本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種鼻咽癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，npc)盡管少見(jiàn)，但是在東南亞高發(fā)。其中約80％鼻咽癌發(fā)生在中國(guó)，因此鼻咽癌又有“中國(guó)癌”之稱(chēng)。最新報(bào)道預(yù)測(cè)2015年中國(guó)將有6萬(wàn)新增鼻咽癌患者。湖南地處的湖廣地帶鼻咽癌發(fā)病率高達(dá)20/10萬(wàn)至30/10萬(wàn)，是鼻咽癌的重災(zāi)區(qū)。近期有學(xué)者建議將鼻咽癌早篩納入湖南地區(qū)常規(guī)體檢。鼻咽癌與eb病毒(epstein-barrvirus，ebv)，環(huán)境因素以及遺傳等多因素有關(guān)。發(fā)病隱匿，容易忽視，惡性程度高，發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期，影響預(yù)后。ebv檢測(cè)是目前常用的篩查方式，是鼻咽癌的生物標(biāo)志物。有報(bào)道可在鼻咽癌患者血漿中檢測(cè)到ebvdna，且放療后血漿中ebvdna拷貝數(shù)升高。纖維鼻咽喉鏡可以觀察到鼻腔及咽部情況。ct、mri和pet可以檢測(cè)鼻咽癌是否侵犯顱底和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，但其費(fèi)用較高，不適合作為常規(guī)檢查。因此需要尋找新的標(biāo)志物。
長(zhǎng)鏈非編碼rna(longnoncodingrna,lncrna)是無(wú)蛋白編碼能力的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸，參與各種生理過(guò)程。至今已有成千上萬(wàn)種lncrna被報(bào)道存在于人類(lèi)基因組中，但絕大部分的lncrna的功能尚不明確。lncrna在鼻咽癌，肺癌，乳腺癌，結(jié)腸癌，肝癌等多種癌癥中發(fā)揮著重要的作用。lncrna似乎參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段，包括腫瘤發(fā)生，生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。與其他腫瘤一樣，原發(fā)性鼻咽癌也發(fā)現(xiàn)lncrna失調(diào)。一些lncrna在鼻咽癌中高表達(dá)，lncrnahotair調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，其表達(dá)水平并與腫瘤大小，惡性程度和不良預(yù)后有正相關(guān)。此外lncrnahotair被報(bào)道可通過(guò)直接激活vegfa的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)腫瘤血管生成。循環(huán)中l(wèi)ncrnagas5可作為鼻咽癌預(yù)測(cè)化療預(yù)后的生物標(biāo)志物。afap1-as1可能作為鼻咽癌不良預(yù)后預(yù)測(cè)標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。因此lncrna可作為鼻咽癌的腫瘤標(biāo)記物。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鼻咽癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物。所述腫瘤標(biāo)志物為lncrna，該lncrna的核酸序列如seqidno.1所示，命名為lncrna-kat7。本發(fā)明研究證實(shí)lncrna-kat7在鼻咽癌組織中表達(dá)下調(diào)，提示lncrna-kat7可作為鼻咽癌的腫瘤標(biāo)記物。lncrna-kat7有望成為鼻咽癌診斷和預(yù)后判斷的標(biāo)志物，同時(shí)為鼻咽癌的治療提供了新的靶點(diǎn)。因此，lncrna-kat7可用于制備鼻咽癌輔助診斷、療效預(yù)測(cè)及預(yù)后判斷制劑。還可用于制備鼻咽癌輔助診斷、療效預(yù)測(cè)及預(yù)后判斷試劑盒。
所述鼻咽癌輔助診斷、療效預(yù)測(cè)及預(yù)后判斷的試劑盒中包括lncrna-kat7和內(nèi)參基因gapdh的特異性引物，所述lncrna-kat7和內(nèi)參基因gapdh的特異性引物的上游引物和下游引物，所述lncrna-kat7的特異性上游引物的序列如seqidno.2所示，所述lncrna-kat7下游引物的序列如seqidno.3所示，所訴gapdh的上游引物的序列如seqidno.4所示，所訴gapdh的下游引物的序列如seqidno.5所示。
所述試劑盒為實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒，所述特異性引物適用于sybrgreen、taqman探針、分子信標(biāo)、雙雜交探針、復(fù)合探針的檢測(cè)。另外，試劑盒中還包括標(biāo)準(zhǔn)dna模板和pcr反應(yīng)體系，pcr反應(yīng)體系中的pcr反應(yīng)液為實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)液，并進(jìn)一步包含熒光染料。所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)液包括dntp、mg2+、taq酶及緩沖液，所述熒光染料為sybrgreenii，taq酶為熱啟動(dòng)酶。
在利用上述試劑盒檢測(cè)lncrna-kat7的過(guò)程如下：
1)提取樣品總rna；
2)制備樣品cdna；
3)定量擴(kuò)增lncrna-kat7。
下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：
lncrna-kat7位于17號(hào)染色體上，可應(yīng)用于輔助鼻咽癌診斷的試劑盒中。
本發(fā)明通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量pcr分析發(fā)現(xiàn)36例鼻咽癌組織中的lncrna-kat7表達(dá)水平與10例正常的鼻咽內(nèi)皮組織相比較，lncrna-kat7在鼻咽癌組織與正常鼻咽內(nèi)皮組織中存在差異性表達(dá)，且在鼻咽癌組織中表達(dá)下調(diào)。以上結(jié)果表明在lncrna-kat7可能作為新型鼻咽癌診斷標(biāo)志物。
所述鼻咽癌輔助診斷、療效預(yù)測(cè)及預(yù)后判斷的試劑盒包括：(1)從鼻咽癌組織中抽提總rna所用試劑，包括trizol試劑、三氯甲烷、異丙醇、75％乙醇、無(wú)酶水；(2)將總rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna所用試劑，包括逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、氯化鎂、三磷酸堿基脫氧核苷酸、rna酶抑制劑、mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶及隨機(jī)引物；(3)將cdna實(shí)時(shí)熒光定量pcr所需試劑，包括lncrna-kat7實(shí)時(shí)熒光定量pcr特異性引物、gapdh內(nèi)參特異性pcr引物、實(shí)時(shí)熒光定量sybr染料、無(wú)酶水；lncrna-kat7特異性pcr引物包括：①lncrna-kat7上游引物(seqidno.2)②lncrna-kat7下游引物(seqidno.3)；gapdh內(nèi)參特異性pcr引物包括：①gapdh上游引物(seqidno.4)②gapdh下游引物(seqidno.5)。
本發(fā)明為鼻咽癌的輔助診斷提供了強(qiáng)有力的分子生物學(xué)工具，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和重要的推廣應(yīng)用前景。
附圖說(shuō)明
圖1為lncrna-kat7在鼻咽癌中的表達(dá)水平。
具體實(shí)施方式
所述鼻咽癌輔助診斷、療效預(yù)測(cè)及預(yù)后判斷的試劑盒中包括：
(1)從鼻咽癌和癌盤(pán)組織中抽提總rna所用試劑，包括trizol試劑、三氯甲烷、異丙醇、depc水。
(2)將總rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna所用試劑：promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(goscripttmreversetranscriptase，a5003)，包括:goscripttm5xreactionbuffer、mgcl2、pcrnucleotidemix、recombinant
(3)將cdna實(shí)時(shí)熒光定量pcr所用試劑，包括lncrna-kat7實(shí)時(shí)熒光定量pcr特異性引物、gapdh內(nèi)參特異性引物、實(shí)時(shí)熒光定量sybr染料(roche4887352001lightcycler480sybrgreenimaster)、depc水。
檢測(cè)過(guò)程如下：
1、鼻咽癌和癌旁組織總rna提取
(1)新鮮或-80℃凍存組織約20mg左右，加入1mltrizol冰上研磨，可先用剪刀剪碎組織，為防止溢出，一般先加400ultrizol，呆研磨充分，再補(bǔ)齊至1ml。室溫放置5-10min。
(2)按trizol與三氯甲烷的體積比為5比1的比例加入三氯甲烷，渦旋振蕩30s，室溫放置5min，12000g轉(zhuǎn)速4℃離心15min。
(3)吸取約400ul上清層，盡量小心，避免吸取中間固體層，加入400ul異丙醇，上下顛倒混勻，切勿劇烈振蕩。室溫放置10min，12000g轉(zhuǎn)速4℃離心10min。
(4)吸棄上清液，用depc配制濃度為75％的乙醇加入1ml，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上輕輕磕起沉淀，7500g轉(zhuǎn)速4℃離心5min。
(5)吸棄上清層，室溫放置5-10min，加入70左右的pepc水溶解rna，-80℃保存。
(6)用1％的瓊脂糖凝膠，按1ug的rna加1ul6xloadingbuffer混勻，電泳20min左右，凝膠電泳成像系統(tǒng)照相保存，分析。
(7)nanodrop檢測(cè)rna濃度和純度，用depc水調(diào)零，將rna樣品充分混勻，滴加2ul樣品在nanodrop檢測(cè)探頭上，放心測(cè)量臂，測(cè)量rna的濃度，記錄
260/280的比值。
2、將總rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna
采用promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。
配置如下體系:
體系i：
2ugrna溶于depc水中，加1ul隨機(jī)引物，補(bǔ)齊至10ul。與pcr儀上70℃5分鐘，立即冰浴5分鐘。
體系ii如表1所示:
表1
將體系i和體系ii混合，瞬時(shí)離心，放入pcr儀中，程序?yàn)椋?/p>
實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)lncrna-kat7的表達(dá)量
實(shí)時(shí)熒光定量pcr采用羅氏lightcycler480sybrgreenimaster試劑盒。
反應(yīng)體系如下：
儀器采用roche480，實(shí)時(shí)熒光定量pcr程序?yàn)椋?5℃10min預(yù)變性，接40個(gè)循環(huán)：95℃10s，60℃20s，72℃30s。
本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用相對(duì)定量的分析方法，將gapdh作為內(nèi)參基因，計(jì)算公式為：
△ct＝△ctkat7-△ctgapdh
△△ct＝△ct癌組織-△ct非腫瘤組織
相對(duì)表達(dá)量＝log2-△△ct
利用軟件spss18.0行分析實(shí)時(shí)熒光定量pcrlncrna-kat7的相對(duì)表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)36例鼻咽癌組織與10例非腫瘤組織相比，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織的lncrna-kat7的表達(dá)下調(diào)，結(jié)果見(jiàn)圖1。
以上結(jié)果表明，lncrna-kat7可作輔助鼻咽癌診斷的新型分子標(biāo)志物。為鼻咽癌的輔助診斷提供了強(qiáng)有力的分子生物學(xué)工具，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和重要的推廣應(yīng)用前景。
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<110>郴州市第一人民醫(yī)院
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