專利名稱：一種利用miRNA-210為標(biāo)志物的早期低氧檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用miRNA-210為標(biāo)志物的早期低氧檢測(cè)試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
低氧是當(dāng)前病理學(xué)研究的熱點(diǎn)，它包括高原低氧及多種疾病導(dǎo)致的體內(nèi)器官缺氧等。高原低氧即隨著海拔升高，氧濃度逐漸降低，形成高原低壓低氧環(huán)境。高原低氧能導(dǎo)致人體產(chǎn)生一系列生理病理變化，即高原反應(yīng)。疾病導(dǎo)致的體內(nèi)缺氧則是由于血液供應(yīng)不足導(dǎo)致的體內(nèi)局部氧濃度較低，如心肌梗死，中風(fēng)，粥樣動(dòng)脈硬化等心腦血管疾病中，低氧也是重要的治病因素之一。另一方面，低氧也是實(shí)體瘤微環(huán)境的重要特征之一，是臨床上實(shí)體瘤對(duì)放療、化療產(chǎn)生耐受和預(yù)后效果差的重要原因。因此，不論是外界氧濃度的降低還是體內(nèi)局部氧濃度的下降都對(duì)人體健康產(chǎn)生重要的影響。低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia Inducible Factor, HIF)是低氧感知系統(tǒng)的核心部件， 在轉(zhuǎn)錄水平協(xié)同調(diào)控?cái)?shù)百個(gè)蛋白編碼基因。雖然長期以來低氧研究關(guān)注的主要是低氧(特別是HIF)誘導(dǎo)升高的基因，最近低氧抑制的基因也日益受到人們關(guān)注。2007年以來，有多個(gè)研究顯示低氧能誘導(dǎo)特異性microRNAs，并抑制一些有重要功能的基因的表達(dá)。miRNAs 在細(xì)胞生理病理過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。miRNAs的成熟活化形式長約19- 個(gè)核苷酸， 由高等真核生物基因組編碼，miRNA通過和靶基因3’非翻譯區(qū)的部分互補(bǔ)序列配對(duì)，引導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)降解mRNA或阻礙其翻譯。現(xiàn)在普遍認(rèn)為很多基因是通過這種方式調(diào)控的。目前的研究顯示miRNAs通過調(diào)節(jié)一系列基因的表達(dá)能夠參與細(xì)胞的所有代謝過程，包括分化、增殖、凋亡和代謝等。miR-210是低氧誘導(dǎo)因子(HIF)的靶基因，參與多個(gè)基因的調(diào)控，在低氧細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。是一種潛在的能檢測(cè)動(dòng)物和細(xì)胞中受低氧脅迫的標(biāo)志物分子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)miRNA-210表達(dá)量的引物。本發(fā)明的目的還在于提供一種早期低氧檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的目的還在于提供一種非診斷目的的早期低氧檢測(cè)方法。一種檢測(cè)miRNA-210表達(dá)量的引物，所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2 所示。一種早期低氧檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包含序列表中SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2 所示的引物，標(biāo)準(zhǔn)樣品，內(nèi)參引物，反轉(zhuǎn)錄酶，dNTPs, buffer, RNA酶抑制劑和滅菌水。所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為未經(jīng)過低氧處理的動(dòng)物或人的組織樣品中的RNA反轉(zhuǎn)錄成的 cDNA。所述內(nèi)參引物為根據(jù)待檢測(cè)動(dòng)物或人任一高表達(dá)基因序列設(shè)計(jì)的引物。一種非診斷目的的早期低氧檢測(cè)方法，按照如下步驟進(jìn)行
(1)提取待檢樣品的總RNA ；(2)將步驟(1)得到的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；(3)利用權(quán)利要求2或3所述的一種早期低氧檢測(cè)試劑盒，以步驟(2)得到的cDNA 為模板，做定量PCR，檢測(cè)樣品中miRNA-210的表達(dá)量；(4)若待檢樣品的表達(dá)量顯著高于標(biāo)準(zhǔn)樣品的表達(dá)量，則該待檢樣品取自早期低氧的生物組織樣品。本發(fā)明的有益效果


圖1是定量PCR檢測(cè)海拔5000米低壓低氧處理不同時(shí)間后大鼠腦脊液中mir-210
含量的結(jié)果。圖2是定量PCR檢測(cè)海拔5000米低壓低氧處理不同時(shí)間后大鼠腦組織中mir-210
含量的結(jié)果。圖3是定量PCR檢測(cè)海拔5000米低壓低氧處理不同時(shí)間后大鼠血液中mir-210
含量的結(jié)果。圖4是定量PCR檢測(cè)不同氧濃度和處理時(shí)間下神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液中mir-210含量的結(jié)果。圖5是定量PCR檢測(cè)不同氧濃度和處理時(shí)間下神經(jīng)干細(xì)胞中mir-210含量的結(jié)^ ο
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。以下實(shí)施例未說明的實(shí)驗(yàn)步驟參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，或參照相應(yīng)試劑盒的說明書。實(shí)施例1樣品準(zhǔn)備將M只平均體重250g的SD大鼠(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供)分為4組， 分別是對(duì)照組、低氧0. 5小時(shí)組、低氧1小時(shí)組和低氧2小時(shí)組。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物分別在低氧艙中給予5000米低壓低氧處理不同時(shí)間。低氧艙以20米/秒的速度勻速升至5000米，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后以20米/秒速度勻速降至常氧。大鼠低氧處理結(jié)束后立即用戊巴比妥鈉麻醉，取腦組織、腦脊液和血液用于miRNA-210的檢測(cè)。取孕13. 5天的wistar大鼠稱重后用戊巴比妥納(用量60_65mg/kg)腹腔注射麻醉。腹部用75%酒精消毒，置于超凈臺(tái)中。剪開大鼠腹部，取出子宮置于預(yù)冷的解剖液中， 除去胎膜，分離出胎鼠。將胎鼠放于平皿中置于解剖鏡下，剝?nèi)ツX膜，分離出中腦，放入1毫升解剖液中，加入1毫升0. 25%的胰酶37度消化半小時(shí)。然后用含胎牛血清的DMEM/ F12培養(yǎng)基終止消化。700rpm離心4分鐘，棄上清，用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基洗一次，除去殘留的血清和胰酶。用神經(jīng)干細(xì)胞增殖液重懸細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。將剛分離的第一代神經(jīng)干細(xì)胞記為PO代，PO代的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)至四天左右即成為懸浮的神經(jīng)細(xì)胞球。我們將神經(jīng)球低速離心(600rpm，^iin)后棄去上清，用0. 25%的胰酶消化三分鐘，然后用含胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，低速離心(eOOrpmdmin)后棄上清，再用細(xì)胞培養(yǎng)液重復(fù)洗兩次后，用細(xì)胞增殖的完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)后將細(xì)胞用完全培養(yǎng)液按1.5*105個(gè)/ml密度接種到培養(yǎng)瓶中，置孵育箱培養(yǎng)。傳代的神經(jīng)干細(xì)胞P2 至P6代用于進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)的研究。將分組的神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管，900rpm離心5min，取兩份250微升培養(yǎng)液加入 750微升Trizol LS中混勻，細(xì)胞沉淀加入1毫升Trizol裂解混勻。大鼠腦組織樣品收集 將分組的大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，用1毫升注射器從椎骨大孔進(jìn)針吸取腦脊液50-100微升，4度IOOOrpm離心5min，上清加入0. 5毫升Trizol LS中混勻。沒IOOmg腦組織加入1 毫升Trizol在勻漿器中勻漿。按照1 1000的用量在細(xì)胞上清液和腦脊與Trizol LS的混合物中加入外參(mir-Cel-5%iimiCS)。樣品與1Trizol的混合物可保存在_80度，實(shí)驗(yàn)時(shí)從-80度冰箱取出，室溫放置20分鐘。實(shí)施例2大鼠腦組織、腦脊液、血液、神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液中RNA的抽提(1)樣品(大鼠腦組織、腦脊液、血液、神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液)室溫放置 5分鐘，從-80度冰箱取出的樣品室溫放置15分鐘至融化。(2)每毫升TRIZOL加200微升三氯甲烷，劇烈晃動(dòng)15秒，室溫靜置3分鐘。(3) 4度12000g離心15分鐘，上層為RNA(4)將上層水相約500微升轉(zhuǎn)移到新EP管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻 10秒，置于-20冰箱沉淀兩小時(shí)或過夜。(5)取出樣品，4度12000g離心15分鐘，倒掉上清加入1毫升75%乙醇(DEPC)洗滌沉淀，上下翻轉(zhuǎn)十次，使白色RNA沉淀浮起，7500g離心5分鐘，共進(jìn)行兩次。(6)棄上清，吸盡管中液體，使乙醇揮發(fā)干凈(約2-5分鐘)(7)待RNA沉淀邊緣開始變干透明時(shí)，立即加入DEPC水(20微升左右)。取1微升用于定量，其它RNA與-80度保存?zhèn)溆谩？杉尤?微升RNAase inhibiter防止RNA降解。實(shí)施例3反轉(zhuǎn)錄采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液、血液和大鼠腦脊液RNA樣品每個(gè)樣品各取10微升RNA 樣品分別和mir-210(SEQ ID No. 3)及cel-M (SEQ ID No. 4)的特異性翻轉(zhuǎn)引物混合，70度水浴10分鐘，冰上放置兩分鐘。然后每個(gè)樣品分別加入buffer 4微升，dNTP 2微升，反轉(zhuǎn)錄酶 1 微升，RNAase inhibitor 1 微升。 對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞和大鼠腦組織RNA樣品每個(gè)樣品取2微克RNA分別和 miRNA-210(SEQ ID No. 3)及U6 (SEQ ID No. 5)的特異性翻轉(zhuǎn)引物混合，70度水浴10分鐘， 冰上放置兩分鐘。然后每個(gè)樣品分別加入buffer 4微升，dNTP 2微升，反轉(zhuǎn)錄酶1微升， RNAase inhibitor 1微升。翻轉(zhuǎn)好的cDNA在-20度保存，避免反復(fù)凍融。實(shí)施例4定量-PCR按照實(shí)驗(yàn)分組，每個(gè)樣品檢測(cè)內(nèi)參和mir-210的含量。PCR正向引物和反向引物如序列表中SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組三個(gè)復(fù)孔，體系為15微升，儀器為 ABI公司，sybgreen為ABI公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)體系為25微升2*sybgreen mix，21微升水，兩微升引物，兩微升Cdna。PCR反應(yīng)條件是95度5分鐘，95度10秒，60度20秒，70度15秒，40個(gè)循環(huán)，溶解曲線為70度到95度，溫度間隔為0. 4度。PCR結(jié)果如圖1-5所示，隨著低氧時(shí)間的增加，腦脊液中的mir-210拷貝數(shù)上升，在低氧0. 5到1小時(shí)達(dá)到極顯著(圖1)；腦組織中mir-210的拷貝數(shù)在1到2小時(shí)內(nèi)上升，達(dá)到極顯著(圖2)；血液中的mir-210的拷貝數(shù)在0.5小時(shí)的低氧時(shí)間內(nèi)急速上升，以后略有下降，在0.5小時(shí)時(shí)達(dá)到極顯著(圖3)；神經(jīng)干細(xì)胞上清中mir-210的拷貝數(shù)在不同低氧脅迫處理的濃度下，均在1小時(shí)達(dá)到極顯著(圖4)；神經(jīng)干細(xì)胞中mir-210的拷貝數(shù)在 0. 5小時(shí)達(dá)到極顯著(圖5)；以上結(jié)果均表明，低氧脅迫處理均使mir-210的拷貝數(shù)增加。實(shí)施例5實(shí)施例1-4的結(jié)果表明，miRNA-210表達(dá)量在低氧脅迫時(shí)表達(dá)量上升，可作為檢測(cè)低氧脅迫的標(biāo)志物分子，根據(jù)這個(gè)結(jié)果和GeneBank上公布的miRNA-210的基因序列，設(shè)計(jì)檢測(cè)miRNA-210表達(dá)量的通用引物和早期低氧檢測(cè)試劑盒，引物的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2所示；試劑盒包含序列表中SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2所示的引物，標(biāo)準(zhǔn)樣品，內(nèi)參引物，反轉(zhuǎn)錄酶，dNTPs, buffer, RNA酶抑制劑和滅菌水；標(biāo)準(zhǔn)樣品為未經(jīng)過低氧處理的動(dòng)物或人的組織樣品中的RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA ；內(nèi)參引物為根據(jù)待檢生物體(人類和動(dòng)物)任一大量穩(wěn)定表達(dá)的基因的序列設(shè)計(jì)的引物。試劑盒的使用方法如下(1)提取待檢樣品的總RNA ；(2)將步驟(1)得到的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；(3)利用權(quán)利要求2或3所述的一種早期低氧檢測(cè)試劑盒，以步驟⑵得到的cDNA 為模板，做定量PCR，檢測(cè)樣品中miRNA-210的表達(dá)量；(4)若待檢樣品的表達(dá)量顯著高于標(biāo)準(zhǔn)樣品的表達(dá)量，則該待檢樣品取自早期低氧的生物組織樣品。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)rniRNA-210表達(dá)量的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2 所示。
2.一種早期低氧檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求1所述的引物，標(biāo)準(zhǔn)樣品，內(nèi)參引物，反轉(zhuǎn)錄酶，dNTPs, buffer, RNA酶抑制劑和滅菌水。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種早期低氧檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為未經(jīng)過低氧處理的動(dòng)物或人的組織樣品中的RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA。
4.一種非診斷目的的早期低氧檢測(cè)方法，其特征在于，按照如下步驟進(jìn)行(1)提取待檢樣品的總RNA；(2)將步驟⑴得到的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；(3)利用權(quán)利要求2或3所述的一種早期低氧檢測(cè)試劑盒，以步驟(2)得到的cDNA為模板，做定量PCR，檢測(cè)樣品中miRNA-210的表達(dá)量；(4)若待檢樣品的表達(dá)量顯著高于標(biāo)準(zhǔn)樣品的表達(dá)量，則該待檢樣品取自早期低氧的生物組織樣品。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于分子生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的一種利用miRNA-210為標(biāo)志物的早期低氧檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明設(shè)計(jì)miRNA-210特異性的引物，采用定量PCR的方法檢測(cè)不同濃度的低氧環(huán)境對(duì)大鼠腦脊液、血液、腦組織以及神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液中miRNA-210的含量變化，含量顯著增高為低氧脅迫組織。本發(fā)明的方法簡單，迅速，靈敏，適用于檢測(cè)動(dòng)物和細(xì)胞是否處于低氧狀態(tài)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102268483SQ20111022892
公開日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2011年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月10日
發(fā)明者劉朝暉, 吳麗穎, 吳奎武, 朱玲玲, 王飛, 范明, 趙彤, 黃欣 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所