z為分別選自下組的三種單核苷酸區(qū)：dA、dC、dG；

(b)用于進(jìn)行PCR熒光定量檢測的第二試劑組，

其中，所述的第二試劑組包括：用于PCR擴增反應(yīng)的下游通用引物，

并且，所述的下游通用引物特異性結(jié)合于所述逆轉(zhuǎn)錄引物的通用序列區(qū)。

在一優(yōu)選例中，所述的第一試劑組可位于第一容器內(nèi)；而所述的第二試劑組分別可位于第二容器內(nèi)。

在另一優(yōu)選例中，在所述的第一容器或第二容器中，所述的第一試劑組或第二試劑組為固態(tài)或液態(tài)。

在另一優(yōu)選例中，所述的第一試劑組或第二試劑組為固態(tài)，并且通過僅添加水，就可形成工作濃度的液態(tài)混合物。

另外，為了便于長期保存，也可將各試劑分別放置于不同的容器中。

典型地，本發(fā)明的一種試劑盒(用于實施例1-3)包含以下各管及其相應(yīng)成分：

1.管A：生物催化酶混合物(Enzyme mix)，用于微小RNA 3’端添加poly(A)尾巴的反應(yīng)及逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的反應(yīng)。

2.管B：催化反應(yīng)緩沖液(Reaction Buffer),含有優(yōu)化的最佳鉀離子和鎂離子濃度，以及溶液酸堿性，同時滿足了微小RNA 3’端poly(A)加尾巴反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的條件。

3.管C：催化反應(yīng)底物混合物(Reaction Mix),含有微小RNA 3’端poly(A) 加尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需的各種底物，以及三種帶通用tag的Oligo(dT)逆轉(zhuǎn)錄引物。

4.管D：PCR擴增反應(yīng)通用后引物(Universal Reverse Primer)。

5.管E：5s rRNA PCR擴增反應(yīng)前引物(Forward Primer for 5s rRNA)。

6.管F：待測微小RNA PCR擴增反應(yīng)前引物(Forward Primer for a miRNA or piRNA)。

7.管G：PCR熒光擴增反應(yīng)預(yù)混液(2x SYBR Master Mix,商品化產(chǎn)品，市場通用)，含微小RNA聚合酶熒光定量擴增反應(yīng)的底物和酶，包括DNA聚合酶，dNTP,SYBR等。

8.管H：不含核酸酶的水(Nuclease free H₂O)。

9.使用說明書。

適用于本發(fā)明的通用tag序列沒有特別限制，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的tag序列，只要該tag序列不與待檢測的微小RNA具有高同源性即可，從而可消除PCR反應(yīng)微小RNA的非特異擴增。通常，tag序列的長度為18-25nt。

檢測方法

本發(fā)明方法，采用的試劑盒包含微小RNA poly(A)加尾反應(yīng)、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及PCR反應(yīng)三個步驟所需全套試劑，并且優(yōu)化了反應(yīng)條件，把加尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合為一，在本發(fā)明提供的反應(yīng)條件下，微小RNA在加poly(A)尾的同時，完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，簡化了操作流程，縮短了檢測時間，提高了檢測效率。

如圖1、圖2和圖3所示，在本發(fā)明方法中，將總RNA的poly(A)加尾反應(yīng)與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合二為一。完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之后，利用微小RNA序列特異前引物和通用后引物，通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，SYBR green熒光染料結(jié)合到合成的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)中。通過反應(yīng)系統(tǒng)熒光強度的實時檢測，可定量計算雙鏈DNA的合成效率。根據(jù)數(shù)據(jù)分析，可準(zhǔn)確快速地得出檢測結(jié)果。

上述用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的特殊引物序列從5’端開始依次是tag+oligo(dT)+核苷酸(dA，dG，或dC)。例如，典型地，tag可由20個核苷酸組成，并且也可作為PCR反應(yīng)的通用后引物序列，oligo(dT)可由15個dT組成。這樣設(shè)計的逆轉(zhuǎn)錄引物，可以將所有帶poly(A)尾的RNA，包括加尾處理的各類微小RNA，都逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA。

本發(fā)明以含miRNA、siRNA或piRNA的總RNA為起始模板，單次孵育反應(yīng)，就能完成所有miRNA、siRNA、piRNA及其他微小RNA的cDNA合成，可用于多 種微小RNA的PCR檢測或者微小RNA的高通量檢測。

本發(fā)明檢測微小RNA，靈敏度高，線性范圍廣，起始RNA量從1pg到2ug之間都有良好的線性關(guān)系。

本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。

本發(fā)明的主要優(yōu)點包括：

(1)微小RNA的poly(A)加尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA反應(yīng)合為一步反應(yīng)，簡化了操作流程，整個檢測時間縮短了至少30％。

(2)酶催化反應(yīng)緩沖液能夠同時最大程度滿足poly(A)加尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA反應(yīng)需要，此外，通過特別優(yōu)化的鹽離子濃度和酸堿性，可以取得非常優(yōu)良的加尾和逆轉(zhuǎn)錄效果。

(3)酶催化反應(yīng)底物mix能夠滿足poly(A)加尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA反應(yīng)對所有底物的需求。

(4)酶mix中poly(A)聚合酶與逆轉(zhuǎn)錄酶的最佳比例，在保證催化反應(yīng)最高效率的前提下，成本最低化。

(5)一次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，就能實現(xiàn)多種微小RNA的檢測，最快可以在2.5小時內(nèi)完成384個微小RNA的定量檢測。

(6)逆轉(zhuǎn)錄引物采用三條引物的混合，從5’端開始，其結(jié)構(gòu)組成是：tag+oligo(dT)+(dA或dG或dC)。其中，tag由20個核苷酸組成，oligo(dT)由15個dT組成。

(7)根據(jù)待測微小RNA的序列信息，每種微小RNA都設(shè)計其序列特異的前引物，用于PCR擴增。

(8)SYBR Green熒光染料摻入法以及20個核苷酸組成的通用后引物，用于微小RNA的實時定量PCR檢測。

(9)本發(fā)明試劑盒和檢測方法可廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究、疾病早期診斷和預(yù)后等方面，有廣闊的應(yīng)用前景。

下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于 說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。

除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

通用方法和試劑

(A)試劑

用于陽性對照的特異性擴增5s rRNA的前引物的序列如下：

5’TCTACGGCCATACCACCCTGAA 3’(SEQ ID NO.:1)

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的特殊引物序列從5’端開始依次是tag+oligo(dT)+核苷酸(dA，dG，dC)。tag為20個核苷酸組成，作為PCR反應(yīng)的通用后引物序列，oligo(dT)由15個dT組成，其中含dA、dC、dG的三種引物的摩爾比為1:1:1。

用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的特殊引物序如下：

5’GCCATGGGATAACACTAAGCTTTTTTTTTTTTTTT(A/C/G)3’(SEQ ID NO.:2)

用于熒光定量PCR反應(yīng)的通用后引物序列如下：

5’GCCATGGGATAACACTAAGC 3’(SEQ ID NO.:3)

(B)操作流程

1.poly(A)加尾和逆轉(zhuǎn)錄過程。本流程所需時間35-60分鐘。

反應(yīng)體系組成：

總RNA：1pg～200ng

管A(Enzyme mix)：1ul；

其中，Poly A聚合酶和RNA逆轉(zhuǎn)錄酶用量(IU)為2:1。

管B(Buffer)：4ul,

所述緩沖液(pH為8.3)含有的緩沖成分如下：

250mM Tris；

400mM KCl；和

150mM MgCl₂。

管C(reaction mix)：4ul

管H(Nuclease free water)：補足到終體積20ul

攝氏37℃水浴反應(yīng)30分鐘，之后95℃5分鐘，離心，放置冰上，直接進(jìn)入PCR反應(yīng)或者-20℃冷凍保存。

2.cDNA稀釋：根據(jù)上述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的起始RNA量，以及待檢測微小RNA的表達(dá)豐度，對上一步合成的cDNA用去離子水稀釋1～1000倍。本流程所需時間5分鐘。

3.實時定量PCR擴增反應(yīng)。本流程所需時間90分鐘。

反應(yīng)體系組成(單管、96孔或384孔板)：

cDNA：2ul

管D(通用后引物)：1ul

管E(陽性對照前引物)或者F(待測微小RNA前引物)：1ul

管G(2X SYBR mix)：10ul

管H(Nuclease free water)：補足到終體積20ul

反應(yīng)條件：95℃10分鐘，40個循環(huán)的95℃20秒，60℃1分鐘。

4.PCR結(jié)果數(shù)據(jù)分析。

實施例1

人乳腺癌細(xì)胞中微小RNA的測定

在本實施例中，采用常規(guī)方法制備來自人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231(購自美國ATCC)的總RNA，并通過系列稀釋法稀釋成所需的總RNA濃度，0.5pg/1微升、5pg/1微升、50pg/1微升、500pg/1微升。在所述20微升的反應(yīng)體系中，總RNA的數(shù)量為0.5pg、5pg、50pg或500pg。

然后用本發(fā)明方法定量檢測生物細(xì)胞樣本的微小RNA含量。

在本實施例中，檢測人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的微小RNA let-7b，let-7c和5s rRNA(陽性對照)。

采用5pg總RNA樣本時的擴增曲線和溶解曲線圖如圖4所示。

從圖4的微小RNA擴增曲線可見清晰的背景信號階段、熒光信號指數(shù)擴增階段和擴增平臺期階段。另外，在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間標(biāo)準(zhǔn)的線性關(guān)系，故選擇在這個階段進(jìn)行微小RNA定量分析。

圖4中微小RNA溶解曲線可見每個微小RNA都呈現(xiàn)單一的擴增峰，表明微小RNA擴增產(chǎn)物的單一性和特異性。

從圖4結(jié)果可見：

1)檢測重復(fù)性好。每個微小RNA三個復(fù)孔的檢測重復(fù)性很好。

2)檢測特異性好。let-7b和let-7c序列雖然只有一個堿基差別，應(yīng)用該試劑盒能夠特異性檢測和區(qū)分。而常規(guī)northern blot檢測方法是無法做到的。

3)假陽性率低。空白對照未檢測到任何待測RNA，也進(jìn)一步證實了檢測特異性。

4)檢測靈敏度高。通過稀釋倍數(shù)折算，該檢測只用了5pg總RNA樣本，能準(zhǔn)確檢測細(xì)胞樣本的微小RNA含量。

實施例2

生物體液樣本的微小RNA的測定

在本實施例中，采用常規(guī)方法制備來自人血漿(健康的自愿者提供)的總RNA，并定量檢測所述生物體液樣本的微小RNA含量。方法同實施例1。在所述20微升的反應(yīng)體系中，總RNA的數(shù)量為5pg或50pg。

對于正常人的血漿的微小RNA miR-16(三孔重復(fù)，50pg總RNA)的擴增曲線如圖5所示。

從圖5結(jié)果可見：

1)檢測重復(fù)性好。微小RNA三復(fù)孔的檢測重復(fù)性很好。

2)檢測準(zhǔn)確性好。本次試驗把樣本RNA進(jìn)行了1:10稀釋，然后同時檢測同一個微小RNA miR-16。如圖5所示，擴增曲線相差3.4個周期，換算為表達(dá)含量之后，兩個樣本之間的miR-16表達(dá)差異為10.55倍，檢測非常準(zhǔn)確，誤差率只有0.5％。

3)檢測靈敏度高。通過稀釋倍數(shù)折算，該檢測只用了0.05ng總RNA樣本，能準(zhǔn)確檢測到血漿樣本微小RNA含量。

4)檢測結(jié)果假陽性率低。本次試驗加了一組空白水樣本，如圖所示，空白水樣本檢測結(jié)果顯示，miR-16含量為零。

實施例3

生物組織樣本的微小RNA的測定

在本實施例中，采用常規(guī)方法制備來自小鼠(購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心)乳腺脂肪墊組織的總RNA，并定量檢測所述組織樣本的微小RNA含量。方法同實施例1。在所述20微升的反應(yīng)體系中，總RNA的數(shù)量為1pg、10pg、或50pg。

實驗小鼠乳腺脂肪墊組織的微小RNA let-7b、let-7f和5s rRNA(三孔重復(fù)，10pg總RNA)的擴增曲線和溶解曲線如圖6所示。

從圖6所示結(jié)果可見：

1)檢測重復(fù)性好。每個微小RNA三復(fù)孔的檢測重復(fù)性很好。

2)檢測特異性好。Let-7b和let-7f屬于同一個微小家族不同成員，序列非常近似，但本發(fā)明的試劑盒能夠特異性區(qū)分和檢測。這是常規(guī)northern blot檢測方法無法做到的。另外，空白對照沒有檢測到這幾個微小RNA的含量。

3)檢測靈敏度高。通過稀釋倍數(shù)折算，該檢測只用了10pg RNA樣本，就能靈敏檢測生物組織樣本微小RNA含量。

實施例4-9

重復(fù)實施例1，其中，在所述20微升的反應(yīng)體系中，總RNA的數(shù)量為50pg或500pg。

另外，在這些實施例中，不同點在于分別采用不同的反應(yīng)條件：

實施例4：管A中Poly A聚合酶和RNA逆轉(zhuǎn)錄酶的比例改為3：1和1：2；

實施例5：管A中Poly A聚合酶和RNA逆轉(zhuǎn)錄酶的比例改為1：5；

實施例6：管B鎂離子濃度改為5mM；

實施例7：管B鎂離子濃度改為300mM；

實施例8：逆轉(zhuǎn)錄引物X區(qū)通用引物序列的長度改為10nt；

實施例9：采用常規(guī)的獨立的加尾緩沖體系和逆轉(zhuǎn)錄緩沖體系，將RNA加尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)分兩步進(jìn)行。

結(jié)果顯示，

在實施例4和5中，當(dāng)Poly A聚合酶和RNA逆轉(zhuǎn)錄酶之比的參數(shù)改變后，微小RNA擴增效率尚可但有所降低(3:1和1:2)，尤其管A Poly A聚合酶和RNA逆轉(zhuǎn)錄酶的比例1：5條件下，微小RNA不能成功擴增。

在實施例6和7中，當(dāng)鎂離子濃度改變后，微小RNA擴增效率顯著降低(與實施例1相比)。

在實施例8中，縮短通用引物序列為10nt，微小RNA擴增出現(xiàn)雙峰甚至多峰，表明擴增產(chǎn)物不單一，微小RNA檢測不特異。

在實施例9中，微小RNA擴增效率差不多，但所需時間及酶消耗成本都增加了一倍。

從上述實施例中可以看出，本發(fā)明的試劑盒無論在微小RNA檢測靈敏性、特異性、準(zhǔn)確性等各方面達(dá)到了最優(yōu)化，在檢測成本及所需時間上實現(xiàn)了最低 耗和最高效。具體地，

1.本發(fā)明首次實現(xiàn)了微小RNA加尾poly(A)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的兩步合一。

2.本發(fā)明通過優(yōu)化了酶催化反應(yīng)條件，包括鉀離子濃度、鎂離子濃度、pH值等，同時滿足了poly(A)加尾和逆轉(zhuǎn)錄高效反應(yīng)的要求。

3.在反應(yīng)體系中，實現(xiàn)了poly(A)聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的最佳比例，既能保證兩步反應(yīng)的最高效率，有把實驗成本降低到最低限度。

4.逆轉(zhuǎn)錄引物采用三條引物的混合，可以使各種微小RNA(3’端dA,dT,dC,dG)都能被逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，理論上排除了任何漏網(wǎng)的可能性。

5.一次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，就能實現(xiàn)多種微小RNA的檢測。比如一次反應(yīng)，2.5小時，最快可以完成384個微小RNA的定量檢測。

6.本發(fā)明可用于動物、植物或微生物樣本，適用于細(xì)胞、組織、體液(包括血液和組織分泌物)中制備的RNA。

7.除了miRNA，也可用于其他微小RNA，包括piRNA及siRNA的檢測。

8.本發(fā)明的試劑盒包含了poly(A)加尾反應(yīng)、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、熒光定量PCR反應(yīng)所需的所有試劑，包括待測微小RNA的引物、用于結(jié)果分析校正及陽性對照的管家基因引物，真正實現(xiàn)了ALL-IN-ONE。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。