本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，尤其是涉及一種結(jié)直腸癌slfn11基因甲基化預(yù)后檢測(cè)引物組及試劑盒。
背景技術(shù)：
：結(jié)直腸癌(crc)是常見的消化道惡性腫瘤，占胃腸道腫瘤的第二位。好發(fā)部位為直腸及直腸與乙狀結(jié)腸交界處，占60％。發(fā)病多在40歲以后，男女之比為2:1。大腸癌的治療以手術(shù)切除癌腫為首選，輔之以放射治療、化療藥物治療及中醫(yī)藥治療等；最近不少學(xué)者對(duì)早期大腸癌采用經(jīng)內(nèi)鏡下切除治療，也取得較好療效。大腸癌根治術(shù)后，仍有50％的病例復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，因此術(shù)前、術(shù)后化療有可能提高根治術(shù)后5年生存率。抗癌藥物首選氟脲嘧啶，其次為絲裂霉素和阿霉素。dna損傷修復(fù)和檢查點(diǎn)控制缺陷可能導(dǎo)致基因突變和染色體不穩(wěn)定，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。家族性腺瘤息肉病和林奇綜合癥，這是由基因突變引起的dna錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)，占所有crc不到5％。dna損傷修復(fù)基因的異常甲基化變化是crc發(fā)展的一個(gè)重要機(jī)制。slfn基因產(chǎn)物已被證明參與細(xì)胞生物過程包括增殖、分化和免疫功能。slfn11通過使得同源重組修復(fù)的中間產(chǎn)物rpa-ssdna的不穩(wěn)定，抑制同源重組修復(fù)和細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)的持續(xù)激活，進(jìn)而使得腫瘤細(xì)胞對(duì)基于誘導(dǎo)dna損傷的化療藥物十分敏感，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡。由于slfn11在不同腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量有很大差異，因此對(duì)不同病人腫瘤中slfn11的表達(dá)量進(jìn)行前期檢測(cè)將對(duì)確定不同病人的特定治療方案，采取更加精準(zhǔn)的醫(yī)療手段起到重要的臨床意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明旨在提出一種結(jié)直腸癌slfn11基因甲基化預(yù)后檢測(cè)引物組及試劑盒，以解決現(xiàn)有的技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)直腸癌slfn11基因甲基化預(yù)后的檢測(cè)的問題。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種結(jié)直腸癌slfn11基因甲基化預(yù)后檢測(cè)引物組，包括m-forward、m-reverse引物對(duì)及u-forward、u-reverse引物對(duì)；m-forward的堿基序列如seqidno：1所示，m-forward的堿基序列如seqidno：2所示，u-forward的堿基序列如seqidno：3所示，u-reverse的堿基序列如seqidno：4所示。甲基化是在dna甲基轉(zhuǎn)移酶(dnamethyltransferase，dnmt)催化作用下，利用s-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine，sam)提供甲基，在cpg二核苷酸中胞嘧啶嘧啶環(huán)的5號(hào)碳原子上加上甲基的共價(jià)修飾過程。dna甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式，它不改變dna的一級(jí)結(jié)構(gòu)，卻在細(xì)胞的發(fā)育、基因表達(dá)及基因組的穩(wěn)定性中起著重要的作用。甲基化特異性的pcr(methylation-specificpcr，msp)，用亞硫酸氫鹽處理基因組dna，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨后設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行pcr。如果用針對(duì)處理后甲基化dna鏈的引物能得到擴(kuò)增片段，則說明該位點(diǎn)存在甲基化；反之，說明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在甲基化。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所述的引物組具有以下優(yōu)勢(shì)：本發(fā)明所述的引物組能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)處理后甲基化dna鏈進(jìn)行擴(kuò)增進(jìn)而得到擴(kuò)增片段，進(jìn)而能夠判定該位點(diǎn)是否存在甲基化，對(duì)確定不同病人的特定治療方案，采取更加精準(zhǔn)的醫(yī)療手段起到重要的臨床意義。上述引物組在制備用于檢測(cè)結(jié)直腸癌slfn11基因甲基化狀態(tài)的試劑中的應(yīng)用。一種結(jié)直腸癌slfn11基因甲基化預(yù)后檢測(cè)試劑盒，包含以下任意一種或多種：1)seqidno：1～seqidno：4；2)seqidno：1～seqidno：4所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈；3)與seqidno：1～seqidno：4所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列。使用上述引物組或試劑盒進(jìn)行pcr時(shí)，其特征在于：反應(yīng)體系如下：反應(yīng)流程如下：使用上述引物組或試劑盒檢測(cè)對(duì)順鉑敏感性的方法，包括如下步驟：s1：從樣品中提取dna；s2：對(duì)步驟s1中的dna進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理；s3：msp反應(yīng)即使用權(quán)利要求1提供的引物對(duì)s2中得到的dna進(jìn)行擴(kuò)增；s4：將msp反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，查看電泳結(jié)果。進(jìn)一步的，msp反應(yīng)的反應(yīng)體系及反應(yīng)流程如下：反應(yīng)體系：反應(yīng)流程：步驟s4中當(dāng)檢測(cè)得到擴(kuò)增片段說明slfn11基因位點(diǎn)存在甲基化，即對(duì)順鉑不敏感；反之，步驟s4中當(dāng)檢測(cè)不到擴(kuò)增片段說明被檢測(cè)的slfn11基因位點(diǎn)不存在甲基化，對(duì)順鉑敏感。上述結(jié)直腸癌slfn11基因甲基化預(yù)后檢測(cè)引物組具有益之處本結(jié)直腸癌slfn11基因甲基化預(yù)后檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)對(duì)順鉑敏感性的方法也一應(yīng)具有，在此不一一贅述。附圖說明圖1為電泳結(jié)果示意圖。具體實(shí)施方式除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。其中：m-forward、m-reverse、u-forward、u-reverse均由我公司設(shè)計(jì)并交由蘇州金唯智生物科技有限公司采用現(xiàn)有方法合成；當(dāng)然m-forward、m-reverse、u-forward、u-reverse也可采用其他現(xiàn)有方法合成。下面結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。一種結(jié)直腸癌slfn11基因甲基化預(yù)后檢測(cè)引物組，包括m-forward、m-reverse引物對(duì)及u-forward、u-reverse引物對(duì)；m-forward的堿基序列如seqidno：1所示，m-forward的堿基序列如seqidno：2所示，u-forward的堿基序列如seqidno：3所示，u-reverse的堿基序列如seqidno：4所示。使用上述引物組檢測(cè)對(duì)順鉑敏感性的方法，包括如下步驟：s1：從樣品中提取dna。采用常規(guī)現(xiàn)有方法即可。本實(shí)例中從樣品中提取dna具體為(1)取保存于-70℃癌組織的組織，用手術(shù)刀片將組織切下，確定組織量，不多于25mg；(2)將25mg組織切成小塊，放入1.5ml離心管中，加入180μlbuferatl；(3)加入20μlproteinasek，震蕩混勻，56℃孵育直到組織完全裂解；(4)短暫離心5s；(5)加入200μlbuferal，震蕩混勻15s，70℃孵育10min，短暫離心5s；(6)加入200μl無水乙醇，震蕩混勻15s，短暫離心5s；(7)將上述液體轉(zhuǎn)入qiaampminispincolumn，8000rpm離心1min，棄廢液；(8)加入500μlbufferaw1，8000rpm離心1min，棄廢液；(9)加入500μlbufferaw2，14000rpm離心3min，棄廢液；(10)全速離心1min；(11)將qiaampminispincolumn放入新的1.5ml離心管中，室溫放置1min晾干，加入200μlbufferae，室溫放置1min，8000rpm離心1min；(12)重復(fù)步驟(11)，檢測(cè)dna濃度。上述短暫離心的速度為：8000rpm，全速離心的速度為：12000rpm。s2：對(duì)步驟s1中的dna進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理。采用常規(guī)現(xiàn)有方法即可。本實(shí)例對(duì)步驟s1中的dna進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理具體為(1)解凍亞硫酸氫鹽反應(yīng)所需的dna；加入800μlrnase-free的水溶解所需的亞硫酸氫鹽，充分震蕩混勻，直到完全溶解；亞硫酸氫鹽優(yōu)選為亞硫酸氫鈉(本實(shí)例中亞硫酸氫鈉濃度為3.6mol/l)。(2)按表1配制反應(yīng)液，加到200μlpcr管中；表1componentvolumeperreaction(μl)dnasolution(1ng–2μg)variable*(maximum20μl)rnase-freewatervariable*bisulfitemix(dissolved),seestep185dnaprotectbuffer35totalvolume140其中dnasolution(1ng–2μg)variable*(maximum20μl)是指dnasolution的添加量可變，但是最多為20μl，且里面dna的含量在1ng–2μg；(3)蓋上管蓋，亞硫酸氫鹽充分反應(yīng)，室溫放置；(4)使用pcr儀進(jìn)行亞硫酸氫鹽dna的轉(zhuǎn)換，按表2設(shè)置程序；表2(5)將pcr管放置在pcr儀上，進(jìn)行上述反應(yīng)；(6)反應(yīng)完成后，短暫離心5s，轉(zhuǎn)入到新的1.5ml離心管中；(7)加入560μl包含10μg/mlcarrierrna的bufferbl到每個(gè)樣本中。震蕩混勻，離心5s；(8)將上述液體轉(zhuǎn)入到epitectspincolumn中；(9)全速離心1min，棄廢液；(10)加入500μlbufferbw，全速離心1min，棄廢液；(11)加入500μllbufferbd，室溫下放置15min；(12)全速離心1min，棄廢液；(13)加入500μlbufferbw，全速離心1min，棄廢液；(14)重復(fù)步驟(13)1次；(15)全速離心1min；(16)將spincolumn放入新的1.5ml離心管中，開蓋56℃孵育5min；(17)將spincolumn放入新的1.5ml離心管中，加入20μlbuffereb,12000rpm離心1min。本實(shí)例中全速離心速度為：12000rpm；短暫離心速度為：8000rpms3：msp反應(yīng)即使用權(quán)利要求1提供的引物對(duì)s2中得到的dna進(jìn)行擴(kuò)增。(1)選擇基因：slfn11。(2)slfn11的引物序列如表3所示。表3(3)msp反應(yīng)體系及流程反應(yīng)體系如表4所示：表4其中eachprimer1μl(10um)即seqidno：1～seqidno：4分別加入1μl(10um)。eachdatp，dctp，dgtpanddttp2μl(2.5mm)即datp，dctp，dgtpanddttp分別加入2μl(2.5mm)。反應(yīng)流程如表5所示：表5s4：將msp反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，查看電泳結(jié)果。電泳結(jié)果如圖1所示，當(dāng)出現(xiàn)m時(shí)說明：slfn11存在甲基化，相應(yīng)的基體對(duì)順鉑不敏感；當(dāng)出現(xiàn)u時(shí)說明：slfn11為非甲基化，相應(yīng)的基體對(duì)順鉑敏感。既m為slfn11基因甲基化，u為slfn11基因未甲基化。若slfn11基因甲基化，則m處顯示條帶，患者對(duì)順鉑不敏感；若slfn11基因沒有發(fā)生，則m處不顯示條帶，患者對(duì)順鉑敏感。采用本申請(qǐng)?zhí)峁┑囊餀z測(cè)的靈敏度81.7％，特異性69.3％，檢測(cè)準(zhǔn)確度達(dá)99％。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表<110>天津艾至恩醫(yī)療科技有限公司<120>一種結(jié)直腸癌slfn11基因甲基化預(yù)后檢測(cè)引物組及試劑盒<130>azeyl1702<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1attattagtagcgtgacggttatc24<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cgacaaatatacaaattaaaccgcg25<210>3<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tatattattagtagtgtgatggttatt27<210>4<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4atacaacaaatatacaaattaaaccaca28當(dāng)前第1頁12