本發(fā)明涉及一種核酸檢測(cè)方法，特別涉及一種核酸雜交化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

目前主流的核酸檢測(cè)技術(shù)有基因測(cè)序、基因芯片、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等，以及基于非靶標(biāo)物質(zhì)擴(kuò)增的技術(shù)，例如基于抗體捕獲的第二代雜交捕獲技術(shù)(德國(guó)凱杰公司的hc2)，基于rna逆轉(zhuǎn)錄的核酸序列擴(kuò)增技術(shù)(美國(guó)豪洛捷)，基于支鏈dna信號(hào)放大的快速捕獲雜交技術(shù)(科蒂亞生物)等。但目前的各種方法均存在各種不足，如基因測(cè)序成本居高不下，基因芯片操作復(fù)雜、檢測(cè)靈敏度低，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求高等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種核酸雜交化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，該方法可以快速捕獲雜交目標(biāo)核酸。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種核酸雜交化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，該方法包括如下步驟：

(1)根據(jù)檢測(cè)的目標(biāo)核酸的序列設(shè)計(jì)捕獲核酸序列和信號(hào)核酸序列，其中捕獲核酸序列5’端進(jìn)行氨基修飾，信號(hào)核酸序列5’標(biāo)記生物素；

(2)將捕獲核酸序列固定到基質(zhì)上；

(3)通過核酸雜交反應(yīng)，捕獲核酸序列和目標(biāo)核酸結(jié)合；

(4)通過核酸雜交反應(yīng)，標(biāo)記了生物素的信號(hào)核酸序列和結(jié)合在捕獲核酸序列上的目標(biāo)核酸結(jié)合；

(5)通過生物素-親和素的特異性結(jié)合反應(yīng)，把標(biāo)記了鏈霉親和素的微球結(jié)合到信號(hào)核酸序列上；

(6)通過生物素-親和素的特異性結(jié)合反應(yīng)，生物素-堿性磷酸酶和微球上的鏈霉親和素結(jié)合；

(7)通過上述反應(yīng)固定到基質(zhì)上的生物素-堿性磷酸酶和發(fā)光底物反應(yīng)，通過化學(xué)發(fā)光分析儀讀取結(jié)果，根據(jù)檢測(cè)值和空白對(duì)照值的差異來判斷待測(cè)的樣本中是否含有目標(biāo)核酸。一般來講，檢測(cè)值和空白對(duì)照值具有顯著差異，可以認(rèn)為待測(cè)的樣本中含有目標(biāo)核酸。經(jīng)過發(fā)明人多次試驗(yàn)摸索，檢測(cè)值和空白對(duì)照值的比值大于1.5時(shí)，可以認(rèn)為待測(cè)的樣本中含有目標(biāo)核酸；否則待測(cè)的樣本中不含有目標(biāo)核酸。

本發(fā)明建立了一種新的核酸物質(zhì)檢測(cè)方法，通過該方法的建立擴(kuò)大核酸檢測(cè)產(chǎn)品在醫(yī)療、科研、食品安全等領(lǐng)域的使用范圍。本發(fā)明方法通過基質(zhì)、捕獲核酸序列、目標(biāo)核酸、標(biāo)記生物素的信號(hào)核酸序列、標(biāo)記鏈霉親和素的微球和生物素-堿性磷酸酶、發(fā)光底物等對(duì)目標(biāo)核酸進(jìn)行特異性檢測(cè)。

作為優(yōu)選，所述的微球是聚苯乙烯(ps)、交聯(lián)聚苯乙烯/聚二乙烯基苯(p[s/dvb])或聚甲基丙烯酸酯(pmma)微球，微球的直徑為50-500nm。本發(fā)明采用的微球是表面聚合鏈霉親和素的微球。

作為優(yōu)選，所述捕獲核酸序列和目標(biāo)核酸的特定片段互補(bǔ)，且長(zhǎng)度在15-50個(gè)堿基。

作為優(yōu)選，所述信號(hào)核酸序列和目標(biāo)核酸的特定片段互補(bǔ)，且長(zhǎng)度在15-50個(gè)堿基。

作為優(yōu)選，所述基質(zhì)是微孔板、微球、玻片、硅片或微流體芯片。

作為優(yōu)選，當(dāng)基質(zhì)是氨基修飾的微孔板則通過戊二醛固定，當(dāng)基質(zhì)是羧基修飾的微球時(shí)，通過1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺固定。

作為優(yōu)選，捕獲核酸序列和信號(hào)核酸序列分別針對(duì)目標(biāo)核酸的不同片段。

作為優(yōu)選，所述發(fā)光底物是c18h21na2o7p(amppd)、c18h20clna2o7p(cspd)、c18h20clna2o7p(adp-star)或c18h19cl2o7na2p(cdp-star)。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過捕獲核酸序列將目標(biāo)核酸雜交捕獲，再經(jīng)過信號(hào)核酸序列、微球、生物素-親和素以及堿性磷酸酶的活性即可實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，從而檢測(cè)到目標(biāo)核酸的信號(hào)。相對(duì)于pcr技術(shù)需要擴(kuò)增，本發(fā)明在不增加檢測(cè)物濃度的前提下實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸的檢測(cè)，且具有穩(wěn)定性好，成本低，檢測(cè)速度快，對(duì)環(huán)境要求低等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明方法的作用機(jī)理示意圖；

圖中：1基質(zhì)、2捕獲核酸序列、3目標(biāo)核酸、41生物素、42信號(hào)核酸序列、51微球、52鏈霉親和素、61生物素-堿性磷酸酶。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。

在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設(shè)備和原料等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

amppd，化學(xué)名3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧環(huán)乙烷二鈉鹽，購(gòu)自南京探求生物技術(shù)有限公司；

dea，化學(xué)名二乙醇胺，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；

鏈霉親和素修飾的微球，直徑50-500nm，購(gòu)自上海羧菲生物醫(yī)藥科技有限公司；

生物素-堿性磷酸酶，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；

氨基修飾的微孔板，購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

實(shí)施例1：

1.如圖1所示的一種核酸雜交化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，本方法通過基質(zhì)、捕獲核酸序列、目標(biāo)核酸、標(biāo)記生物素的信號(hào)核酸序列、標(biāo)記鏈霉親和素的微球和生物素-堿性磷酸酶、發(fā)光底物等對(duì)待測(cè)目標(biāo)核酸進(jìn)行特異性檢測(cè)。具體過程如下：

首先，根據(jù)目標(biāo)核酸3的序列aacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggt(seqidno.1)；設(shè)計(jì)捕獲核酸序列2并修飾氨基：nh2-(ch2)6-accagaaagccacggctaactacg(seqidno.2)；

設(shè)計(jì)信號(hào)核酸序列42，并修飾生物素41，

biotin-aacgcttgccacctacgtattaccgc(seqidno.3)；

微球51具體為鏈霉親和素52標(biāo)記的聚苯乙烯微球(直徑100nm)；

所述基質(zhì)1為氨基修飾的微孔板；

2.在氨基化的微孔板的每個(gè)孔里加入5％戊二醛100μl，室溫下每10min震蕩一次，持續(xù)1h；吸出液體，用ph7.4的磷酸緩沖液震蕩清洗微孔板；吸出液體，加入100μl5nmol/l的捕獲核酸序列(pbs緩沖液，0.01mol/l,ph7.2)，37℃反應(yīng)2h；吸出液體，用ph7.4的磷酸緩沖液震蕩清洗微孔板；此時(shí)，捕獲核酸序列固定到氨基化的微孔板上。

3.在微孔板中每孔加入3％的牛血清白蛋白封閉液和預(yù)雜交液各60μl。震蕩反應(yīng)1h，用磷酸緩沖液清洗；

所述預(yù)雜交液組成為：

0.5ml甲酰胺，

250μl20×ssc(氯化鈉-檸檬酸鈉緩沖液)，

100μl50×denhards溶液(聚蔗糖5g，聚乙烯吡咯烷酮5g，牛血清白蛋白5g，定容至500ml)

50μl小牛胸腺dna，

50μl磷酸緩沖液(pbs，1mol/l,ph7.4)，

50μl乙二胺四乙酸(edta，100mmol/l)。

4.在包被好的微孔板中每孔加入100μl雜交液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募尤?μl的待測(cè)目標(biāo)核酸，40℃反應(yīng)30min，棄上清；通過核酸雜交反應(yīng)，捕獲核酸序列和待測(cè)目標(biāo)核酸結(jié)合。

5.在微孔板上加入100μl生物素標(biāo)記的信號(hào)核酸序列(5nmol/l),40℃反應(yīng)30min，棄上清；通過核酸雜交反應(yīng)，標(biāo)記了生物素的信號(hào)核酸序列和結(jié)合在捕獲核酸序列上的待測(cè)目標(biāo)核酸結(jié)合。

6.在微孔板上再加入100μl鏈霉親和素修飾的微球懸浮液(1％固含量)，40℃反應(yīng)30min，棄上清；通過生物素-親和素的特異性結(jié)合反應(yīng)，把標(biāo)記了鏈霉親和素的微球結(jié)合到信號(hào)核酸序列上；

7.在微孔板上再加入100μl生物素-堿性磷酸酶溶液(5nmol/l),40℃反應(yīng)30min，棄上清；通過生物素-親和素的特異性結(jié)合反應(yīng)，生物素-堿性磷酸酶和微球上的鏈霉親和素結(jié)合。

8.在微孔板上再加入100μl發(fā)光液(0.25mmamppd,0.1mdea,1mmmgcl2，ph10)，40℃反應(yīng)5min；

9.通過上述反應(yīng)固定到微孔板上的生物素-堿性磷酸酶和發(fā)光底物反應(yīng)，通過化學(xué)發(fā)光分析儀讀取結(jié)果，根據(jù)檢測(cè)值和空白對(duì)照值的差異來判斷待測(cè)的樣本中是否含有目標(biāo)核酸。計(jì)算檢測(cè)孔和空白對(duì)照孔的比值，如果大于1.5，則表明檢測(cè)樣本中存在目標(biāo)核酸，如果小于1.5則表面不含目標(biāo)核酸或目標(biāo)核酸含量低于檢測(cè)限。在本實(shí)施例中，空白對(duì)照值為18340(光子數(shù))，檢測(cè)值為448710，比值為22.466，表明存在目標(biāo)核酸，與預(yù)期結(jié)果一致，證明本方法可以用于實(shí)際樣本的檢測(cè)分析。

結(jié)論：相對(duì)于pcr技術(shù)需要擴(kuò)增，本發(fā)明在不增加檢測(cè)物濃度的前提下實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸的檢測(cè)，大大降低了對(duì)環(huán)境的要求，可以使核酸檢測(cè)廣泛應(yīng)用到各中小醫(yī)院、社區(qū)診所、臨床科室、食品安全檢測(cè)、疾控中心等。

實(shí)施例2：

1.一種核酸雜交化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，根據(jù)目標(biāo)核酸3的序列aacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggt(seqidno.1)；

設(shè)計(jì)捕獲核酸序列2并修飾氨基：nh2-(ch2)6-accagaaagccacggctaactacg(seqidno.2)；

設(shè)計(jì)信號(hào)核酸序列42，并修飾生物素biotin-aacgcttgccacctacgtattaccgc(seqidno.3)；

微球51具體為鏈霉親和素標(biāo)記的聚苯乙烯微球(直徑100nm)；

所述基質(zhì)1為羧基修飾的磁性微球，直徑200nm；

2.取5μl(0.1％固含量)羧基修飾的磁性微球，加入50μl的0.1mol/l的2-(n-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液(mes)，2μl0.1mol/l氨基修飾的捕獲核酸序列混勻，加入兩次2.5μl新鮮配置的10g/l的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺溶液(edc)，室溫避光反應(yīng)30分鐘；離心3分鐘(12000rpm)，去上清，1.0ml0.02％的吐溫(tween20)和1.0ml的十二烷基硫酸鈉(sds，0.1％)各洗一次，震蕩，離心，去上清，然后用mes重懸微球。

3.在微孔板中每孔加入100μl雜交液，10μl0.01％固含量的微球，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募尤?μl的目標(biāo)核酸，40℃反應(yīng)30min，棄上清；

所述預(yù)雜交液組成為：

0.5ml甲酰胺，

250μl20×ssc(氯化鈉-檸檬酸鈉緩沖液)，

100μl50×denhards溶液(聚蔗糖5g，聚乙烯吡咯烷酮5g，牛血清白蛋白5g，定容至500ml)

50μl小牛胸腺dna，

50μl磷酸緩沖液(pbs，1mol/l,ph7.4)，

50μl乙二胺四乙酸(edta，100mmol/l)。

5.在微孔板上加入100μl生物素標(biāo)記的信號(hào)核酸序列(5nmol/l),40℃反應(yīng)30min，棄上清；

6.在微孔板上再加入100μl鏈霉親和素修飾的微球懸浮液(1％固含量)，40℃反應(yīng)30min，棄上清；

7.在微孔板上再加入100μl生物素-堿性磷酸酶溶液(5nmol/l),40℃反應(yīng)30min，棄上清；

8.在微孔板上再加入100μl發(fā)光液(0.25mmamppd,0.1mdea,1mmmgcl2，ph10)，40℃反應(yīng)5min；

9.化學(xué)發(fā)光分析儀上讀取結(jié)果。檢測(cè)孔數(shù)值為30230，空白對(duì)照值為17935，比值為1.68，表面檢測(cè)孔中存在目標(biāo)核酸，與預(yù)期結(jié)果一致。

結(jié)論：相對(duì)于pcr技術(shù)需要擴(kuò)增，本發(fā)明在不增加檢測(cè)物濃度的前提下實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸的檢測(cè)，大大降低了對(duì)環(huán)境的要求，可以使核酸檢測(cè)廣泛應(yīng)用到各中小醫(yī)院、社區(qū)診所、臨床科室、食品安全檢測(cè)、疾控中心等。

以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。

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<110>浙江殷欣生物技術(shù)有限公司

<120>一種核酸雜交化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法

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