本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及遺傳育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體涉及用于獼猴桃磨山系列雄性品種鑒定的分子標(biāo)記geo101引物及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：近年來，我國(guó)獼猴桃產(chǎn)業(yè)穩(wěn)步擴(kuò)增，截至2016年全國(guó)栽培面積達(dá)220萬畝，產(chǎn)量260萬噸，產(chǎn)值超過200億元。獼猴桃屬于雌雄異株類型，即雌花中花粉敗育，而雄花中子房發(fā)育不完全且胚珠敗育。因此，在獼猴桃育種及商業(yè)果園栽培中，通常需選擇優(yōu)良雄株的花粉，進(jìn)行異花授粉，才能實(shí)現(xiàn)獼猴桃結(jié)實(shí)。近年來，中國(guó)科學(xué)院武漢植物園選育的‘磨山’雄性系列獼猴桃品種(即‘磨山雄1號(hào)’、‘磨山雄2號(hào)’、‘磨山雄3號(hào)’、‘磨山4號(hào)’和‘磨山雄5號(hào)’)，具有花期覆蓋廣、花量大、花粉萌發(fā)率高等特點(diǎn)，已成為多個(gè)優(yōu)異獼猴桃品種的配套授粉雄株。例如‘磨山雄2號(hào)’獼猴桃不僅能給早花期和中花期的中華獼猴桃授粉，而且能促進(jìn)紅心系列獼猴桃果實(shí)品質(zhì)改善，增加內(nèi)果皮紅色積累。目前，對(duì)‘磨山’系列品種的鑒定僅通過樹勢(shì)、葉片形態(tài)、花期和花形態(tài)等傳統(tǒng)手段，難免受到環(huán)境和其他人為因素的影響。對(duì)‘磨山’系列品種鑒定的不確定性，給獼猴桃育種工作造成較大的困難，且混雜或者錯(cuò)誤的雄性品種也必定會(huì)影響果實(shí)生產(chǎn)和果品質(zhì)量。分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用為品種鑒定提供了客觀和準(zhǔn)確的手段。分子標(biāo)記技術(shù)通過檢測(cè)生物個(gè)體在基因組上產(chǎn)生的變異，從而對(duì)不同個(gè)體進(jìn)行區(qū)分，是繼形態(tài)標(biāo)記和生化標(biāo)記之后，發(fā)展的一種較為理想的遺傳標(biāo)記。在植物種質(zhì)資源鑒定及育種中，對(duì)分子標(biāo)記的應(yīng)用已日趨成熟。rapd分子標(biāo)記多態(tài)頻率高、特異性強(qiáng)，廣泛用于小麥、水稻和玉米等禾本科植物的種質(zhì)鑒定。ssr分子標(biāo)記等位變異高且穩(wěn)定性好，已應(yīng)用于大豆、蘋果和葡萄等資源鑒定研究。snp分子標(biāo)記多態(tài)性高且分布廣，適合進(jìn)行品種鑒定和分類研究。在獼猴桃中，已開發(fā)snp分子標(biāo)記對(duì)獼猴桃糖、酸以及果實(shí)大小等重要農(nóng)藝性狀進(jìn)行分子輔助育種。然而，對(duì)獼猴桃雄性系列品種的分子標(biāo)記鑒定研究尚未開展。開發(fā)適用于雄性獼猴桃品種的分子鑒定標(biāo)記，能有針對(duì)性的選配雜交父本，有利于提高對(duì)獼猴桃的育種效率，提升獼猴桃產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于利用分子標(biāo)記技術(shù)，提供一種用于獼猴桃磨山系列雄性品種鑒定的分子標(biāo)記geo101引物，所述的分子標(biāo)記命名為geo101，針對(duì)其設(shè)計(jì)的引物為geo101-f:agcatcgacagttcagttgg和geo101-r:gcagttgaatcttgccatca。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了用于獼猴桃磨山系列雄性品種鑒定的分子標(biāo)記geo101引物在獼猴桃育種中的應(yīng)用。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：用于獼猴桃磨山系列雄性品種鑒定的分子標(biāo)記geo101引物的獲得：申請(qǐng)人從獼猴桃基因組序列網(wǎng)站(http://bioinfo.bti.cornell.edu/kiwi)下載‘紅陽’獼猴桃全基因序列。在全基因組范圍內(nèi)挖掘不同重復(fù)單元ssr位點(diǎn)，比對(duì)基因結(jié)構(gòu)注釋結(jié)果，選擇在基因區(qū)間的ssr位點(diǎn)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。利用設(shè)計(jì)合成的引物，對(duì)獼猴桃‘磨山’系列品種進(jìn)行pcr擴(kuò)增，篩選得到分子標(biāo)記geo101，針對(duì)其設(shè)計(jì)的引物為geo101-f:agcatcgacagttcagttgg和geo101-r:gcagttgaatcttgccatca。用于獼猴桃磨山系列雄性品種鑒定的分子標(biāo)記geo101引物在獼猴桃育種中的應(yīng)用，利用本發(fā)明的引物對(duì)獼猴桃的品種進(jìn)行鑒定，所述獼猴桃的品種包括但不限于：‘磨山雄1號(hào)’、‘磨山雄2號(hào)’、‘磨山雄3號(hào)’、‘磨山4號(hào)’、‘磨山雄5號(hào)’、‘華光2號(hào)’、‘西選1號(hào)’或‘華優(yōu)’獼猴桃。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：1.形態(tài)標(biāo)記簡(jiǎn)單直觀，但是數(shù)量少、多態(tài)性差、易受環(huán)境條件影響。分子標(biāo)記操作簡(jiǎn)便，在植物體的各個(gè)組織和發(fā)育時(shí)期，均可檢測(cè)，不受季節(jié)和環(huán)境限制。數(shù)量多，遍及整個(gè)基因組。多態(tài)性高，品種間存在許多等位變異。2.本發(fā)明的引物可在獼猴桃‘磨山’雄性系列品種中擴(kuò)增得到不同大小的dna片段。該分子標(biāo)記擴(kuò)增穩(wěn)定性，能用于進(jìn)行獼猴桃‘磨山’雄性系列品種的鑒定。3.本發(fā)明提供的引物可區(qū)分除‘磨山’系列雄性品種之外的其他品種，具備鑒定的普適性，適合大規(guī)模推廣。附圖說明圖1為利用分子標(biāo)記geo101引物在獼猴桃‘磨山’雄性系列品種中毛細(xì)管電泳擴(kuò)增得到不同dna片段的峰圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案；所述試劑或材料，如未特別說明，均來源于商業(yè)或公開的渠道。實(shí)施例1：用于獼猴桃磨山系列雄性品種鑒定的分子標(biāo)記geo101引物的獲得：申請(qǐng)人從獼猴桃基因組序列網(wǎng)站(http://bioinfo.bti.cornell.edu/kiwi)下載‘紅陽’獼猴桃全基因序列。在全基因組范圍內(nèi)挖掘不同重復(fù)單元ssr位點(diǎn)，比對(duì)基因結(jié)構(gòu)注釋結(jié)果，選擇在基因區(qū)間的ssr位點(diǎn)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。利用設(shè)計(jì)合成的引物，對(duì)獼猴桃‘磨山’系列品種進(jìn)行pcr擴(kuò)增，篩選得到分子標(biāo)記geo101，針對(duì)其設(shè)計(jì)的引物為geo101-f:agcatcgacagttcagttgg和geo101-r:gcagttgaatcttgccatca。實(shí)施例2：用于獼猴桃磨山系列雄性品種鑒定的分子標(biāo)記geo101引物在鑒別獼猴桃磨山品種中的應(yīng)用：(1)按照ctab法分別提取‘磨山雄1號(hào)’、‘磨山雄2號(hào)’、‘磨山雄3號(hào)’、‘磨山4號(hào)’和‘磨山雄5號(hào)’獼猴桃的dna樣品。(2)使用加樣器吸取990ulhidi和10ulrox500或liz500的混合物，加入到96孔反應(yīng)板中，每孔10ul。(3)將96孔板置于平板離心機(jī)中，離心500g即停。(4)在96孔板對(duì)應(yīng)的孔中分別加入5個(gè)磨山雄系列樣本dna，每個(gè)樣品50pg。(5)參照以下pcr反應(yīng)體系加入相應(yīng)試劑到96孔板，使用封板膜密封96孔板，振蕩，將96孔板置于平板離心機(jī)中，離心500g即停。按照以下程序進(jìn)行pcr反應(yīng)。a.pcr反應(yīng)體系25μl體系的配制模板(μl)1引物f(μl)0.5引物r(μl)0.5dntp10mm(μl)0.5taqbuffer(μl)2.525mmmgcl2(μl)2.0taq酶(μl)5u/μl0.2水(μl)17.8所述的引物f和引物r為：geo101-f:agcatcgacagttcagttgg和geo101-r:gcagttgaatcttgccatca。b.pcr反應(yīng)條件(6)程序結(jié)束后立即將96孔板置于冰水混合物上急速冷卻，再將96孔板置于平板離心機(jī)中，離心2000g即停。(7)使用3730xl測(cè)序分析儀(美國(guó)abi公司)檢測(cè)擴(kuò)增片段。(8)使用genemapper軟件分析ssr擴(kuò)增數(shù)據(jù)，利用str毛細(xì)管電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段峰，橫坐標(biāo)為片段大小，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度值。(9)利用標(biāo)記geo101擴(kuò)增磨山系列品種，能特異性區(qū)分磨山雄1號(hào)、磨山雄2號(hào)、磨山雄3號(hào)、磨山4號(hào)和磨山雄5號(hào)(圖1)。結(jié)果表明，‘磨山雄1號(hào)’不能擴(kuò)增得條帶；‘磨山雄2號(hào)’擴(kuò)增得到1條帶，為274bp；‘磨山雄3號(hào)’擴(kuò)增得到3條帶，分別為264bp、268bp和270bp；‘磨山4號(hào)’擴(kuò)增得到2條帶，分別為274bp和278bp；‘磨山雄5號(hào)’擴(kuò)增得到2條帶，分別270bp和272bp。實(shí)施例3：用于獼猴桃雄性磨山品種鑒定的分子標(biāo)記geo101引物在鑒別獼猴桃品種中的應(yīng)用：提取‘磨山雄1號(hào)’、‘磨山雄2號(hào)’、‘磨山雄3號(hào)’、‘磨山4號(hào)’、‘磨山雄5號(hào)’、‘華光2號(hào)’、‘西選1號(hào)’或‘華優(yōu)’獼猴桃的dna樣品，利用實(shí)施例2的方法，利用geo101-f:agcatcgacagttcagttgg和geo101-r:gcagttgaatcttgccatca。對(duì)上述品種進(jìn)行分子標(biāo)記的鑒定。利用標(biāo)記geo101擴(kuò)增磨山系列品種，能特異性區(qū)分‘磨山雄1號(hào)’、‘磨山雄2號(hào)’、‘磨山雄3號(hào)’、‘磨山4號(hào)’、‘磨山雄5號(hào)’、‘華光2號(hào)’、‘西選1號(hào)’或‘華優(yōu)’獼猴桃。結(jié)果表明，‘磨山雄1號(hào)’不能擴(kuò)增得條帶；‘磨山雄2號(hào)’擴(kuò)增得到1條帶，為274bp；‘磨山雄3號(hào)’擴(kuò)增得到3條帶，分別為264bp、268bp和270bp；‘磨山4號(hào)’擴(kuò)增得到2條帶，分別為274bp和278bp；‘磨山雄5號(hào)’擴(kuò)增得到2條帶，分別270bp和272bp；‘華光2號(hào)’擴(kuò)增得到2條帶，分別為264bp和270bp；‘西選1號(hào)’擴(kuò)增得到2條帶，分別為264bp和268bp；‘華優(yōu)’擴(kuò)增得到2條帶，分別為268bp和282bp。序列表<110>中國(guó)科學(xué)院武漢植物園<120>用于獼猴桃磨山系列雄性品種鑒定的分子標(biāo)記geo101引物及應(yīng)用<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1agcatcgacagttcagttgg20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gcagttgaatcttgccatca20當(dāng)前第1頁12