本發(fā)明涉及植物保護和分子生物學檢測技術(shù)領域，具體地說，涉及水稻細菌性條斑病菌數(shù)字pcr檢測方法。

背景技術(shù)：

水稻細菌性條斑病菌(xanthomonasoryzaepv.oryzicola)，是一種黃單胞桿菌科、黃單胞桿菌屬的細菌，可侵染稻屬(oryzasp.)的多個種和茭白(zizaniaaquatica)。1990年，swings等命名該種為水稻黃單胞條斑病致病變種x.oryzaepv.oryzicola。該病最早于1918年發(fā)生在菲律賓，目前主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，如菲律賓、泰國、印度、巴基斯坦、印度尼西亞、孟加拉、塞內(nèi)加爾、尼日利亞、柬埔寨、越南、馬來西亞、毛利塔尼亞、中國、澳大利亞、尼泊爾、哥倫比亞、馬達加斯加、斯里蘭卡和喀麥隆；從地區(qū)分布來看，主要集中在亞洲和非洲。我國主要分布在南方省區(qū)，如廣東、廣西、海南、貴州、云南、四川、福建、浙江、江西、湖南、湖北、安徽和江蘇。該病主要危害植株葉片，對產(chǎn)量影響較大，能夠引起減產(chǎn)10％～20％，甚至可達40.16％，給水稻生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失。

目前，針對水稻細菌性條斑病菌的檢測方法主要有包括育苗生長觀察法、直接分離法、致病性測定等的傳統(tǒng)檢測法、血清檢測法和pcr檢測法。傳統(tǒng)檢測法步驟復雜、耗時長，已不能適應快速檢測的需要。血清檢測法中以elisa應用最廣泛，可以在短時間內(nèi)檢測大量樣品，但不同菌株的抗體不容易獲得、反應過程中的交叉反應,易引起假陽性或假陰性現(xiàn)象的問題。pcr檢測技術(shù)能快速、有效的從水稻種子樣品上檢測出水稻細菌性條斑病菌，無論對國內(nèi)植物檢疫還是對保證我國水稻種子及稻米的出口均有重要意義，目前己有多種不同的pcr檢測技術(shù)應用于條斑病菌的檢測與鑒定，但對部分帶菌率不高的樣品卻不能做出可靠的診斷，引起假陰性結(jié)果。

數(shù)字pcr(digital-pcr)是一種新型的pcr檢測方法，其工作原理在于將dna或cdna樣品分割為許多單獨、平行的pcr反應，部分這些反應包含了靶標分子(陽性)，而其他不包含(陰性)。單個分子可以被擴增一百萬倍或更多，能夠提高現(xiàn)有taqman測定的性能，從而實現(xiàn)更高的靈敏度、準確度，避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用數(shù)字pcr檢測水稻細菌性條斑病菌的方法及試劑盒。

本發(fā)明所提供的檢測水稻細菌性條斑病菌的特異性引物對和特異性探針組合，所述引物對由上游引物xoc163f和下游引物xoc163r組成。所述上游引物、下游引物和特異性探針序列如下：

上游引物xoc163f：5′-gtgttgacccgcgccctgttctg-3′(seqidno.1)

下游引物xoc163r：5′-cgacgacgacggcaagtgagtgac-3′(seqidno.2)

特異性探針xoc163p：5’-fam-tttcaaagggcagggctatctgct-tamra-3’(seqidno.3)

本發(fā)明進一步提供水稻細菌性條斑病菌的數(shù)字pcr檢測方法，包括如下步驟：

(1)提取待測樣品的基因組dna；

(2)以提取的基因組dna為模板，利用所述的引物對和特異性探針組合，進行數(shù)字pcr擴增反應；

(3)檢測pcr擴增產(chǎn)物。

本領域技術(shù)人員可以采用本發(fā)明的引物對和探針選用適宜的pcr進行檢測。優(yōu)選地，本發(fā)明選擇數(shù)字pcr進行擴增。

上述步驟(2)中，所述“進行數(shù)字pcr”的反應體系具體為體系2。

體系1為：10μl2×supermix，1μl上游引物xoc163f(10um)，1ul下游引物xoc163r(10um)，0.5μl特異性探針xoc163p(10um)，2μl基因組dna，ddh2o補足至20μl。該體系為預混液體系。

體系2為：體系1與70ul數(shù)字pcr反應用油在微滴生成器上制備的反應微滴體系。

上文中，所述2×supermix和所述數(shù)字pcr反應用油均可為美國伯樂bio-rad公司的產(chǎn)品。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中數(shù)字pcr擴增反應的程序為：95℃預變性10min；95℃變性10s，67℃退火及延伸60s，共40個循環(huán)；98℃固化微滴10min。

上述步驟(3)中檢測pcr擴增產(chǎn)物具體如下：

出現(xiàn)明顯區(qū)別于陰性反應孔(陰性反應孔中基因組dna為2μlddh2o代替)的擴增信號，將該反應孔記為陽性擴增孔，表明待測樣品基因組中攜帶水稻細菌性條斑病菌。

針對水稻細菌性條斑病菌設計檢測該病菌的特異性引物和探針，并基于該特異性引物和探針建立了利用數(shù)字檢測水稻細菌性條斑病菌的方法。實驗證明,采用本發(fā)明所提供的方法數(shù)字檢測水稻細菌性條斑病菌，特異性好(可從水稻細菌性條斑病菌(xanthomonasoryzaepv.oryzicola)、水稻白葉枯病菌(xanthomonasoryzaepv.oryzae)、柑橘潰瘍病菌(xanthomonasaxonopodispv.citri)、辣椒細菌性斑點病菌(xanthomonasaxonopodispv.vesicatoria)、水稻細菌性谷枯病菌(burkholderiaglumae)、燕麥噬酸菌燕麥致病變種(acidovoraxavenaesubsp.avenae)、成團泛菌(pantoeaagglomerans)中準確鑒定出x.oryzaepv.oryzicola)，且靈敏度高(在20ul反應體系中，靈敏度可達10拷貝)，適用于水稻細菌性條斑病菌含量低的水稻種子樣品的檢測，具有重要的應用價值。

附圖說明

圖1為實施例3的特異性實驗結(jié)果。a04通道x.oryzaepv.oryzicola產(chǎn)生陽性微滴，其它菌株和空白對照均不產(chǎn)生陽性微滴，即僅x.oryzaepv.oryzicola菌株的檢測結(jié)果為陽性。

圖2為實施例4的靈敏度實驗結(jié)果。a11、b11、c11、d11、e11和f11中均產(chǎn)生陽性微滴，且陽性微滴數(shù)按梯度逐漸遞減，根據(jù)數(shù)值分析f11的20ul體系中的反應數(shù)10拷貝，g11和h11均不產(chǎn)生陽性微滴。

圖3為實施例5中檢測水稻種子實驗結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中使用菌株x.oryzaepv.oryzicola(ncppb1151)、x.oryzaepv.oryzae(ncppb1153)、x.axonopodispv.citri(ncppb3607)、x.axonopodispv.vesicatoria(ncppb2594)、b.glumae(ncppb2391)、a.avenaesubsp.avenae(ncppb522)、p.agglomerans(ncppb179)保藏于nationalcollectionofplantpathogenicbacteria(簡稱ncppb，網(wǎng)址為：http://ncppb.fera.defra.gov.uk/)，公眾可以從該集存庫獲得。健康水稻種子購自安徽華韻生物科技有限公司，帶菌水稻種子由安徽出入境檢驗檢疫局提供。數(shù)字pcr相關反應試劑耗材和bio-rad數(shù)字反應系統(tǒng)(bio-radqx200)均為美國bio-rad公司的產(chǎn)品，數(shù)字pcr相關反應試劑耗材包括2×supermix、數(shù)字pcr微滴生成卡和數(shù)字pcr反應用油；bio-rad數(shù)字pcr反應系統(tǒng)(bio-radqx200)包括dropletgenerator微滴生成器和dropletreader微滴讀取儀。pcr儀購自美國abi公司(型號：96-wellthermalcycler9902)。植物基因組dna提取試劑盒(目錄號：dp305-02)，購自天根生化科技(北京)有限公司。細菌基因組dna提取試劑盒(目錄號：dp302-02)，購自天根生化科技(北京)有限公司。

實施例1用于水稻細菌性條斑病菌數(shù)字pcr檢測的引物對和特異性探針組合的設計

根據(jù)水稻細菌性條斑病菌假定的膜蛋白基因設計了如下用于水稻細菌性條斑病菌數(shù)字pcr檢測的3個引物對和特異性探針組合：

上游引物xoc163f：5′-gtgttgacccgcgccctgttctg-3′

下游引物xoc163r：5′-cgacgacgacggcaagtgagtgac-3′

特異性探針xoc163p：5’-fam-tttcaaagggcagggctatctgct-tamra-3’

探針xoc163p的5’末端具有fam熒光標記，3’末端具有tamra熒光標記。

上游引物xoc163f：5′-gtgttgacccgcgccctgttctg-3′

下游引物xoc163r：5′-cgacgacgacggcaagtgagtgac-3′

特異性探針xoc163p2：5’-fam-ctatctgctgattccggcaaatgt-tamra-3’

探針xoc163p2的5’末端具有fam熒光標記，3’末端具有tamra熒光標記。

上游引物xoclf：5′-ggcgtggccaaggcc-3′

下游引物xoclr：5′-gacggccacgaccttgac-3′

特異性探針xoclp：5’-fam-cgccgaagaagtcgaaggcgaggcgc-tamra-3’

探針xoclp的5’末端具有fam熒光標記，3’末端具有tamra熒光標記。

經(jīng)實驗篩選，僅引物對xoc163f/xoc163r及探針xoc163p組合具有較好的特異性。

實施例2水稻細菌性條斑病菌數(shù)字pcr檢測方法的建立

1、配制反應體系反應體系20ul，由2×supermix10ul、引物xoc163f1ul、引物xoc163r1ul、探針xoc163p0.5ul、待測樣品的基因組dna2ul和ddh2o5.5ul，空白對照中的基因組dna用ddh2o代替。

2、完成步驟1后，將反應體系轉(zhuǎn)移至數(shù)字pcr微滴生成卡的體系加樣孔中，并在反應用油加樣孔中加入70ul的數(shù)字pcr反應用油，將數(shù)字pcr微滴生成卡轉(zhuǎn)移至dropletgenerator微滴生成器中，啟動儀器，得到微滴體系。

3、完成步驟2后，將所述微滴體系轉(zhuǎn)移至96孔板中，封膜；

4、完成步驟3后，將所述96孔板置于pcr儀中，進行pcr擴增反應，反應程序：95℃預變性10min；95℃變性10s，67℃退火及延伸60s，共40個循環(huán)；98℃固化微滴10min。

5、完成步驟4后，將所述96孔板取出,置于dropletreader微滴讀取儀中進行微滴熒光讀取，然后通過fam單通道熒光收集單個微滴熒光信號。

6、完成步驟5后，儀器通過分析散點圖確定熒光閾值限并自動確定陰性微滴和陽性微滴。然后進行如下判斷：如果待測樣品產(chǎn)生陽性微滴信號，則待測樣品含有水稻細菌性條斑病菌；如果待測樣品不產(chǎn)生陽性微滴信號，則待測樣品不含有水稻細菌性條斑病菌。

實施例3按照實施例2建立的方法進行特異性檢測

用細菌基因組dna提取試劑盒提取從ncppb集存庫獲得的7種菌株的基因組dna。

按照實施例2方法，進行特異性檢測。實驗結(jié)果見圖1(a04為x.oryzaepv.oryzicola，b04為x.oryzaepv.oryzae，c04為x.axonopodispv.citri，d04為x.axonopodispv.vesicatoria，e04為b.glumae，f04為a.avenaesubsp.avenae，g04為p.agglomerans，h04為空白對照)。結(jié)果表明，僅x.oryzaepv.oryzicola產(chǎn)生陽性微滴，其它菌株和空白對照均不產(chǎn)生陽性微滴(此時作為判定的閾值為5928，低于閾值的微滴儀器判斷為陰性，高于閾值的微滴儀器判斷為陽性)。因此，僅x.oryzaepv.oryzicola菌株的檢測結(jié)果為陽性，與預期結(jié)果完全一致。

上述結(jié)果表明，實施例1所提供的檢測水稻細菌性條斑病菌的成套試劑的特異性高。

實施例4按照實施例2建立的方法進行靈敏度檢測

1、用細菌基因組dna提取試劑盒提取x.oryzaepv.oryzicola菌株的基因組dna，初始基因組dna命名為稀釋液i(稀釋度記為10°)。

2、完成步驟1后，取1體積份稀釋液i，加入9體積份的ddh2o，混合均勻，得到稀釋液ii(稀釋度記10^-1)，以此類推制成稀釋液iii(稀釋度記10^-2)、稀釋液iv(稀釋度記10^-3)、稀釋液v(稀釋度記10^-4)、稀釋液vi(稀釋度記10^-5)、稀釋液vii(稀釋度記10^-6)、稀釋液viii(稀釋度記10^-7)。

3、完成步驟2后，按照實施例2步驟2的方法，進行靈敏度檢測。待測樣品的dna模板為步驟2制備的稀釋液ii、稀釋液iii、稀釋液iv、稀釋液v、稀釋液vi、稀釋液vii、稀釋液viii。

4、實驗結(jié)果見圖2(a11為稀釋液ii、b11為稀釋液iii、c11為稀釋液iv、d11為稀釋液v、e11為稀釋液vi、f11為稀釋液vii、g11為稀釋液viii、h11為空白對照)。結(jié)果表明，稀釋液ii、稀釋液iii、稀釋液iv、稀釋液v、稀釋液vi和稀釋液vii中均產(chǎn)生陽性微滴，稀釋液viii和空白對照均不產(chǎn)生陽性微滴(此時作為判定的閾值為965，低于閾值的微滴儀器判斷為陰性，高于閾值的微滴儀器判斷為陽性)。根據(jù)數(shù)值分析，實施例1所提供的檢測水稻細菌性條斑病菌的試劑在上述20ul反應體系中的靈敏度10拷貝。

實施例5按照實施例2建立的方法進行水稻種子檢測

采用實施例2建立的方法分別檢測帶菌水稻種子樣品及健康水稻種子樣品。

1、水稻種子樣品dna的提?。悍Q取20g待測樣品，置于滅菌的50ml離心管中，加無菌水至淹沒待測樣品，4℃過夜，取浸泡液12000rpm離心5min，收集沉淀利用植物基因組dna提取試劑盒按照操作說明進行樣品dna提取。

2、按照實施例2方法，進行水稻種子檢測。實驗結(jié)果見圖3(a10為帶菌水稻種子樣品，b10為健康水稻種子樣品，c10為空白對照)。結(jié)果表明，僅a10帶菌水稻種子樣品產(chǎn)生陽性微滴，健康水稻種子樣品和空白對照均不產(chǎn)生陽性微滴(此時作為判定的閾值為914，低于閾值的微滴儀器判斷為陰性，高于閾值的微滴儀器判斷為陽性)。因此，帶菌水稻種子檢測結(jié)果為陽性，健康水稻種子樣品檢測結(jié)果為陰性，與預期結(jié)果完全一致，見圖3。

上述結(jié)果表明，實施例1所提供的檢測水稻細菌性條斑病菌的特異性引物和探針的特異性高，適用于水稻種子樣品的檢測。

sequencelisting

<110>安徽出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心中國檢驗檢疫科學研究院中華人民共和國張家港出入境檢驗檢疫局

<120>一種利用數(shù)字pcr檢測水稻細菌性條斑病菌的方法及試劑盒

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