本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及美洲大蠊特異性coi引物、含有其的試劑盒及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：美洲大蠊(periplanetaamericanal.)為昆蟲(chóng)綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲(chóng)，俗稱“蟑螂”，是我國(guó)重要的傳統(tǒng)藥材。其入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并把它列為中品，謂“味咸、寒，有毒，治：血瘀癥堅(jiān)寒熱、破積聚、喉咽閉、內(nèi)寒無(wú)子”?！侗静菥V目》上記載其主治“瘀血，癥堅(jiān)，寒熱，下氣，利血脈”?！吨袊?guó)藥學(xué)大辭典》、《中藥大辭典》、《中國(guó)藥用動(dòng)物志》、《全國(guó)中草藥匯編》等近、現(xiàn)代藥學(xué)專著均記載蜚蠊有“活血、散瘀、化積、消疳、解毒、利尿、消腫”等功能。現(xiàn)代藥理研究表明美洲大蠊具有多種藥理作用，比如抗腫瘤、改善微循環(huán)、提高免疫力和促進(jìn)組織修復(fù)等作用。對(duì)美洲大蠊品種的鑒定是入藥的基礎(chǔ)，目前對(duì)藥用美洲大蠊的鑒定大多采用的是活體鑒別的方法，主要是依據(jù)其外部形態(tài)特征進(jìn)行判斷。但是由于昆蟲(chóng)類藥材大多外部形態(tài)相似，組織特征無(wú)特異性，而且經(jīng)過(guò)產(chǎn)地粗加工和飲片炮制后，難以看出物種本身的形態(tài)和顏色，給準(zhǔn)確的藥材鑒定帶來(lái)許多困難，所以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征識(shí)別方法存在識(shí)別困難與識(shí)別錯(cuò)誤的問(wèn)題。因此，亟需尋求一種新的方法，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)分類方法的缺陷。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，pcr)技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、高速快速等特點(diǎn)，再加上特異性引物可擴(kuò)增得到物種特異性的條帶，用此檢測(cè)方法可不受形態(tài)的控制。本發(fā)明即提供了一種高效便捷的分子檢測(cè)方法，利用特異性引物，根據(jù)預(yù)期dna條帶的有無(wú)來(lái)鑒定美洲大蠊，為準(zhǔn)確、快速鑒定美洲大蠊藥材提供有效手段支撐。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供美洲大蠊特異性coi引物、含有其的試劑盒及應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明根據(jù)美洲大蠊的線粒體dna序列，設(shè)計(jì)篩選得到一對(duì)美洲大蠊特異性coi引物jmf1和jmr1(seqidno.1和seqidno.2)，其包括：正向引物jmf1：5’-tgctgagctcgggcaacca-3’；反向引物jmr1：5’-ctactgatcatacgaaaagggga-3’。本發(fā)明還提供含有引物jmf1和jmr1的用于檢測(cè)美洲大蠊的試劑盒。所述試劑盒還包括dntps、taqdna聚合酶、mg2+、pcr反應(yīng)緩沖液中的至少一種。優(yōu)先地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。本發(fā)明還提供含有引物jmf1和jmr1，以及含有引物jmf1和jmr1的試劑盒在檢測(cè)美洲大蠊中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種美洲大蠊的特異性快速pcr檢測(cè)方法，包括以下步驟：1)供試品前處理；2)提取樣品dna；3)以步驟2)提取的dna為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物jmf1和jmr1進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)；4)分析pcr產(chǎn)物。pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系以25ul計(jì)為：10×pcr緩沖液(含mg2+)2.5ul、10×dntps2.0ul、taq酶(5單位/ul)0.2ul、模板dna2.0ul、正，反向引物(5umol/l)各1.0ul、無(wú)菌雙蒸水16.3ul。pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)。對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若出現(xiàn)大小為452bp的dna條帶(seqidno.3)，則判定樣品為美洲大蠊。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明根據(jù)genbank中公布的美洲大蠊線粒體coi基因序列(accesionno.hm577152.1)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性coi引物jmf1和jmr1(seqidno.1和seqidno.2)，該引物具有物種特異性，僅對(duì)美洲大蠊具有擴(kuò)增效果、擴(kuò)增產(chǎn)物大小為452bp，靈敏度dna濃度檢出限為0.390625ng/ul，而對(duì)其它蜚蠊目物種如澳洲大蠊、褐斑大蠊、菱葉斑蠊、雙紋小蠊、德國(guó)小蠊、中華擬歪尾蠊、蘇里南蔗蠊、多毛真鱉蠊、中華真地鱉無(wú)擴(kuò)增能力。本發(fā)明在美洲大蠊藥材檢測(cè)方面具有很高的價(jià)值，尤其當(dāng)美洲大蠊藥材處于粉末狀態(tài)的情況下，本發(fā)明不僅節(jié)約時(shí)間而且準(zhǔn)確性高，在實(shí)際應(yīng)用中具有重要的意義。本發(fā)明利用pcr檢測(cè)技術(shù)，由特異性引物擴(kuò)增得到特異性單一條帶，操作簡(jiǎn)單，具有高效、價(jià)廉、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中美洲大蠊特異性引物jmf1和jmr1(seqidno.1和seqidno.2)在各蜚蠊物種中的檢測(cè)結(jié)果；其中“m”代表dnamarker，“-”代表陰性對(duì)照。圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中美洲大蠊特異性引物jmf1和jmr1(seqidno.1和seqidno.2)的dna濃度滴度檢測(cè)結(jié)果；其中“m”代表dnamarker，1-11代表模板dna濃度依次2倍稀釋濃度滴度；“-”代表陰性對(duì)照。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)試驗(yàn)條件，如smabrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(jsambrook,davidrussellmolecularcloningalaboratorymanualthirdedition，2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書建議的條件。實(shí)施例1美洲大蠊特異性引物jmf1和jmr1對(duì)美洲大蠊的擴(kuò)增效果1、供試品前處理試驗(yàn)樣本在基因組制備前，首先使用75％乙醇擦拭樣本表面消除外源性污染，待乙醇揮發(fā)后，選取腹部肌肉組織進(jìn)行充分磨碎后作為基因組提取樣本。2、美洲大蠊基因組的制備采用dna提取試劑盒(tianampgenomicdnakit(北京天根生化科技有限公司))提取美洲大蠊模板dna，用微量分光光度計(jì)檢測(cè)提取的美洲大蠊模板dna的濃度，并用滅菌的去離子水將樣品的dna濃度稀釋到0.1ug/ul-0.2ug/ul。3、合成美洲大蠊特異性coi引物序列美洲大蠊特異性coi引物序列序列如下：正向引物jmf1：5’-tgctgagctcgggcaacca-3’；反向引物jmr1：5’-ctactgatcatacgaaaagggga-3’。4、pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為25ul，包括：10×pcr緩沖液(含mg2+)2.5ul、10×dntps2.0ul、taq酶(5單位/ul)0.2ul、模板dna2.0ul、正，反向引物(5umol/l)各1.0ul、無(wú)菌雙蒸水16.3ul。pcr的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)。pcr擴(kuò)增儀型號(hào)為美國(guó)appliedbiosystems9700型。5、pcr產(chǎn)物鑒定取pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，用1％瓊脂糖凝膠電泳分離，以其他常見(jiàn)蜚蠊目物種澳洲大蠊、褐斑大蠊、菱葉斑蠊、雙紋小蠊、德國(guó)小蠊、中華擬歪尾蠊、蘇里南蔗蠊、多毛真鱉蠊、中華真地鱉樣品(見(jiàn)表1)為對(duì)照進(jìn)行pcr擴(kuò)增，，結(jié)果如圖1所示，僅有1、2泳道對(duì)應(yīng)的美洲大蠊擴(kuò)增出452bp的目的條帶，說(shuō)明本發(fā)明的引物特異性強(qiáng)?；厥丈鲜?52bp的目的條帶，進(jìn)行測(cè)序，其序列如seqidno.3所示。表1引物特異性檢測(cè)中所涉及的蜚蠊目昆蟲(chóng)種類科亞科屬序號(hào)種類拉丁學(xué)名蜚蠊科蜚蠊亞科大蠊屬1美洲大蠊periplanetaamericanal.蜚蠊科蜚蠊亞科大蠊屬2黑胸大蠊periplanetafuliginosaserville蜚蠊科蜚蠊亞科大蠊屬3澳洲大蠊periplanetaaustralasiae(fabricius)蜚蠊科蜚蠊亞科大蠊屬4褐斑大蠊periplanetabrunneaburmeister蜚蠊科蜚蠊亞科斑蠊屬5菱葉斑蠊neostylopygarhombifolia(stoll)姬蠊科姬蠊亞科小蠊屬6雙紋小蠊blattellabisignata(brunnerv.w.)姬蠊科姬蠊亞科小蠊屬7德國(guó)小蠊blattellagermanical.姬蠊科姬蠊亞科擬歪尾蠊屬8中華擬歪尾蠊episymplocesinensis(walker)碩蠊科蔗蠊亞科蔗蠊屬9蘇里南蔗蠊pycnoscelussurinamensisl.地鱉蠊科地鱉蠊亞科真鱉蠊屬10多毛真鱉蠊eucorydiadasytoides(walker)地鱉蠊科地鱉蠊亞科真鱉蠊屬11中華真地鱉eupolyphagasinensis(walker)實(shí)施例2引物jmf1和jmr1對(duì)美洲大蠊最低檢出量的測(cè)定。按實(shí)施例1提取美洲大蠊基因組dna，按照實(shí)施例1中所述體系反應(yīng)體系與pcr反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。然后原模板溶液(dna溶液濃度為50ng/ul)以2倍進(jìn)行遞減梯度稀釋，取2ul稀釋后溶液作為pcr擴(kuò)增的模板，直接加到pcr反應(yīng)體系中，反應(yīng)體系同實(shí)施例1中的描述。直至稀釋到檢測(cè)不到條帶為止。利用引物jmf1和jmr1(seqidno.1和seqidno.2)做出最低檢出量的測(cè)定，以不同稀釋倍數(shù)的美洲大蠊基因組dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，如圖2所示，泳道2的dna濃度為50ng/ul，以2倍法遞減稀釋的dna模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示泳道9為dna濃度最低檢出限，dna濃度檢出限為0.390625ng/ul(圖2)。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明做了詳盡的描述，但在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，可以對(duì)之做一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改和改進(jìn)，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。sequencelisting<110>四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責(zé)任公司<120>美洲大蠊特異性coi引物、含有其的試劑盒及應(yīng)用<130>20<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>dna<213>美洲大蠊<400>1tgctgagctcgggcaacca19<210>2<211>23<212>dna<213>美洲大蠊<400>2ctactgatcatacgaaaagggga23<210>3<211>452<212>dna<213>美洲大蠊<400>3tgctgagctcgggcaaccaggttcactaattggagatgatcaaatttataatgtaatcgt60tactgcccatgccttcattataattttctttatagtaataccaatcataattgggggatt120tggtaattgattagtaccactaatattaggagccccagatatagccttcccacgaataaa180taatataagattctgattattaccaccttcattaactttattactagctagtagtatagt240agaaagaggtgccggaacaggatgaacagtatacccaccactagcaagaggcattgctca300tgccggagcatctgttgatctagcaattttttcattacatctagcaggtgtatcctcaat360tctaggagctgtaaattttatctccacaacaattaatataaaacctattaatataaaacc420agaacgaattccccttttcgtatgatcagtag452當(dāng)前第1頁(yè)12