本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，更具體地，涉及用于診斷不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的血清lncrna標(biāo)志物、引物組及應(yīng)用和試劑盒。

背景技術(shù)：

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrentspontaneousabortion，rsa)是指臨床上連續(xù)2次或2次以上的孕20w前或胎兒體重不足500g的妊娠丟失，其發(fā)生率約占妊娠結(jié)局的1％～3％。rsa的病因極其復(fù)雜，目前已明確的病因有染色體異常、生殖解剖結(jié)構(gòu)異常、內(nèi)分泌失調(diào)、生殖系統(tǒng)感染、自身免疫和環(huán)境因素等，但臨床上仍有50％～60％的rsa找不到明確的病因，稱為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(unexplainedrecurrentspontaneousabortion，ursa)。有研究表明，胚胎發(fā)育異常與ursa密切相關(guān)。作為一種病理性妊娠，ursa對孕婦的生理及心理均產(chǎn)生不良影響，其病因和發(fā)病機制一直是國內(nèi)外生殖領(lǐng)域研究的熱點。

長鏈非編碼rna(longnon-codingrna，lncrna)通常是指長度大于200個核苷酸的非編碼rna轉(zhuǎn)錄本。近年來，lncrna在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后等多個層面上調(diào)控基因的表達(dá)，使其成為生命科學(xué)研究的一大焦點。人類基因組研究計劃的成果表明，在人類基因組序列中僅有1.5％的核酸序列用于蛋白質(zhì)編碼，而在占據(jù)人類基因組98.5％的非蛋白編碼序列中，絕大多數(shù)被轉(zhuǎn)錄成所謂的“長鏈非編碼rna”。盡管lncrna在序列上缺乏整體同源性，然而在其分子內(nèi)部，卻含有若干較為保守的局部區(qū)段，這些區(qū)域可能會和一些特異的蛋白因子發(fā)生相互作用，這些現(xiàn)象都提示了lncrna具有重要的生物學(xué)功能。

研究發(fā)現(xiàn)，lncrna的表達(dá)或功能異常與人類的疾病的發(fā)生密切相關(guān)，可以通過基因印記、細(xì)胞周期調(diào)控、剪接調(diào)控、翻譯調(diào)控、染色質(zhì)重塑和mrna降解等機制發(fā)揮作用。胚胎發(fā)育是有機體從其生命起始到成熟的復(fù)雜進(jìn)程，受一系列環(huán)境因素、遺傳因素和表觀遺傳修飾的調(diào)控。大量研究表明，lncrna作為關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄元件在胚胎發(fā)育和疾病發(fā)生過程中發(fā)揮重要的作用，可能是決定胚胎發(fā)育中基因時空表達(dá)的最早期分子之一，并且可能參與調(diào)控生長發(fā)育相關(guān)的基因。有研究報道，在生殖細(xì)胞的發(fā)育過程中，lncrna通過調(diào)控特定基因的開啟或關(guān)閉，在復(fù)雜的表觀遺傳過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。在胚胎干細(xì)胞方面，samir等發(fā)現(xiàn)lncrna及其靶基因可調(diào)控胚胎心臟發(fā)育，證實了lncrna在胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過程中也發(fā)揮一定作用。

研究發(fā)現(xiàn)血清中存在著上百種的lncrna，性質(zhì)相對穩(wěn)定、表達(dá)量豐富，特異性較高，且易于定量檢測。據(jù)報道，在肺癌、結(jié)腸癌等疾病中已經(jīng)證實血漿lnrna的表達(dá)譜對早期診斷有一定的提示作用，可作為這些疾病的潛在生物標(biāo)志物。因此，我們有理由相信，血清lncrna作為一類長鏈非編碼rna，其差異表達(dá)譜同樣也可以作為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)早期診斷的生物標(biāo)志物。

目前，臨床上關(guān)于將lncrna應(yīng)用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)輔助診斷的還未經(jīng)報道，若能篩選出復(fù)發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)的lncrna作為早期診斷的生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的診斷試劑盒，對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診斷現(xiàn)狀必將是一次有力的推動，也為其藥物篩選、藥效評價及靶向治療開辟了一條新的途徑。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供用于診斷不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的血清lncrna標(biāo)志物、引物組及應(yīng)用和試劑盒。所述試劑盒具有測定lncrna標(biāo)志物在血清中表達(dá)量的特異度和靈敏度。

本發(fā)明人通過分離和檢測復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病例和非醫(yī)學(xué)原因選擇流產(chǎn)對照血清中的lnrnas，發(fā)現(xiàn)了血清中存在可用于評估復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生風(fēng)險的特異性和敏感性的lncrna組合，從而提出了復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的血清lncrna標(biāo)志物組合，以及所述血清lncrna標(biāo)志物或其引物在制備復(fù)發(fā)性流產(chǎn)輔助診斷試劑中的應(yīng)用，研制出便于臨床應(yīng)用的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診斷試劑盒。

具體地，本發(fā)明的第一方面提供一組用于診斷不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的血清lncrna標(biāo)志物，所述血清lncrna標(biāo)志物包括：與seqidno：1所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第一lncrna、與seqidno：2所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第二lncrna、與seqidno：3所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第三lncrna、與seqidno：4所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第四lncrna、與seqidno：5所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第五lncrna和與seqidno：6所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第六lncrna。

優(yōu)選地，所述血清lncrna標(biāo)志物包括：與seqidno：1所示核苷酸序列具有95％以上同源性的第一lncrna、與seqidno：2所示核苷酸序列具有95％以上同源性的第二lncrna、與seqidno：3所示核苷酸序列具有95％以上同源性的第三lncrna、與seqidno：4所示核苷酸序列具有95％以上同源性的第四lncrna、與seqidno：5所示核苷酸序列具有95％以上同源性的第五lncrna和與seqidno：6所示核苷酸序列具有95％以上同源性的第六lncrna。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述血清lncrna標(biāo)志物包括：與seqidno：1所示核苷酸序列具有96％、97％、98％、99％以上同源性的第一lncrna、與seqidno：2所示核苷酸序列具有96％、97％、98％、99％以上同源性的第二lncrna、與seqidno：3所示核苷酸序列具有96％、97％、98％、99％以上同源性的第三lncrna、與seqidno：4所示核苷酸序列具有96％、97％、98％、99％以上同源性的第四lncrna、與seqidno：5所示核苷酸序列具有96％、97％、98％、99％以上同源性的第五lncrna和與seqidno：6所示核苷酸序列具有96％、97％、98％、99％以上同源性的第六lncrna。

最優(yōu)選地，所述血清lncrna標(biāo)志物包括：具有如seqidno：1所示核苷酸序列的第一lncrna(lnc-chac1-1)、具有如seqidno：2所示核苷酸序列的第二lncrna(lnc-fmn1-1)、具有如seqidno：3所示核苷酸序列的第三lncrna(lnc-tax1bp1-4)、具有如seqidno：4所示核苷酸序列的第四lncrna(lnc-c2cd4a-3)、具有如seqidno：5所示核苷酸序列的第五lncrna(lnc-ces1-1)和具有如seqidno：6所示核苷酸序列的第六lncrna(lnc-atf3-3)。

本發(fā)明的第二方面提供用于檢測上述的血清lncrna標(biāo)志物的引物組，所述引物組包括：

用于檢測第一lncrna的上游引物和下游引物；

用于檢測第二lncrna的上游引物和下游引物；

用于檢測第三lncrna的上游引物和下游引物；

用于檢測第四lncrna的上游引物和下游引物；

用于檢測第五lncrna的上游引物和下游引物；

用于檢測第六lncrna的上游引物和下游引物。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)常規(guī)手段設(shè)計上述引物，優(yōu)選地，

用于檢測第一lncrna的上游引物具有seqidno：7所示核苷酸序列，下游引物具有seqidno：8所示核苷酸序列；

用于檢測第二lncrna的上游引物具有seqidno：9所示核苷酸序列，下游引物具有seqidno：10所示核苷酸序列；

用于檢測第三lncrna的上游引物具有seqidno：11所示核苷酸序列，下游引物具有seqidno：12所示核苷酸序列；

用于檢測第四lncrna的上游引物具有seqidno：13所示核苷酸序列，下游引物具有seqidno：14所示核苷酸序列；

用于檢測第五lncrna的上游引物具有seqidno：15所示核苷酸序列，下游引物具有seqidno：16所示核苷酸序列；

用于檢測第六lncrna的上游引物具有seqidno：17所示核苷酸序列，下游引物具有seqidno：18所示核苷酸序列。

本發(fā)明的第三方面提供上述的血清lncrna標(biāo)志物和/或引物組在制備不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診斷或監(jiān)測試劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第四方面提供一種不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診斷或監(jiān)測試劑盒，該試劑盒包括上述的引物組。

所述試劑盒還可以包括內(nèi)參，以及相關(guān)pcr技術(shù)常用的其他試劑。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括：

(1)檢測gapdh的正反向引物；和/或

(2)dna聚合酶、pcr緩沖液、mgcl2、dntps、水和核酸染料中的至少一種。

本發(fā)明的優(yōu)越性在于：

(1)血清lncrna是新穎的生物標(biāo)志物，不僅穩(wěn)定、微創(chuàng)、易于檢測，而且定量精確，能大大提高復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診斷的敏感性和特異性。該類小分子非編碼rna生物標(biāo)志物的成功開發(fā)，顛覆了以蛋白為主的傳統(tǒng)生物標(biāo)志物的檢測方法，為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的防治開創(chuàng)全新局面，同時為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供借鑒。

(2)本發(fā)明提供的血清lncrna標(biāo)志物可用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)輔助診斷標(biāo)志物，通過微創(chuàng)方式對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)進(jìn)行早期輔助診斷，從而為臨床醫(yī)生進(jìn)一步深入檢查提供依據(jù)，達(dá)到快速準(zhǔn)確掌握患者的疾病狀態(tài)和病情嚴(yán)重程度的效果。同時，為下一步及時采取更具個性化的防治方案提供支持，延緩和阻止疾病進(jìn)展。

(3)本發(fā)明采用符合復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病例和非醫(yī)學(xué)原因選擇流產(chǎn)對照人群的樣本進(jìn)行驗證，證明所述幾種lncrna標(biāo)志物表達(dá)量存在顯著性差異并具有一定的穩(wěn)定性，以說明該標(biāo)志物具有特異性，可作為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)生物標(biāo)志物應(yīng)用。

(4)本發(fā)明采用嚴(yán)密、多階段的驗證和評價體系。第一階段，通過預(yù)實驗高通量測序篩選多種蛻膜組織差異lncrnas。第二階段，應(yīng)用qrt-pcr等方法對研究人群血清樣本進(jìn)行驗證和獨立人群驗證，采用分層評分系統(tǒng)對診斷結(jié)果進(jìn)行標(biāo)化。第三階段，在另一組獨立人群中對血清lncrna標(biāo)志物和診斷試劑盒進(jìn)行盲法評價，保證了該血清lncrna生物標(biāo)志物和診斷試劑盒的可靠性。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后具體實施方式部分予以詳細(xì)說明。

附圖說明

通過結(jié)合附圖對本發(fā)明示例性實施方式進(jìn)行更詳細(xì)的描述。

圖1為real-timepcr檢測lnc-chac1-1、lnc-fmn1-1、lnc-tax1bp1-4、lnc-c2cd4a-3、lnc-ces1-1、lnc-atf3-3在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)蛻膜組織樣本中的表達(dá)示意圖；

圖2為real-timepcr檢測lnc-chac1-1、lnc-fmn1-1、lnc-tax1bp1-4、lnc-c2cd4a-3、lnc-ces1-1、lnc-atf3-3在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)血清樣本中的表達(dá)示意圖；

圖3為個體血清lncrna表達(dá)水平波動性分析；縱軸均為血清lncrna表達(dá)量；

圖4為正常對照組和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病例組之間的roc曲線。

具體實施方式

下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。雖然以下描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，然而應(yīng)該理解，可以以各種形式實現(xiàn)本發(fā)明而不應(yīng)被這里闡述的實施方式所限制。

下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法，一般按照試劑商所建議的條件與步驟進(jìn)行。

實施例1：蛻膜組織lncrna篩選

1材料

1.1研究對象選擇和樣本采集

(1)根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)2次或2次以上的孕20周前或胎兒體重不足500g的妊娠丟失的孕婦為病例組；根據(jù)年齡、妊娠周數(shù)、bmi等指標(biāo)，以頻數(shù)匹配法選擇生育能力正常、非醫(yī)學(xué)原因選擇流產(chǎn)的孕婦(無流產(chǎn)征兆及體征，無流產(chǎn)史，且至少有一個正常小孩出生)為對照組。

(2)b超顯示無胚芽或無胎心搏動，且需排除因單基因遺傳病、多基因遺傳病、染色體異常以及基因突變等因素引發(fā)的流產(chǎn)。

(3)研究對象分組：

a組：非醫(yī)學(xué)原因選擇流產(chǎn)孕婦對照組(n＝63，3人測序篩選，30人一期驗證，30人獨立人群驗證)；

b組：不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦(n＝63，3人測序篩選，30人一期驗證，30人獨立人群驗證)。

(4)經(jīng)知情同意，樣本采集納入此次研究孕婦的血清和蛻膜組織。

注：bmi(即身體質(zhì)量指數(shù)，bodymassindex，簡稱bmi)，是體重公斤數(shù)與身高米數(shù)平方的比值，是目前國際上常用的衡量人體胖瘦程度以及是否健康的一項標(biāo)準(zhǔn)。

1.2試劑

trizoltmreagent購自美國invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(drr036a)購自日本takara公司。熒光實時(real-time)定量pct所用sybr試劑購自南京諾唯贊生物科技有限公司。所有引物由上海英駿(invitrogen)生物有限公司設(shè)計并合成。轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)分析工作由上海天昊生物科技有限公司完成。

2方法

選取3例不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病例和3例非醫(yī)學(xué)原因選擇流產(chǎn)對照樣本蛻膜組織，采用illuminahiseq2500高通量測序平臺完成轉(zhuǎn)錄本rna測序(雙向配對末端測序)。依據(jù)rna提取試劑(reagent)說明書的步驟提取蛻膜組織總rna。所提取的rna樣本經(jīng)過嚴(yán)格質(zhì)控后，采用去除rrna，富集剩余mrna，longnoncodingrna方法構(gòu)建測序文庫。對測序得到的原始數(shù)據(jù)(fastq格式)進(jìn)行接頭過濾和污染序列過濾，濾除質(zhì)量低和長度小于35bp的讀長(read)。進(jìn)而運用fastqc軟件對測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行整體評估，包括堿基的質(zhì)量值分布、讀長質(zhì)量、gc含量、pcr重復(fù)含量等。進(jìn)行質(zhì)控后，利用tophat軟件將讀長數(shù)據(jù)比對(mapping)到參考基因組(hg19版本)，去除無法mapping到基因組上的片段及重復(fù)片段，最終得到每個轉(zhuǎn)錄本的fpkm值。為了保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，選用兩種方法(cuffdiff和deseq)做lncrna差異表達(dá)分析，取二者交集作為最終結(jié)果。差異lncrna篩選標(biāo)準(zhǔn)為：foldchange>2或foldchange<0.5，fdr<0.05。再將篩選出的差異基因進(jìn)行基于kegg及go數(shù)據(jù)庫的基因通路注釋，得到基因參與的所有通路信號，采用基于超幾何分布(hypergeometricdistribution)的fisher檢驗計算每個通路的顯著性水平，多重比較校正后篩選出差異基因所體現(xiàn)的顯著性通路信號(fdr<0.05)。

3結(jié)果

通過cuffdiff和deseq兩種方法對差異lncrnas進(jìn)行篩選，取兩者的交集為最終結(jié)果。結(jié)合生物信息學(xué)分析，篩選出6條與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)的候選lncrna并進(jìn)行下一步驗證，具體為：lnc-chac1-1、lnc-fmn1-1、lnc-tax1bp1-4、lnc-c2cd4a-3、lnc-ces1-1、lnc-atf3-3。

實施例2：檢測lnc-chac1-1、lnc-fmn1-1、lnc-tax1bp1-4、lnc-c2cd4a-3、lnc-ces1-1、lnc-atf3-3在蛻膜組織中表達(dá)水平

1材料

1.1研究對象選擇和樣本采集

本實施例的研究對象選擇和樣本采集同實施例1。

1.2試劑

qpcr所用試劑同實施例1。

2方法

2.1提取總rna

以63例正常對照組和63例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病例組的蛻膜組織為對象。

(1)取50-100mg蛻膜組織于液氮中磨碎，加入1mltrizol，用勻漿超聲儀進(jìn)行勻漿處理，室溫(15～30℃)放置放置5min，使核酸蛋白酶完全分離。(2)每使用1mltrizol加入200μl氯仿，劇烈震蕩30s，冰上放置15-30min。(3)4℃，12000rpm離心15min，樣品分為3層：底層為紅色有機相，上層為無色水相和一個中間層，rna主要在水相中。(4)將水相轉(zhuǎn)移至新的去rna酶的1.5mlep管中，用與水相等體積的異丙醇沉淀水相中的rna，室溫放置10min后，-20℃沉淀過夜。(5)4℃，12000rpm離心15min，棄上清。(6)用1ml新鮮的75℅乙醇洗滌rna沉淀，4℃不超過7500g離心10min，棄上清，重復(fù)兩次。(7)室溫干燥rna沉淀至透明或半透明，加入200μldepc水，4℃放置2-3小時，使rna充分溶解，用nanodrop2000測定濃度。(8)提取的rna置于-70℃保存。

2.2逆轉(zhuǎn)錄合成cdna

取經(jīng)前處理的蛻膜組織rna，通過primescript^tmrtreagentkit(perfectrealtime)(takararr036a)試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cdna樣品。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時間設(shè)置：37℃孵育15分鐘，85℃孵育5秒鐘，即可獲得cdna。該cdna可用于后續(xù)lncrnasreal-timepcr檢測。

按下表所示配制反轉(zhuǎn)錄體系：

2.3引物設(shè)計

所有引物由上海英駿(invitrogen)生物有限公司設(shè)計并合成。具體引物序列如下表所示：

2.4實時定量pcr

檢測樣品中l(wèi)ncrnas表達(dá)水平使用如下體系：

按下列條件進(jìn)行qpcr反應(yīng)：預(yù)變性(1循環(huán))：95℃30s；循環(huán)反應(yīng)(40循環(huán))：95℃10s+60℃30s；溶解曲線(1循環(huán))：95℃15s+60℃1min+95℃15s。檢測并比較正常對照組和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病例組蛻膜組織中l(wèi)ncrna表達(dá)量的變化。分析引物的特異性及擴(kuò)增效率，根據(jù)溶解曲線判斷引物的反應(yīng)的特異性。依據(jù)擴(kuò)增曲線獲得ct值，采用相對量法與內(nèi)參gapdh進(jìn)行目的基因相對表達(dá)量的分析，可用方程2^–△ct計算lncrna相對表達(dá)量(△ct＝ctlncrna–ctgapdh)。

3結(jié)果

根據(jù)結(jié)果分析得出，lnc-chac1-1、lnc-fmn1-1、lnc-tax1bp1-4、lnc-c2cd4a-3、lnc-ces1-1、lnc-atf3-3這6條lncrna在兩組之間均有顯著差別(如圖1所示)。提示上述lncrnas可能參與調(diào)控復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生過程，具有應(yīng)用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)輔助診療的潛在可能。

實施例3：檢測lnc-chac1-1、lnc-fmn1-1、lnc-tax1bp1-4、lnc-c2cd4a-3、lnc-ces1-1、lnc-atf3-3在血清中表達(dá)水平

1材料

1.1研究對象選擇和樣本采集

本實施例的研究對象選擇和樣本采集同實施例1。

1.2試劑

qpcr所用試劑同實施例1。

2方法

2.1提取總rna

以63例正常對照組和63例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病例組的血清樣品為對象。

(1)取5ml新鮮肝素抗凝血于離心機3000rpm離心5min，取上清分裝至潔凈1.5mlep管中，每管100μl。(2)向ep管中加入900μltrizol，充分震蕩混勻后，4℃，12000rpm離心15min，立即取上清轉(zhuǎn)移至潔凈1.5mlep管中。(3)向ep管中加入1.5倍上清水相體積的無水乙醇，充分混勻后轉(zhuǎn)移至離心柱，10000rpm4℃離心15秒，棄下層廢液。(4)在離心柱上加入700μlrwt緩沖液(qiagenmirneasyminikit，貨號217004)，10000rpm4℃離心15秒，棄下層廢液。(5)在離心柱上加入500μlrpe緩沖液(qiagenmirneasyminikit，貨號217004)，10000rpm4℃離心15秒，棄下層廢液。此步驟重復(fù)一遍。(6)往離心柱加入一個新的2ml的管子，10000rpm4℃離心1分鐘，目的用于去除rpe緩沖液。(7)將離心柱安裝于一新的1.5ml的離心管中，同時在柱子上加入50μldepc處理的水，離心1分鐘。(8)-70℃保存處理后的樣本。

2.2逆轉(zhuǎn)錄合成cdna

取經(jīng)前處理的血清rna，通過primescript^tmrtreagentkit(perfectrealtime)(takararr036a)試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cdna樣品。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時間設(shè)置：37℃孵育15分鐘，85℃孵育5秒鐘，即可獲得cdna。該cdna可用于后續(xù)lncrnasreal-timepcr檢測。

按下表所示配制反轉(zhuǎn)錄體系：

2.3引物設(shè)計

所有引物由上海英駿(invitrogen)生物有限公司設(shè)計并合成。具體引物序列如表5所示：

表5

2.4實時定量pcr

檢測樣品中l(wèi)ncrnas表達(dá)水平使用如下體系：

按下列條件進(jìn)行qpcr反應(yīng)：預(yù)變性(1循環(huán))：95℃30s；循環(huán)反應(yīng)(40循環(huán))：95℃10s+60℃30s；溶解曲線(1循環(huán))：95℃15s+60℃1min+95℃15s。檢測并比較正常對照組和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病例組血清中l(wèi)ncrna表達(dá)量的變化。分析引物的特異性及擴(kuò)增效率，根據(jù)溶解曲線判斷引物的反應(yīng)的特異性。依據(jù)擴(kuò)增曲線獲得ct值，采用相對量法與內(nèi)參gapdh進(jìn)行目的基因相對表達(dá)量的分析，可用方程2^–△ct計算lncrna相對表達(dá)量(△ct＝ctlncrna–ctgapdh)。

3結(jié)果

根據(jù)結(jié)果分析得出，lnc-chac1-1、lnc-fmn1-1、lnc-tax1bp1-4、lnc-c2cd4a-3、lnc-ces1-1、lnc-atf3-3這6條lncrna在兩組之間均有顯著差別(如圖2所示)，并且與蛻膜組織中表達(dá)趨勢水平一致，進(jìn)一步驗證了上述lncrnas應(yīng)用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)輔助診療的可能性。

實施例4：個體血清lncrna表達(dá)量的穩(wěn)定性分析

1材料

1.1研究對象選擇和樣本采集

本實施例的研究對象選擇和樣本采集同實施例1。從中選取6名(3名對照組和3名復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病例組)成人，連續(xù)三次采集研究對象血清(間隔時間為1周，間隔期內(nèi)無疾病)作為樣本。

1.2試劑

qpcr所用試劑同實施例1。

2方法

采用實施例3的方法對6名(3名對照組和3名復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病例組)成人血清lncrna水平的穩(wěn)定性進(jìn)行評價。

3結(jié)果

血清中l(wèi)nc-chac1-1、lnc-fmn1-1、lnc-tax1bp1-4、lnc-c2cd4a-3、lnc-ces1-1、lnc-atf3-3這6條lncrna表達(dá)水平較穩(wěn)定(如圖3所示)。這些都提示了上述個體血清lncrna的表達(dá)量較為穩(wěn)定，具備作為診斷標(biāo)志物的特性。

實施例5：lncrna組合對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的判斷

根據(jù)上述qrt-pcr方法，本發(fā)明人通過對病例和對照組血清樣品的lncrnas表達(dá)水平的分析，以正常對照組lncrnas表達(dá)量的五分位數(shù)為閾值，對lnc-chac1-1、lnc-fmn1-1、lnc-tax1bp1-4、lnc-c2cd4a-3、lnc-ces1-1、lnc-atf3-3進(jìn)行評分，進(jìn)一步求得總得分，以此繪制roc曲線來評估預(yù)測的靈敏性和特異性，進(jìn)而評估這6條lncrnas表達(dá)水平對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的評估能力。roc分析結(jié)果顯示，lnc-chac1-1、lnc-fmn1-1、lnc-tax1bp1-4、lnc-c2cd4a-3、lnc-ces1-1、lnc-atf3-3以73.7％的auc(roc曲線下面積)將正常對照組和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病例組分開(如圖4所示)，最佳臨界點的敏感度＝0.796，特異度＝0.621。

上述一系列研究結(jié)果證明了采用lnc-chac1-1、lnc-fmn1-1、lnc-tax1bp1-4、lnc-c2cd4a-3、lnc-ces1-1、lnc-atf3-3能夠很好地將復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病例和正常對照組分開，從而證明了血清中l(wèi)nc-chac1-1、lnc-fmn1-1、lnc-tax1bp1-4、lnc-c2cd4a-3、lnc-ces1-1、lnc-atf3-3是輔助診斷復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的有效、穩(wěn)定的生物標(biāo)志物。

實施例6：用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)監(jiān)測和風(fēng)險評估的lncrna診斷試劑盒的制作

本發(fā)明人提出的該lncrna試劑盒的制作工藝和操作流程主要基于上述qrt-pcr技術(shù)。首先通過rna測序的方法篩選出對照組和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病例組具有差異的lncrna，并用qrt-pcr方法驗證兩組中差異的候選lncrna。結(jié)合生物信息學(xué)，最后篩選出對應(yīng)的血清lncrna的數(shù)量控制在6條，以此作為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)監(jiān)測和風(fēng)險評估的指標(biāo)，這是在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上做出的最優(yōu)化的精簡。

此試劑盒包括一批血清lncrna引物，其中l(wèi)ncrna的引物主要包括lnc-chac1-1、lnc-fmn1-1、lnc-tax1bp1-4、lnc-c2cd4a-3、lnc-ces1-1、lnc-atf3-3和gapdh的正反向引物。同時，還包括pcr技術(shù)常用的相關(guān)試劑，如depc水、pcr緩沖液、rox染料等試劑，這些試劑均可采用相應(yīng)的市售產(chǎn)品。本發(fā)明試劑盒的價值在于只需要一次提供少量血液(2ml)，即可檢測血清lncrna生物標(biāo)志物的變化趨勢，再通過該變化趨勢來預(yù)測復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生的可能性，并易于進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測。

以上已經(jīng)描述了本發(fā)明的各實施例，上述說明是示例性的，并非窮盡性的，并且也不限于所披露的各實施例。在不偏離所說明的各實施例的范圍和精神的情況下，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說許多修改和變更都是顯而易見的。