本發(fā)明涉及基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體是進(jìn)行add1基因rs4961位點多態(tài)性的分型檢測方法。

背景技術(shù)：

高血壓以收縮或舒張壓持續(xù)增高為主要表現(xiàn)，是最常見的心血管疾病，同時也是其他心腦血管疾病的主要危險因素。高血壓可分為原發(fā)性高血壓和繼發(fā)性高血壓，其中病因不明的高血壓被稱之為原發(fā)性高血壓，占總高血壓的95%以上。長期的高血壓會使心臟和血管結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變，是引起心肌梗死、心力衰竭、慢性腎臟病及腦卒等疾病的重要因素，給家庭和社會造成沉重的負(fù)擔(dān)。

高血壓是一種由遺傳和環(huán)境因素共同作用的多基因遺傳疾病，研究證實高血壓有明顯的遺傳傾向，人群中個體間20%-60%的血壓水平變異歸因于遺傳因素。隨著單核苷酸多態(tài)性研究的深入，科研工作者發(fā)現(xiàn)了多個與高血壓易感性密切相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點。人體內(nèi)水鈉代謝平衡在血壓調(diào)控和高血壓發(fā)病及防治中發(fā)揮著重要的作用，其中，α-內(nèi)收蛋白（α-adducin，add1）基因是一種細(xì)胞骨架蛋白，含有多個與膜蛋白相互作用的位點，add1蛋白能參與細(xì)胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時其與鈉鉀泵atp酶α2亞基之間也相互作用，共同參與細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運。

add1有關(guān)位點的多態(tài)可引起鹽離子的代謝紊亂，其中，位點rs4961的多態(tài)性與鈉離子濃度變化具有顯著相關(guān)性，且與人體血壓調(diào)節(jié)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)rs4961位點等位基因t的攜帶者在相同的環(huán)境中具有更高的易感性。因此，建立簡單、快捷的高血壓易感基因add1多態(tài)性位點的檢測方法，通過對單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行基因分型，篩選與高血壓相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性，從遺傳學(xué)水平為高血壓危險因素的預(yù)測和防治提供思路，使人們可以通過對健康人群或早期出現(xiàn)高血壓危險因素群體的基因多態(tài)性分型，及時預(yù)測和評價高血壓疾病風(fēng)險，為高血壓疾病的早期預(yù)防和及時治療提供理論的指導(dǎo)。

目前，基因多態(tài)性檢測最常用的方法為測序法，測序法優(yōu)勢是可以同時進(jìn)行高通量多位點的檢測，但其操作復(fù)雜耗時長且靈敏度低，容易出現(xiàn)樣本間交叉污染且不能實現(xiàn)樣本的快速檢測；高分辨率溶解曲線法快速、簡便、經(jīng)濟(jì)實用，但是它對儀器要求高，其使用的分析儀器即需要安裝高分辨率軟件且需對溫度高度敏感，臨床推廣存在困難。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供重復(fù)性好、靈敏度高的進(jìn)行add1基因rs4961位點多態(tài)性的分型檢測方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

進(jìn)行add1基因rs4961位點多態(tài)性的分型檢測方法，采用add1基因特異性的引物seq1和seq2擴(kuò)增add1基因片段，同時在add1基因特異性的引物界定的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)計add1基因特異性taqman探針seq3-fam-t和seq4-vic-g；若位點為t，則add1基因特異性taqman探針seq3-fam-t釋放fam熒光信號而被定量pcr儀器檢測確認(rèn)位點為t；若位點為g，則add1基因特異性taqman探針seq4-vic-g釋放vic熒光信號而被定量pcr儀器檢測確認(rèn)位點為g，最終通過fam/vic信號的比值來判斷位點基因型；

所述add1基因特異性的引物seq1的核苷酸序列號如下：

5′-cccactcagacacagtttt-3′；

所述add1基因特異性的引物seq2的核苷酸序列號如下：

5′-acaccttagtcttcgacttg-3′；

所述add1基因特異性taqman探針seq3-fam-t的核苷酸序列號如下：

fam-5′-ctgcttccattctgccattc-3′-mgb；

所述add1基因特異性taqman探針seq4-vic-g的核苷酸序列號如下：

vic-5′-tgcttccattctgcccttc-3′-mgb。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明是基于基因特異性pcr結(jié)合taqman探針判斷基因snp位點分型靠的方法，本發(fā)明采用add1特異性的基因擴(kuò)增和taqman探針，基于taqman探針定量pcr方法進(jìn)行目的基因分型檢測具有簡便快捷，重復(fù)性高，靈敏度高，特異性好的特點。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例中人add1基因rs4961位點tt基因型特異性片段擴(kuò)增曲線示意圖。

圖2為本發(fā)明實施例中人add1基因rs4961位點gt基因型特異性片段擴(kuò)增曲線示意圖。

圖3為本發(fā)明實施例中人add1基因rs4961位點gg基因型特異性片段擴(kuò)增曲線示意圖。

圖4為本發(fā)明實施例中人add1基因rs4961位點的檢測結(jié)果分布示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本專利的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。

請參閱圖1-4，進(jìn)行add1基因rs4961位點多態(tài)性的分型檢測方法，采用add1基因特異性的引物seq1和seq2擴(kuò)增add1基因片段，同時在add1基因特異性的引物界定的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)計add1基因特異性taqman探針seq3-fam-t和seq4-vic-g；若位點為t，則add1基因特異性taqman探針seq3-fam-t釋放fam熒光信號而被定量pcr儀器檢測確認(rèn)位點為t；若位點為g，則add1基因特異性taqman探針seq4-vic-g釋放vic熒光信號而被定量pcr儀器檢測確認(rèn)位點為g，最終通過fam/vic信號的比值來判斷位點基因型；

所述add1基因特異性的引物seq1的核苷酸序列號如下：

5′-cccactcagacacagtttt-3′；

所述add1基因特異性的引物seq2的核苷酸序列號如下：

5′-acaccttagtcttcgacttg-3′；

所述add1基因特異性taqman探針seq3-fam-t的核苷酸序列號如下：

fam-5′-ctgcttccattctgccattc-3′-mgb；

所述add1基因特異性taqman探針seq4-vic-g的核苷酸序列號如下：

vic-5′-tgcttccattctgcccttc-3′-mgb。

實施例：

（1）測試用正常人基因組dna制備：

采取正常人口腔咽拭子，chlex100抽提制備，正常人基因組dna濃度稀釋到10ng/μl。

（2）pcr特異性引物和探針設(shè)計合成

根據(jù)人add1基因基因序列設(shè)計合成基因特異性引物seq1，seq2和add1特異性taqman基因探針標(biāo)記seq3-fam-t和seq4-vic-g。

（3）add1定量pcr檢測：

1）引物探針混合物配置：

2）反應(yīng)體系：引物探針混合物1.5μl，2倍tiantoughgenotypingqpcrpremix(probe)12.5μl，標(biāo)準(zhǔn)模板1.5μl，ddh2o9.5μl。

3）定量pcr儀：abi7500。

4）反應(yīng)條件：95℃2分鐘；95℃15秒——60℃32秒，42循環(huán)。

（4）基因驗證結(jié)果讀?。?/p>

參見圖1-4，圖1-3中橫坐標(biāo)是以0-42的偶數(shù)標(biāo)示的循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)是相應(yīng)的熒光信號，檢測到vic、fam信號確定為擴(kuò)增成功。根據(jù)樣本fam/vic比值確定具體樣本的基因型。

本發(fā)明是基于基因特異性pcr結(jié)合taqman探針判斷基因snp位點分型靠的方法，本發(fā)明采用add1特異性的基因擴(kuò)增和taqman探針，基于taqman探針定量pcr方法進(jìn)行目的基因分型檢測具有簡便快捷，重復(fù)性高，靈敏度高，特異性好的特點。

上面對本專利的較佳實施方式作了詳細(xì)說明，但是本專利并不限于上述實施方式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識范圍內(nèi)，還可以在不脫離本專利宗旨的前提下作出各種變化。