本發(fā)明涉及基因芯片雜交組件，更詳細地說，本發(fā)明涉及一種針對于不同gc％含量dna序列進行檢測的基因芯片雜交組件。

背景技術：

基因芯片為一種生物芯片，已廣泛用于基因測序、基因診斷等。其中，基因診斷已作為一種重要的醫(yī)學方法來預測疾病、指導用藥。

基因診斷的原理是在載體上固定上寡核苷酸探針，并將靶dna片段與之雜交顯色，來判斷特定的dna片段中其堿基是否存在突變。在高通量基因芯片檢測過程中，現(xiàn)有技術常通過調(diào)節(jié)探針長度及探針gc含量來統(tǒng)一雜交溫度，確?；蛐酒s交信號的穩(wěn)定。但隨著基因芯片通量的上升，該方法的難度呈指數(shù)增長，并且該方法無法解決所有高通量基因芯片雜交溫度問題。

由于不同gc％含量的dna片段其在基因芯片上的雜交溫度不一樣，現(xiàn)有技術中在同一張芯片上通常只能檢測一種dna序列或者幾種gc％含量相近的dna序列，而無法在同一張芯片上檢測gc％含量有一定差異的不同dna序列。

技術實現(xiàn)要素：

為解決上述的不同gc％含量的dna片段難以在同一張芯片上雜交的技術問題，本發(fā)明提供一種基因芯片雜交組件。

本發(fā)明基因芯片雜交組件，包括至少兩種具有不同gc％含量的探針和雜交溶液；其中，所述探針序列的gc％含量范圍在10％-80％；所述雜交溶液包含甜菜堿和zn²⁺。基于基因芯片雜交的目的，本發(fā)明通過雜交溶液提供目的片段，用于與固定在基因芯片上的探針雜交結合。利用本發(fā)明基因芯片雜交組件，可對包含有與探針進行互補配對的dna序列進行檢測，對樣品進行基因型判斷。

本發(fā)明基因芯片雜交組件中探針序列的gc％含量范圍在10％-80％，亦如本發(fā)明下文實驗結果所揭示的，探針序列之間gc％含量的差異范圍可為0％～70％。優(yōu)選地，探針序列之間gc％含量的差異范圍在20％～65％?？蛇x地例如，探針序列之間gc％含量的差異為20％、30％、35％、45％和65％。

其中，所述雜交溶液主要包括預雜交液、顯色液、抗體抗稀、雜交緩沖液和洗液；其中，所述雜交緩沖液包括緩沖鹽溶液、靶序列、甜菜堿和zn²⁺，ph值范圍在7.0-7.5。其中，靶序列是指由樣品片段提供的dna片段的序列，對于樣品片段僅需滿足能夠與探針進行互補配對的原則即可。

其中，所述甜菜堿濃度范圍1.5m～2.5m，所述zn²⁺濃度范圍10^-4m～10^-2m。優(yōu)選地，所述甜菜堿濃度為2.5m，所述zn²⁺濃度為10^-3m。

其中，所述探針序列片段長度在20bp左右，樣品片段長度在100bp左右。

其中，雜交溫度為31℃。

其中，所述探針序列任意選自包含以下的組：

seqidno.5:5’-atggcccaggcccagccgcg-3’

seqidno.7:5’-acatgcagagacccagcaat-3’

seqidno.9:5’-aattttgagtctttttaaaa-3’

seqidno.4:5’-atggcccaggtccagccgcg-3’

seqidno.6:5’-acatgcagaggcccagcaat-3’

seqidno.8:5’-aattttgagtatttttaaaa-3’

其中,所述樣品片段的序列任意選自包含以下的組：

seqidno.10:

5’-caggcacaacaccttgccgccaggcacaacaccttgccgctg

ggcctgggccatgaccacgctgaccccggcatggctgatggc-3’

seqidno.11:

5’-gggcaactagaaaggctggtggagttgacttagctgagattgctggg

tctctgcatgtcatcccttctgactttctggtgacttcttaggtcattaata-3’

seqidno.12:

5’-acatgttaaaatactatgaagaatgacatcagggattcttttaaaaagac

tcaaaattggctnggtgcggtggctcacacctgtaatcccaacactttg-3’。

本發(fā)明還提出包含所述的雜交組件的試劑盒。

本發(fā)明還提出所述的雜交組件或包含該雜交組件的試劑盒在雜交測定中的應用。其中，所述雜交反應中探針序列gc％含量范圍在10％-80％，與探針結合的目的dna片段需要包含有與探針進行互補配對的序列即可。上述雜交反應包括不同gc％含量dna序列之間進行的雜交，可用于基因芯片的測序和突變檢測、高通量研究。

本發(fā)明還提出利用所述雜交組件進行雜交檢測方法，包括以下步驟：

提供與目的片段雜交的至少兩種基因芯片探針，

提供包含目的dna片段的雜交溶液，

使所述探針與所述目的dna片段經(jīng)雜交、洗滌后，進行信號分析。

本發(fā)明還提出具有不同gc％含量的探針同時雜交的方法，包括將基因芯片上至少兩種gc％含量范圍在10％-80％的探針與雜交溶液中的目的dna片段進行雜交和測定；所述雜交溶液包含甜菜堿和zn²⁺。本發(fā)明通過利用上述雜交組件，實現(xiàn)了將不同gc％含量dna片段在同一張基因芯片同一條件(包括溫度條件)下進行正確雜交，按照本發(fā)明利用具有不同gc％含量的探針同時雜交能夠排除非特異雜交引起的信號。所述探針是任選自seqidno.4至seqidno.9中的兩種或多種，所述目的dna片段是任選自seqidno.10至seqidno.12中的兩種或多種。

本發(fā)明中，

“雜交”是指結合了雜交過程的變性和復性(重新退火)步驟。

“雜交組件”是指用于進行雜交過程(例如使探針與核酸序列結合)的本發(fā)明含水溶液，其中含有雜交溶液及分子探針。

“雜交溶液”是指用于本發(fā)明雜交組件的含水溶液。

本發(fā)明所述雜交組件實現(xiàn)了將不同gc％含量的dna片段在同一基因芯片上進行雜交，并且具有提高雜交的特異性。為實現(xiàn)芯片的高通量研究提供了一種解決方法。

附圖說明

圖1是基因芯片雜交組件構建過程中基因芯片的點樣模式。其中，各號位點對應的片段分別為：0-陽性對照，1-a，2-b，3-c，4-d，5-e，6-f。

圖2是基因芯片雜交組件構建過程中雜交實驗結果。其中，(a)圖所示為空白對照及甜菜堿1.5m組，(b)圖為甜菜堿2m組，(c)圖為甜菜堿2.5m組。

圖3是應用本發(fā)明雜交組件進行基因芯片雜交中的基因芯片的點樣模式。

圖4是實施例2中雜交實驗的結果。

具體實施方式

結合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明。本發(fā)明的實現(xiàn)并不限于下述實施方式，在本領域技術人員所具備的知識范圍內(nèi)所采用的本發(fā)明技術構思下的各種變形、變換、組合和改進均屬于本發(fā)明的保護范圍。

除以下專門提及的內(nèi)容之外，實施本發(fā)明的過程、條件、實驗方法等，均為本領域的普遍知識和公知常識，用于實施本發(fā)明的試劑、材料、設備等均市售可得，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。

雜交儀(上海百傲科技股份有限公司，型號：br-526-24)；點樣儀(上海百傲科技股份有限公司，型號：zsb-yf-490)；掃描儀(博奧生物基因有限公司，型號：luxscan-10k/a)；熒光定量pcr(杭州博日科技有限公司，型號：fqd-48a)；xp基因擴增儀(杭州博日科技有限公司，型號：tc-xp-d)；超微量分光光度計(南京五義科技有限公司，型號：od-1000+)；恒溫金屬浴(杭州博日科技有限公司，型號：hb-100)。

sybrgreenⅰ(生工生物工程(上海)股份有限公司，規(guī)格：“10000×”)、dmso(生工生物工程(上海)股份有限公司，規(guī)格：500ml/瓶)、tris鹽酸鹽(生工生物工程(上海)股份有限公司，規(guī)格：＞99.0％)、tris堿(生工生物工程(上海)股份有限公司，規(guī)格：＞99.9％)均為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。k2hpo4·3h2o(分析純)、kh2po4(分析純)均為國產(chǎn)分析純。甜菜堿(國藥集團化學試劑有限公司，規(guī)格：＞98.0％)；zncl2(永華化學科學(江蘇)有限公司，規(guī)格：＞98.0％)；雜交緩沖液(上海百傲科技股份有限公司，產(chǎn)品編號：20160105)。

實施例1：基因芯片雜交組件的構建

1、不同gc％含量dna片段

150～300bp的不同gc％含量dna片段的制備，是選擇人基因組中不同gc％含量的基因(tpmt、cy、apoedna片段的gc％摩爾含量分別為35％、55％、75％)，采用體外擴增并純化。

本發(fā)明中，用于150～300bp的不同gc％含量dna片段的制備的序列如下

tpmt(seqidno.1)：

gtcttgagaaggttgatgcttttgaagaacgacakaaaagttggggaattgactgtctttttgaaaagttatrtctacttacagaaaagtaaatgagacatagataaaataaaatcacactgacatgtttttgaggaattgaaaattatgctaaagcctgaaaatgtaatggatga

cy(seqidno.2)：

tggagagtggcataggagatacccacgtatgtaccacccagcttaacgaatgctctactgtcatttctaaccataatctctttaaagagctcttttgtctttcartatctcttccctgtttggaccacattacccttcatcatatgaagccttgggtggctcctgtgtgagactcttgctgtgtgtcacaccctaatgaactagaacctaaggttgctgtgtgtcg

apoe(seqidno.3)：

cggtggcggaggagacgcgggcacggctgtccaaggagctgcaggcggcgcaggcccggctgggcgcggacatggaggacgtgtgcggccgcctggtgcagtaccgcggcgaggtgcaggccatgctcggccagagcaccgaggagctgcgggtgcgcctcgcctcccacctgcgcaagctgcgtaagcggctcctccgcgatgccgatgacctgcagaagcgcctggcagtgtaccaggccggggcccgcgagggcgccgagc

20bp、100bp左右不同gc％含量dna片段為人工合成。先設計不同gc％含量的dna序列(見表1)，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成并純化。

表1不同gc％含量的dna序列

注：探針a、c、e分別為探針b、d、f片段序列中一個堿基突變得到.探針a、c、e分別與靶序列g、h、i不完全配對互補，雜交得到的為非特異信號；探針b、d、f分別與靶序列g、h、i完全配對互補，雜交得到的為特異性信號.

2、基因芯片

基因芯片的制備的過程如下：

1.把a～f號探針分別用tris溶液溶解，定量至100μm。

2.按探針3μl(探針終濃度為5μm)、tris溶液27μl、點樣液30μl的比例配置點樣溶液。

3.把點樣溶液加入點樣板中，放入點樣儀，再加入經(jīng)過常規(guī)處理的載玻片，在載玻片上進行探針的點樣固定，得到需要的芯片。

其中，探針的點樣固定方式為，將上述合成的序列a、b、c、d、e、f作為檢測目標序列g、h、i的探針于基因芯片上進行點樣。點樣方式如圖1所示。

3、基因芯片雜交組件的構建

【溶液的配制】

熒光染色劑稀釋液：規(guī)格為“10000×”的sybrgreenⅰ溶液用dmso稀釋10000倍，備用。

磷酸鹽緩沖液：分別稱取k2hpo4·3h2o和kh2po4，分別配制成50mm的溶液，兩種磷酸鹽溶液調(diào)節(jié)ph至7.4左右，備用。

tris鹽緩沖液：分別稱取tris鹽酸鹽和tris堿，分別配制成400mm的溶液，兩種tris溶液調(diào)節(jié)ph至7.4左右，備用。

【制備te值待測樣品】

對照組：熒光染色劑稀釋液1μl、磷酸鹽溶液(終濃度5mm)、tris鹽溶液(終濃度5mm)，加入適量dna溶液(使定量后dna終濃度為4ng/μl)，用超純水定量至40μl。

甜菜堿實驗組：熒光染色劑稀釋液1μl、磷酸鹽溶液(終濃度5mm)、tris鹽溶液(終濃度5mm)，加入適量dna溶液(使定量后dna終濃度為4ng/μl)，甜菜堿溶液(使定量后終濃度分別為1m、2m、3m、4m、5m)，用超純水定量至40μl。

zn²⁺實驗組：熒光染色劑稀釋液1μl、磷酸鹽溶液(終濃度5mm)、tris鹽溶液(終濃度5mm)，加入適量dna溶液(使定量后dna終濃度為4ng/μl)，zn²⁺溶液(使定量后終濃度分別為10^-1m、10^-2m、10^-3m、10^-4m)，用超純水定量至40μl。

【熒光定量pcr測定dna片段熔解曲線實驗】

dna片段受不同因素的影響時，熒光熔解曲線圖會出現(xiàn)難以明確判定tm值的情況，故取熒光熔解曲線中熒光信號降為零的溫度(te值，即熒光信號為零的最小溫度)進行考察。將te值待測樣品溶液放入熒光定量pcr儀中，設置熒光定量pcr程序為：30℃30s，65個循環(huán)，每個循環(huán)加1℃。結果如下。

甜菜堿實驗組中150～300bpdna片段的te值，及與對照組的比較，見表2。

表2甜菜堿溶液中不同gc％含量150～300bpdna片段的te值

從表2可見，加入甜菜堿后，不同gc％含量的150～300bp左右dna片段隨著甜菜堿濃度的提高te值呈現(xiàn)降低的趨勢。其中，gc％含量越高的dna片段，te值下降幅度越大。

盡管甜菜堿能夠使不同gc％含量dna片段的te值趨于一致，但是甜菜堿濃度過高(如濃度達到5m左右時)將導致溶液粘度過大，使得在芯片上雜交顯色需要的儀器條件過高甚至難以實現(xiàn)。具體來說，將緩沖溶液粘度設定為“1”，則加入3m甜菜堿的緩沖溶液粘度提高為“3”，由于加入甜菜堿的溶液粘度較正常緩沖溶液高，嚴重縮短了儀器的使用壽命，不利于雜交檢測的進行。

已知二價金屬元素可以影響dna的雙鏈穩(wěn)定性。如，zn²⁺、co²⁺、ni²⁺等二價金屬元素與dna片段結合，可以破壞堿基對之間的氫鍵作用。而dna片段的穩(wěn)定性主要依賴于氫鍵，故過渡金屬離子更容易影響dna雙鏈的穩(wěn)定性。本發(fā)明通過考察zn²⁺、ca²⁺、cu²⁺對不同gc％含量dna片段解鏈溫度的影響，發(fā)現(xiàn)只有zn²⁺對不同gc％含量的dna片段te值的影響存在規(guī)律性，在此基礎上利用zn²⁺與甜菜堿的影響進行協(xié)同作用。實驗結果表明，ca²⁺、cu²⁺對不同gc％含量的dna片段的te值的影響不規(guī)律，協(xié)調(diào)性不強，無法使不同gc％含量的片段達到一致的te值(如下方表格所示)。本發(fā)明在此基礎上提出將zn²⁺加入甜菜堿緩沖溶液的發(fā)明構思，以實現(xiàn)解決不同gc％含量dna片段在基因芯片雜交統(tǒng)一條件的特定技術問題。

ca²⁺實驗組中150～300bpdna片段的te值，及與對照組的比較，見表3。

表3ca²⁺離子溶液中不同gc％含量150～300bpdna片段的te值

cu²⁺實驗組中150～300bpdna片段的te值，及與對照組的比較，見表4。

表4cu²⁺離子溶液中不同gc％含量150～300bpdna片段的te值

表4*注：“/”表示加入cu²⁺后，熒光信號值測定時一直為零。

zn²⁺實驗組中150～300bpdna片段的te值，及與對照組的比較，見表5。

表5zn²⁺離子溶液中不同gc％含量150～300bpdna片段的te值

從表5可見，不同濃度zn²⁺對dna片段存在不同影響。隨著zn²⁺濃度的提高，不同gc％含量的dna片段te值呈現(xiàn)趨于一致的趨勢，直至zn²⁺濃度為10^-3m時，各片段dna雙鏈完全解鏈為單鏈的溫度基本一致。

而當zn²⁺濃度由10^-3m提高為10^-2m時，不同gc％含量的dna片段的te值差異重新變大。至zn²⁺濃度達到10^-1m時，dna溶液有白色沉淀生成，可能原因為zn²⁺濃度過高與dna形成聚合物沉淀。根據(jù)zn²⁺濃度對dna片段影響的實驗結果可見，zn²⁺濃度不宜過高，可在10^-3m至10^-2m之間。較優(yōu)地，zn²⁺濃度為10^-3m。

【雜交實驗】

在研究不同gc％含量dna片段的熔解曲線實驗中，高于5m濃度的甜菜堿實現(xiàn)了不同dna片段te值逐漸趨于一致的目的。但基因芯片雜交時，超過3m的甜菜堿溶液的粘度很大，不利于雜交的進行。本發(fā)明通過進一步引入zn²⁺離子進行調(diào)節(jié)，實現(xiàn)在甜菜堿低濃度時，調(diào)整不同gc％含量的dna片段在基因芯片上的雜交條件，使其在統(tǒng)一實驗條件下就可以進行雜交，簡化實驗操作。

實驗過程：取磷酸鹽溶液(終濃度5mm)、tris鹽溶液(終濃度5mm)，雜交緩沖液90μl，加入g、h、i三種靶序列dna片段(使定容后三個dna片段終濃度都為5*10^-4μm)、甜菜堿溶液和zn²⁺離子溶液，用超純水定量至200μl。設置定量后zn²⁺離子溶液濃度為10^-2m、10^-3m、10^-4m，甜菜堿定量后濃度分別為1.5m、2m、2.5m，制備得到雜交實驗用的雜交溶液，進行梯度實驗。雜交溶液放入雜交儀中進行雜交，雜交溫度設定為31攝氏度。結果如圖2(a)-圖2(c)所示。

在本項雜交實驗中，通過調(diào)節(jié)雜交緩沖液中甜菜堿和鋅離子濃度,從而設置芯片雜交的不同條件，以檢測各因素對雜交結果的影響。實驗結果表明,甜菜堿濃度為2.5m、zn²⁺離子濃度為10^-3m時芯片雜交達到最優(yōu)效果，即芯片上1、3、5號位點沒有非特異信號，2、4、6號位點特異性信號明顯，表明特異性雜交的成功進行。

如圖2表明，在雜交緩沖液中加入甜菜堿和zn²⁺離子，本發(fā)明如圖2表明，在甜菜堿濃度2.5m、zn²⁺離子濃度10^-3m的條件下，實現(xiàn)了將不同gc％含量dna片段在同一條件下進行雜交。尤其地，在甜菜堿濃度2.5m、zn²⁺離子濃度10^-3m的條件下，還實現(xiàn)了消除不同gc％含量dna片段中由于突變引起dna片段的雜交信號。具體參見圖2(a)的甜菜堿：0、zn²⁺離子：0組中，在1、3和5號位點具有明顯信號(非特異性雜交信號)，表示現(xiàn)有雜交條件不適于對具有較大差異gc％含量dna片段同時在同一芯片上進行雜交。而在甜菜堿濃度2.5m、zn²⁺離子濃度10^-3m的條件下，1、3、5號位點的非特異信號明顯變?nèi)跸А?/p>

基于上述實驗結果，本發(fā)明構建得到一種基因芯片雜交組件，其包括至少兩種或更多種具有不同gc％含量的探針和雜交溶液。其中，多種探針序列之間具有較高gc％含量差異，gc％含量差異程度可達到0％～70％，多種探針序列的gc％含量范圍可為10％-80％。本發(fā)明的基因芯片雜交組件中含有雜交溶液，其提供了待檢測的目的片段，雜交溶液的成分包括預雜交液、顯色液、抗體抗稀、雜交緩沖液和洗液。與一般雜交溶液尤其區(qū)別的是，本發(fā)明中雜交溶液中含有包含甜菜堿和zn²⁺。本發(fā)明雜交溶液ph值范圍在7.0-7.5。

本發(fā)明的基因芯片雜交組件，雜交溶液中，甜菜堿濃度1.5m～2.5m、zn²⁺離子濃度在10^-4m至10^-2m之間。較優(yōu)地，zn²⁺濃度為10^-3m。

本發(fā)明基因芯片雜交組件中，舉例來說，探針序列可以任選自以下的：

seqidno.5:5’-atggcccaggcccagccgcg-3’(片段b，gc％含量80％)

seqidno.7:5’-acatgcagagacccagcaat-3’(片段d，gc％含量50％)

seqidno.9:5’-aattttgagtctttttaaaa-3’(片段f，gc％含量15％)

seqidno.4:5’-atggcccaggtccagccgcg-3’(片段a，gc％含量75％)

seqidno.6:5’-acatgcagaggcccagcaat-3’(片段c，gc％含量55％)

seqidno.8:5’-aattttgagtatttttaaaa-3’(片段e，gc％含量10％)

seqidno.10:5’-

caggcacaacaccttgccgccaggcacaacaccttgccgctg

ggcctgggccatgaccacgctgaccccggcatggctgatggc

-3’(片段g，gc％含量69.7％)

seqidno.11:5’-

gggcaactagaaaggctggtggagttgacttagctgagattgctggg

tctctgcatgtcatcccttctgactttctggtgacttcttaggtcattaata

-3’(片段h，gc％含量47％)

seqidno.12:5’-

acatgttaaaatactatgaagaatgacatcagggattcttttaaaaagac

tcaaaattggctnggtgcggtggctcacacctgtaatcccaacactttg

-3’(片段i，gc％含量38.4％)

本發(fā)明基因芯片雜交組中至少包括兩種探針，其序列的gc％含量差異較大，gc％含量范圍在10％-80％。本發(fā)明基因芯片雜交組探針的序列可任意選自seqidno.4至seqidno.9的兩種或更多，樣品片段的序列可任意選自seqidno.10至seqidno.12的兩種或更多。探針和/或樣品片段的個數(shù)多至能實現(xiàn)用于基因芯片上雜交的情形。

舉例來說，本發(fā)明基因芯片雜交組所包括的探針是seqidno.5(gc％含量80％)、seqidno.7(gc％含量50％)、seqidno.9(gc％含量15％)中的任意兩種序列，或者是該三種序列。在該實現(xiàn)方式中，探針序列之間gc％含量的差異范圍在30％～65％，具體探針序列之間gc％含量的差異為30％、35％和65％?；蛘撸景l(fā)明基因芯片雜交組所包括的探針是seqidno.4(gc％含量75％)、seqidno.6(gc％含量55％)、seqidno.8(gc％含量10％)中的任意兩種序列，或者是該三種序列。在該實現(xiàn)方式中，探針序列之間gc％含量的差異范圍在20％～65％，具體探針序列之間gc％含量的差異為20％、45％和65％。本發(fā)明基因芯片雜交組所包括的靶序列是seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12中的任意兩種序列，或者是該三種序列。

實施例2：應用本發(fā)明雜交組件進行基因芯片雜交

【基因芯片】

參考實施例1所述方法，制備基因芯片。其中，點樣到基因芯片上的探針序列如下：

(片段b)seqidno.5:5’-atggcccaggcccagccgcg-3’(gc％含量80％)

(片段d)seqidno.7:5’-acatgcagagacccagcaat-3’(gc％含量50％)

(片段f)seqidno.9:5’-aattttgagtctttttaaaa-3’(gc％含量15％)

(片段a)seqidno.4:5’-atggcccaggtccagccgcg-3’(gc％含量75％)

(片段c)seqidno.6:5’-acatgcagaggcccagcaat-3’(gc％含量55％)

(片段e)seqidno.8:5’-aattttgagtatttttaaaa-3’(gc％含量10％)

點樣模式如圖3所示。圖3中各號位點對應的片段分別為，0-陽性探針，1-6為設計的探針序列，1-a，2-b，3-c，4-d，5-e，6-f。

【雜交溶液】

本發(fā)明基因芯片雜交組件包括至少兩種或更多種探針和雜交溶液。雜交溶液的成分包括預雜交液、顯色液、抗體抗稀、雜交緩沖液和洗液。

預雜交液：主要為鹽溶液，洗滌載玻片，為后續(xù)雜交反應進行準備。

顯色液：主要成分為生物素。生物素可標記寡核苷酸和pcr產(chǎn)物，被生物素標記的序列與固定在載玻片上的核苷酸序列進行雜交，形成專一的核酸雜交體。

抗體抗?。褐饕煞譃閴A性磷酸酶-鏈親和素抗體復合物和蛋白質(zhì)。此復合物與形成的核酸雜交體進行抗原抗體反應，形成三元復合物。該三元復合物催化nbt、bcip顯色反應，產(chǎn)生藍紫色沉淀，從而使雜交體染色?？贵w抗稀中的蛋白質(zhì)可以封阻固相載體非雜交位點。

雜交緩沖液：主要成分為緩沖鹽溶液、鋅離子、甜菜堿、提供靶序列的目的dna片段，調(diào)整ph為7.0-7.5。為雜交顯色反應提供反應環(huán)境，確保實驗的進行；鋅離子和甜菜堿，主要作用為調(diào)節(jié)芯片上不同gc％含量寡核酸片段與雜交溶液中的靶序列的雜交條件，使之實現(xiàn)在統(tǒng)一的條件下進行雜交。甜菜堿選擇較優(yōu)濃度2.5m、zn²⁺離子選擇較優(yōu)濃度10^-3m。

洗液：主要成分為鹽溶液，作用為洗去雜交殘留物，獲得清晰、可視的靶點信號。

【雜交過程】

使用本發(fā)明雜交組件的雜交方法可包括將所述雜交組件用于包含靶核酸序列(很可能呈雙鏈形式)的樣品。通常，為了保證芯片上的探針與靶序列雜交，將樣品加熱，以使靶核酸變性。雜交期間，雜交緩沖液作用于靶序列與芯片上探針的雜交。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明雜交緩沖液實現(xiàn)了將gc％含量具有較大差異的片段以固定在基因芯片上的探針形式在同一條件下與目的片段進行正確雜交，本發(fā)明顯著降低了由于多個探針序列gc％含量的差異所引起的雜交條件的苛刻性。

分別取不低于200ul的顯色液、雜交緩沖液、抗體抗稀加入到已預裝洗液的8聯(lián)條管的相應位置中，將條管放入全自動雜交儀內(nèi)。g、h、i三種單鏈dna片段用作與探針序列雜交的靶序列。

(片段g)seqidno.10:

5’-caggcacaacaccttgccgccaggcacaacaccttgccgctg

ggcctgggccatgaccacgctgaccccggcatggctgatggc-3’

(片段h)seqidno.11:

5’-gggcaactagaaaggctggtggagttgacttagctgagattgctggg

tctctgcatgtcatcccttctgactttctggtgacttcttaggtcattaata-3’

(片段i)seqidno.12:

5’-acatgttaaaatactatgaagaatgacatcagggattcttttaaaaagac

tcaaaattggctnggtgcggtggctcacacctgtaatcccaacactttg-3’

取出芯片，做好標記，將基因芯片放入全自動雜交儀中，運行如下雜交程序：預雜交液，31℃，5min；雜交緩沖液，31℃，30min；洗液1，31℃，6min；洗液1，31℃，6min；洗液2，28℃，5min；洗液2，28℃，5min；抗體液，28℃，20min；洗液2，28℃，5min；洗液2，28℃，5min；洗液3，28℃，3min；顯色液，31℃，30min；預雜交液，28℃，2min；預雜交液，28℃，2min。

反應結束后，取出芯片。將芯片放入芯片識讀儀中，進行圖像掃描與數(shù)據(jù)分析。

【雜交結果】

識讀儀根據(jù)芯片上位點雜交產(chǎn)生的藍紫色斑點來生成光點信號，來判斷每個位點上雜交情況。如圖4所示，雜交結果如下：

1、2位點為同一種堿基序列，其中1位點探針有一個堿基突變，不能與靶序列seqidno.10進行完全雜交，2位點探針可以與靶序列seqidno.10進行完全雜交。

3、4位點為同一種堿基序列，其中3位點探針有一個堿基突變，不能與靶序列seqidno.11進行完全雜交，4位點探針可以與靶序列seqidno.11進行完全雜交。

5、6位點為同一種堿基序列，其中5位點探針有一個堿基突變，不能與靶序列seqidno.12進行完全雜交，6位點探針可以與靶序列seqidno.12進行完全雜交。

由此可見，本發(fā)明通過調(diào)節(jié)雜交緩沖液中的鋅和甜菜堿的量，使不同gc％含量的dna片段在同一個條件下進行雜交，表現(xiàn)為2(片段b)、4(片段d)、6(片段f)位點都有光點信號，信號均勻；1(片段a)、3(片段c)、5(片段e)位點沒有光點信號，即本雜交實驗結果確保了能夠?qū)⒎翘禺愋噪s交區(qū)別開來。

實驗結果表明，采用本發(fā)明基因芯片雜交組件，能夠使序列具有不同gc％含量、且含量范圍在10-80％的多個dna片段在同一張基因芯片上和相同條件下實現(xiàn)同時雜交。并且，采用本發(fā)明基因芯片雜交組件消除了不同gc％含量dna片段中由于突變引起dna片段的非特異性雜交信號。

序列表

<110>上海百傲科技股份有限公司

<120>基因芯片雜交組件、包含該雜交組件的試劑盒、其應用及雜交檢測方法

<160>12

<210>1

<211>176

<212>dna

<213>tpmt（homosapiens）

<400>1

gtcttgagaaggttgatgcttttgaagaacgacakaaaagttggggaattgactgtctttttgaaaagttatrtctacttacagaaaagtaaatgagacatagataaaataaaatcacactgacatgtttttgaggaattgaaaattatgctaaagcctgaaaatgtaatggatga

<210>2

<211>226

<212>dna

<213>cy（homosapiens）

<400>2

tggagagtggcataggagatacccacgtatgtaccacccagcttaacgaatgctctactgtcatttctaaccataatctctttaaagagctcttttgtctttcartatctcttccctgtttggaccacattacccttcatcatatgaagccttgggtggctcctgtgtgagactcttgctgtgtgtcacaccctaatgaactagaacctaaggttgctgtgtgtcg

<210>3

<211>264

<212>dna

<213>apoe（homosapiens）

<400>3

cggtggcggaggagacgcgggcacggctgtccaaggagctgcaggcggcgcaggcccggctgggcgcggacatggaggacgtgtgcggccgcctggtgcagtaccgcggcgaggtgcaggccatgctcggccagagcaccgaggagctgcgggtgcgcctcgcctcccacctgcgcaagctgcgtaagcggctcctccgcgatgccgatgacctgcagaagcgcctggcagtgtaccaggccggggcccgcgagggcgccgagc

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

atggcccaggtccagccgcg

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

atggcccaggcccagccgcg

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

acatgcagaggcccagcaat

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

acatgcagagacccagcaat

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

aattttgagtatttttaaaa

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

aattttgagtctttttaaaa

<210>10

<211>84

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

caggcacaacaccttgccgccaggcacaacaccttgccgctg

ggcctgggccatgaccacgctgaccccggcatggctgatggc

<210>11

<211>99

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

gggcaactagaaaggctggtggagttgacttagctgagattgctggg

tctctgcatgtcatcccttctgactttctggtgacttcttaggtcattaata

<210>12

<211>99

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

acatgttaaaatactatgaagaatgacatcagggattcttttaaaaagac

tcaaaattggctnggtgcggtggctcacacctgtaatcccaacactttg