本發(fā)明涉及動物病原分子檢測技術領域，具體涉及一種牛支原體環(huán)介導等溫擴增檢測方法及其應用。

背景技術：

牛支原體(mycoplasmabovis)是一種重要的引起牛呼吸道炎癥、乳腺炎和關節(jié)炎等多系統(tǒng)炎癥的致病性病原體。牛支原體屬于柔膜體綱，支原體目，支原體屬，1961年hale等在美國首次從患有乳腺炎的病牛中分離得到。世界多個國家都證實該病原及其相關疾病廣泛流傳，極大地威脅了養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展。我國自2008年首次在病牛肺臟分離得到m.bovis病原，隨后證實該病在全國不同地方廣泛流行，導致嚴重的經(jīng)濟損失。雖然，病毒分離可確診牛支原體，但是，由于支原體培養(yǎng)周期長、難度大，不能作為快速診斷牛支原體感染的方法。pcr方法雖然快速精確，但是需要在實驗室才能完成，不適合臨床和基層使用。因此，建立一種高效、快速、特異的檢測方法具有重要意義。

環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediatedisothermalamplificationmethod，lamp)具有高特異性、高靈敏性、簡單、快捷及成本低的特點，很好的解決了上述難題，廣泛用于疾病的診斷、檢測等領域。

發(fā)明專利cn101736085b公開了一種牛支原體環(huán)介導等溫擴增檢測方法，其步驟包括：(1)引物合成：根據(jù)牛支原體特異性基因uvrc的序列設計兩對特異引物；(2)培養(yǎng)牛支原體；(3)提取牛支原體總dna；(4)環(huán)介導等溫擴增反應和(5)環(huán)介導等溫擴增反應產(chǎn)物分析。本發(fā)明可以100％擴增到臨床分離到的牛支原體，且特異性強，對呼吸道常見菌可以作鑒別檢測。但是，牛支原體和牛無乳支原體在16srna的同源性為99％，且兩者的其他基因序列也有很大相似性，因此，能否準確區(qū)分這兩種菌株體現(xiàn)引物特異性高低，該專利選用的牛支原體uvrc基因與牛無乳支原體的uvrc基因的同源性為82％-83％，用uvrc基因分辨牛支原體和牛無乳支原體有一定的難度，而且，特異性實驗中樣本也沒有包含牛無乳支原體，所以該套引物能否區(qū)分牛支原體和牛無乳支原體還未可知；并且，選用的菌株為絲狀支原體山羊亞種pg3、綿羊肺炎支原體y98、牛鼻氣管炎病毒、大腸桿菌、牛型分枝桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、炭疽芽孢桿菌，其中絲狀支原體山羊亞種pg3、綿羊肺炎支原體y98是不會感染牛的，因此選用這兩種菌株根本無實際意義；該專利采用sybrgreeni染料進行染色，但是，申請人根據(jù)大量實驗發(fā)現(xiàn)，該方法特異性不強，陰性和陽性結(jié)果區(qū)分很不明顯，不管肉眼還是紫外光下觀察都沒有明顯區(qū)別，因為sybrgreeni染料是結(jié)合于所有的雙鏈dna雙螺旋區(qū)域，具有綠色激發(fā)波長的染料，而dna濃度實驗過程中的改變對熒光的強度影響肉眼無法準確區(qū)分，因此該方法結(jié)果有時無法判定。

發(fā)明專利cn104651519a公開了一種牛支原體環(huán)介導等溫擴增試劑盒，該試劑盒包括lamp引物、2×反應緩沖液、bstdna聚合酶、熒光目視檢測試劑、超純水和牛支原體dna模板，所述的lamp引物包括外引物f3與b3和內(nèi)引物fip與bip。特異性檢測和敏感性檢測證實，該專利申請?zhí)峁┑膌amp檢測方法可實時監(jiān)測反應并且定量檢測出牛支原體的拷貝數(shù)，快速準確的獲得檢測結(jié)果，為簡便、快速和可靠的檢測牛支原體帶來便利。但是，該專利在結(jié)果檢測中采用的對照菌株沒有無乳支原體，因此，該套引物能否區(qū)分和牛支原體相似性最高的牛無乳支原體未知，所以其結(jié)果的特異性就有待考證；并且，申請人通過大量實驗發(fā)現(xiàn)鈣黃綠素熒光試劑的結(jié)果特異性不高，肉眼無法區(qū)分，且結(jié)果不穩(wěn)定，不適合實際應用，并且，

也不推薦臨床使用。

技術實現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術的不足和缺陷，本發(fā)明提供了一種牛支原體環(huán)介導等溫擴增檢測方法，該方法在牛支原體檢測中快速、靈敏、特異而又簡單實用。

一種牛支原體環(huán)介導等溫擴增檢測方法，具體包括以下步驟：

(1)引物合成：根據(jù)牛支原體特異性基因p81設計兩對特異性引物，所述引物組成的dna序列如下：

fip

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bip

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(2)配置pplo液體培養(yǎng)基；

(3)培養(yǎng)牛支原體：取pplo液體培養(yǎng)基接種牛支原體菌液，在含有5％co2、37℃溫箱中培養(yǎng)3天，待pplo液體培養(yǎng)基由紅色變?yōu)槌壬⒁后w透亮后停止培養(yǎng)，使用dna提取試劑盒提取dna；

(4)環(huán)介導等溫擴增反應：以fip、bip為內(nèi)引物，f3、b3為外引物對牛支原體dna進行等溫擴增，其反應體系為：1mmdntps，2.5μl10×bstbuffer，5ubst聚合酶，2μl模板，4mmmgso4，外引物和內(nèi)引物各0.8μm，ddh2o補齊至25μl，置于64℃水浴鍋中40min，80℃10min終止反應；

(5)環(huán)介導等溫擴增反應產(chǎn)物分析：步驟(4)的反應產(chǎn)物用2％的瓊脂糖凝膠電泳，120v電壓電泳30min，在凝膠成像系統(tǒng)中成像。

凝膠成像結(jié)果中，產(chǎn)物為梯形條帶證明為牛支原體陽性，反之，為牛支原體陰性。

優(yōu)選的，步驟(2)pplo液體培養(yǎng)基的配置中，取肉湯粉4.2g，酵母提取物5g，1％酚紅指示劑0.4ml，葡萄糖1g，加水至200ml，高壓滅菌后冷卻至后加入40ml馬血清，100mg/ml的青霉素200μl。

進一步，步驟(3)中，按照1:1000的比例將牛支原體菌液接種至pplo液體培養(yǎng)基上。

優(yōu)選的，步驟(3)中，所述dna提取試劑盒為血液dna提取試劑盒或組織dna提取試劑盒。

進一步，本發(fā)明的牛支原體環(huán)介導等溫擴增檢測方法在牛支原體檢測中的應用。

本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點：

(1)與傳統(tǒng)的普通pcr方法相比，本發(fā)明的牛支原體環(huán)介導等溫擴增檢測方法經(jīng)濟實用，不需要昂貴的pcr儀器，水浴鍋即可；本發(fā)明的方法靈敏度高，可檢測到10³拷貝數(shù)的牛支原體目的基因，普通pcr只能檢測到10⁴拷貝數(shù)，靈敏度高10倍；本發(fā)明采用4條引物，特異性強，識別6個位點，增加了與牛支原體目的基因結(jié)合的特異性。

(2)與現(xiàn)有的牛支原體環(huán)介導等溫擴增方法相比，本發(fā)明采用的牛支原體p81基因與牛無乳支原體同源性74％，比uvrc基因的同源性更低，并且，通過特異性檢測實驗可以證明，本發(fā)明的引物能夠準確區(qū)分牛支原體和牛無乳支原體，檢測過程中能夠把最有可能干擾檢測結(jié)果的菌株排除。

(3)與現(xiàn)有的牛支原體環(huán)介導等溫擴增方法相比，本發(fā)明在結(jié)果檢測中采用的菌株為無乳支原體、絲狀支原體絲狀亞種小克隆、多殺性巴氏桿菌、化膿性隱秘桿菌、牛肺炎鏈球菌、溶血性曼氏桿菌，其中，無乳支原體和牛支原體基因相似度高，并且，其他菌株也都是能引起牛肺炎的病原，與牛支原體引起的主要癥狀一致，較說服力更強，因此，本發(fā)明具有更強的實用性能。

綜合上述，本發(fā)明根據(jù)牛支原體特異性基因p81設計兩對特異性引物建立的牛支原體環(huán)介導等溫擴增方法，快速、簡單、靈敏，能夠特異的檢測出牛支原體感染。

附圖說明

序列表seqidno：1是本發(fā)明牛支原體特異性基因p81的核苷酸序列；

圖1為lmap擴增目的片段，下劃線序列為引物結(jié)合區(qū)域；

圖2為lamp檢測牛支原體試驗流程；

圖3為組織樣本檢測；其中，泳道m(xù)：dl2000dnamarker，泳道1-6：陽性組織、陰性組織、陰性組織、陽性組織、陽性組織、陰性對照；

圖4為牛支原體特異性檢測；其中，泳道m(xù)：dl2000dnamarker，泳道1-8分別為：牛支原體、無乳支原體、絲狀支原體絲狀亞種小克隆、多殺性巴氏桿菌、化膿性隱秘桿菌、牛肺炎鏈球菌、溶血性曼氏桿菌、陰性對照；

圖5為p81基因pcr電泳；其中，泳道m(xù)：dl2000dnamarker，泳道1：p81基因；

圖6為牛支原體靈敏度檢測；其中，泳道m(xù)：dl2000dnamarker，泳道1-9：依次陽性質(zhì)?？截悢?shù)為10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10；

圖7為普通pcr靈敏度檢測；其中，泳道m(xù)：dl2000dnamarker，泳道1-9：依次陽性質(zhì)粒拷貝數(shù)為10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10；

圖8為牛支原體菌落鏡檢圖片。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1對臨床分離到的牛支原體進行檢測

1、牛支原體的分離及培養(yǎng)

將病牛肺臟組織表面用酒精棉灼燒滅菌后，切取一小塊深層病變組織，接種pplo固體培養(yǎng)基(配方：pplo肉湯粉4.2g，酵母提取物5g，1％酚紅指示劑0.4ml，葡萄糖1g，加水至200ml，高壓滅菌后冷卻至后加入40ml馬血清，100mg/ml的青霉素200μl，瓊脂粉3g)。在含有5％co2的37℃溫箱培養(yǎng)3天，置于40×顯微鏡下觀察有煎蛋樣支原體菌落，挑取單菌落接種pplo液體培養(yǎng)基，5％co2的37℃溫箱培養(yǎng)3天，液體由紅色變?yōu)槌壬该饕后w表明僅有支原體生長。

2、lamp擴增

如圖1所示，根據(jù)牛支原體特異性基因p81通過lamp在線引物設計軟件(http://primerexplorer.jp/e/index.html)及primerexplorerv5設計引物，最終確定71bp-296bp的堿基序列之間的6個不同區(qū)域設計lamp擴增反應所需要的兩對特異性引物，其中，內(nèi)引物為fip和bip，外引物為f3和b3，且引物組成的dna序列如下：

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bip

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提取牛支原體總dna：使用商品化試劑盒提取dna，-20℃保存。該dna提取試劑盒為血液dna提取試劑盒或組織dna提取試劑盒均可。

如圖2所示，環(huán)介導等溫擴增反應：以fip、bip為內(nèi)引物，f3、b3為外引物對牛支原體dna進行等溫擴增，反應體系為：1mmdntps，2.5μl10×bstbuffer，5ubst聚合酶，2μl模板，4mmmgso4，外引物和內(nèi)引物各0.8μm，ddh2o補齊至25μl。置于64℃水浴鍋中40min，80℃10min終止反應。

環(huán)介導等溫擴增反應產(chǎn)物分析：其反應產(chǎn)物用2％的瓊脂糖凝膠電泳，120v電壓電泳30min，在凝膠成像系統(tǒng)中成像。如圖3所示，產(chǎn)物為梯形條帶證明為牛支原體陽性，反之，為牛支原體陰性。

實施例2牛支原體lamp檢測方法特異性實驗

培養(yǎng)表1所列菌株：無乳支原體、絲狀支原體絲狀亞種小克隆、多殺性巴氏桿菌、化膿性隱秘桿菌、牛肺炎鏈球菌、溶血性曼氏桿菌。

表1牛支原體lamp檢測方法特異性實驗(驗證實驗)

注：“+”表示可以檢測到有梯形條帶，“-”表示不能檢測到。

環(huán)介導等溫擴增反應：以fip、bip為內(nèi)引物，f3、b3為外引物分別對從牛支原體、無乳支原體、絲狀支原體絲狀亞種小克隆、多殺性巴氏桿菌、化膿性隱秘桿菌、牛肺炎鏈球菌、溶血性曼氏桿菌的dna進行等溫擴增，反應體系為：1mmdntps，2.5μl10×bstbuffer，5ubst聚合酶，2μl模板，4mmmgso4，外引物和內(nèi)引物各0.8μm，ddh2o補齊至25μl，置于64℃水浴鍋中40min，80℃10min終止反應。

環(huán)介導等溫擴增反應產(chǎn)物分析：其反應產(chǎn)物用2％的瓊脂糖凝膠電泳，120v電壓電泳30min，在凝膠成像系統(tǒng)中成像。如圖4所示，產(chǎn)物為梯形條帶證明為牛支原體陽性，反之，為牛支原體陰性。

實施例3牛支原體lamp檢測方法靈敏度實驗

用牛支原體p81基因的陽性質(zhì)粒作模板，檢測牛支原體lamp方法的靈敏度。方法如下：

按照實施例1的方法培養(yǎng)牛支原體并提取牛支原體總dna。

用普通pcr擴增出目的片段：用p81全長引物擴增出牛支原體總dna中目的基因，反應體系：ex-taq酶1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，10×buffer4μl，dntp4μl，ddh2o27μl，模板dna2μl。將上述試劑混勻放置于pcr儀中，反應參數(shù)設置為：

pcr產(chǎn)物分析：取50μlpcr產(chǎn)物在1.5％的瓊脂糖凝膠中進行電泳，120v電泳30min，凝膠成像系統(tǒng)中成像。如圖5所示，可以看到2100bp片段。

陽性質(zhì)粒構建：將擴增的目的基因從瓊脂糖凝膠上切下，使用瓊脂糖凝膠試劑盒回收目的片段(購自tiangen公司)。將回收目的產(chǎn)物與pmd-18t載體連接，連接體系為：pmd-18t載體1μl，目的片段5μl，solutioni4μl，16℃連接8h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化dh5ɑ感受態(tài)，37℃搖床培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒，通過測序的方法鑒定重組質(zhì)粒。

將陽性質(zhì)粒通過紫外分光光度計測定濃度，計算質(zhì)?？截悢?shù)。公式為：

經(jīng)計算陽性質(zhì)?？截悢?shù)為：2.33×10¹⁰。用ddh2o將上述質(zhì)粒進行倍比稀釋，使其終濃度10⁹copies/μl，10⁸copies/μl，10⁷copies/μl，10⁶copies/μl，10⁵copies/μl，10⁴copies/μl，10³copies/μl，10²copies/μl，10copies/μl。

lamp靈敏度實驗：以fip/bip為內(nèi)引物，以f3/b3為外引物對陽性質(zhì)粒進行擴增，使體系中含質(zhì)?？截悢?shù)依次為：10⁹，10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10。體系中其它試劑為1mmdntps，2.5μl10×bstbuffer，5ubst聚合酶，2μl模板，4mmmgso4，外引物和內(nèi)引物各0.8μm，ddh2o補齊至25μl。置于64℃水浴鍋中40min，80℃10min終止反應。

結(jié)果分析：其反應產(chǎn)物用2％的瓊脂糖凝膠電泳，120v電壓電泳30min，在凝膠成像系統(tǒng)中成像。如圖6所示，結(jié)果lamp對陽性質(zhì)粒的擴增下限為10³個。

對陽性質(zhì)粒進行普通pcr擴增，使體系中含質(zhì)?？截悢?shù)依次為：10⁹，10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10。如圖7所示，普通pcr對陽性質(zhì)粒的擴增下限為10⁴個。

實施例4：對牛支原體肺炎病變肺臟檢測

對臨床三份牛支原體陽性肺臟和兩份牛支原體陰性肺臟進行l(wèi)amp檢測。

牛支原體培養(yǎng)方法如下：將病牛肺臟組織表面用酒精棉灼燒滅菌后，切取一小塊深層病變組織，接種pplo固體培養(yǎng)基。在含有5％co2的37℃溫箱培養(yǎng)3天，置于40×顯微鏡下觀察有煎蛋樣支原體菌落，挑取單菌落接種pplo液體培養(yǎng)基，5％co2的37℃溫箱培養(yǎng)3天，液體由紅色變?yōu)槌壬该饕后w表明僅有支原體生長。顯微鏡下觀察結(jié)果如圖8，可見典型的煎蛋樣菌落。

lamp檢測程序如下：取出1g左右組織，放置高壓滅菌后的玻璃研磨器中，加入1mlpbs研磨，5000rpm離心1min，取上清，使用dna提取試劑盒提取dna。

環(huán)介導等溫擴增反應：以fip、bip為內(nèi)引物，f3、b3為外引物對牛支原體dna進行等溫擴增，反應體系為：1mmdntps，2.5μl10×bstbuffer，5ubst聚合酶，2μl模板，4mmmgso4，外引物和內(nèi)引物各0.8μm，ddh2o補齊至25μl。置于64℃水浴鍋中40min，80℃10min終止反應。

環(huán)介導等溫擴增反應產(chǎn)物分析：其反應產(chǎn)物用2％的瓊脂糖凝膠電泳，120v電壓電泳30min，在凝膠成像系統(tǒng)中成像。如圖3所示，三份為牛支原體陽性肺臟和兩份為牛支原體陰性肺臟，與事實相符。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施例對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

序列表

<110>吉林省凱博生物技術有限公司

<120>一種牛支原體環(huán)介導等溫擴增檢測方法及其應用

<130>2017-08-03

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2080

<212>dna

<213>牛支原體(mycoplasmabovis)

<400>1

atgagtaagaaaaataaattaatgattgggctttcatctactgctatcccgcttttagca60

gcagtgtctgctaagtgtggtggaactgtaaattatgaagatctaggaaaagatgcaaaa120

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