專利名稱：水產(chǎn)品中致病細(xì)菌檢測基因芯片試劑盒的制作方法
水產(chǎn)品中致病細(xì)菌檢測基因芯片試劑盒
賊綱
本發(fā)明涉及生物芯片技術(shù)檢測水產(chǎn)品中致病細(xì)菌的裝置及方法。
食源性疾病是當(dāng)今世界上最廣泛的公共衛(wèi)生問題之一，目前已知有200多 種疾病可以通過食物傳播，已報道的食源性疾病致病因子有250多種，其中大 部分為細(xì)菌、病毒和寄生蟲；由致病細(xì)菌引起的疾病每年導(dǎo)致成千上萬人的死 亡和無法估量的經(jīng)濟(jì)損失，因此，致病細(xì)菌的快速、準(zhǔn)確檢測與鑒定是控制細(xì) 菌性疾病發(fā)生及疾病診斷與治療的重要手段。
傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、生理生化、選擇培養(yǎng)基等檢測病原菌的方法 存在靈敏度低、特異性差、工作量大、耗時長、通量低等顯著缺點。目前檢驗 檢疫工作中用于檢測和鑒定食源性致病細(xì)菌的主要方法有PCR、 Southern Blot 雜交、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等簡單的分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法。但是免疫 學(xué)技術(shù)(如ELISA)靈敏性高，但容易污染，經(jīng)常出現(xiàn)假陽性；通常采用一種病原 菌一種特異性引物的特定病原體檢查的引物特異性PCR技術(shù)，雖然可以達(dá)到對 單一菌的快速、準(zhǔn)確和方便的診斷目的，但在病原菌未明時，需要多種不同引 物進(jìn)行實驗，這對于病原菌的復(fù)雜性和PCR程序的多樣性來說顯然不名夠理想; 而且PCR的電泳結(jié)果不能作為最終結(jié)論，還需要其他探針雜交實驗的輔助；以 上這些用于食源性微生物檢測的技術(shù)和方法都存在諸多技術(shù)問題，而且在實際中由于病原微生物種類繁多，上述方法很難同時對多種病原微生物進(jìn)行高效的 檢測。
近年來，隨著生物芯片技術(shù)的日趨成熟，高效、快速、準(zhǔn)確、靈敏的生物 芯片被應(yīng)用到越來越多的領(lǐng)域如基因序列分析、雜交、基因突變檢測及多態(tài)性 分析、基因分型、疾病檢測、食品微生物檢測等；該技術(shù)可同時將大量不同的 探針固定于同一支持物上，因而可以一次性對同一樣品進(jìn)行大量序列檢測和核 酸分析；運用生物芯片技術(shù)可以克服其它常用傳統(tǒng)技術(shù)存在的問題，滿足在實 際檢測工作中的快速、高通量、自動化檢測的要求；鑒于生物芯片的這些優(yōu)點， 國內(nèi)外己經(jīng)先后開發(fā)了多種生物芯片用于基因突變及多態(tài)性分析、基因插入或 缺失、臨床診斷、微生物鑒別等多信領(lǐng)域。
發(fā)曰月內(nèi)容
本發(fā)明提供水產(chǎn)品中致病細(xì)菌檢測基因芯片試劑盒。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下水產(chǎn)品中致病細(xì)菌檢測基因芯片試劑盒檢測食源性 致病細(xì)菌的方法，其包括以下步驟
(1) 本發(fā)明的檢測芯片試劑盒由核酸提取試劑、PCR擴(kuò)增試劑、芯片(附 圖)、分子雜交試劑組成。
(2) 根據(jù)待測各種致病細(xì)菌的特異基因序列設(shè)計多對引物和多個改良探 針；所述待測致病菌為霍亂g菌、單核李斯特菌、副溶血弧菌、沙門氏菌、志 賀氏菌、出血性大腸桿菌(0157:H7)、金黃色葡萄球菌、創(chuàng)傷弧菌、耶爾森氏菌、 溶藻弧菌、哈維氏弧菌、擬態(tài)弧菌。
(3) 上述核酸提取試劑可以提取細(xì)菌的基因組DNA 用于下一步PCR擴(kuò)增實驗。
(4) 上述PCR擴(kuò)增試劑可以特異性擴(kuò)增目標(biāo)微生物的特征序列，用于分子 雜交。
(5) 上述芯片上的特異性探針通過希夫堿反應(yīng)結(jié)合到醛基修飾的基片上； 各種探針組成致病菌檢測陣列，其整體構(gòu)成水產(chǎn)品中致病細(xì)菌檢測基因芯片。
(6) 本發(fā)明的水產(chǎn)品中致病細(xì)菌撿測基因芯片與微陣列芯片掃描儀和水產(chǎn) 品中致病細(xì)菌檢測系統(tǒng)配套使用。進(jìn)行檢測時，將擴(kuò)增后的樣品DNA置于芯片 上，當(dāng)目標(biāo)DNA和探針結(jié)合時，通過檢測各檢測位點的熒光情況對目標(biāo)微生物 進(jìn)行定性分析。
本發(fā)明與己有技術(shù)比較，具有如下優(yōu)點和效果
首先，本發(fā)明針對12種致病菌設(shè)計的微陣列芯片可以同時檢測12種食源性
致病細(xì)菌，達(dá)到對水產(chǎn)品進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測的目的。
其次，本發(fā)明可以同時檢測8個樣品，達(dá)到快速檢測多個樣品的目標(biāo)。 再者，本發(fā)明結(jié)合PCR技術(shù)和生物芯片及分子雜交技術(shù)，可以高通量、高靈
敏度的快速進(jìn)行檢驗檢疫。
國翻
附圖
為檢測芯片外觀；
上述附圖序號為1、特異性探針，2、基片
滅雄討
以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述
1、樣品DNA提取將增菌培養(yǎng)的菌液搖勻，以DNA提取試劑結(jié)合吸附柱法提取樣品中的細(xì)菌DNA。
2、 PCR擴(kuò)增細(xì)菌DNA:冰上融化PCR反應(yīng)試劑，按比例與樣品DNA混勻， 置于PCR儀上擴(kuò)增。
3、 雜交將雜交液在42。C溶化后和PCR產(chǎn)物按比例混勻，95。C變性5分 鐘，冰浴5分鐘。把芯片放入芯片雜交盒，蓋上蓋片，通過加樣孔注入15pl變 性后的雜交液，蓋緊雜交盒蓋，于雜交儀中42。C雜交2小時。
4、 清洗雜交完的芯片以42。C預(yù)熱的洗液I和洗液II分別清洗4分鐘，再 以42。C預(yù)熱的蒸餾水清洗一次，1500rpm離心。
5、 芯片掃描及結(jié)果判讀洗凈的芯片使用微陣列掃描儀在水產(chǎn)品中致病細(xì) 菌檢測分析系統(tǒng)下迸行掃描分析，該系統(tǒng)自動對結(jié)果進(jìn)行判讀，給出檢測結(jié)果。
權(quán)利要求
1、水產(chǎn)品中致病細(xì)菌檢測基因芯片試劑盒，該試劑盒包括核酸提取試劑、PCR擴(kuò)增試劑、芯片和分子雜交試劑；其特征在于基因芯片基片上固定了針對霍亂弧菌、單核李斯特菌、副溶血弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、出血性大腸桿菌(O157:H7)、金黃色葡萄球菌、創(chuàng)傷弧菌、耶爾森氏菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌、擬態(tài)弧菌等12種致病細(xì)菌的特異性探針。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的水產(chǎn)品中致病細(xì)菌檢測基因芯片試劑盒，其特征在于 所述芯片可以同時和8個樣品的DNA雜交。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的水產(chǎn)品中致病細(xì)菌檢測基因芯片試劑盒，其特征在于 結(jié)果由水產(chǎn)品中致病細(xì)菌檢測基因芯片分析系統(tǒng)自動判讀。
全文摘要
本發(fā)明涉及水產(chǎn)品中致病細(xì)菌檢測基因芯片試劑盒，該試劑盒包括核酸提取試劑、PCR擴(kuò)增試劑、芯片、分子雜交試劑，構(gòu)成水產(chǎn)品中食源性致病菌檢測芯片試劑盒；其特征在于基片上固定了針對霍亂弧菌、單核李斯特菌、副溶血弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、出血性大腸桿菌(O157:H7)、金黃色葡萄球菌、創(chuàng)傷弧菌、耶爾森氏菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌、擬態(tài)弧菌等12種致病菌的特異性探針；該試劑盒可以同時檢測8個樣品中的12種致病菌，檢測限低至10CFU/25g樣品，檢測過程只需18小時；為無公害水產(chǎn)品致病細(xì)菌的快速檢測提供了理想手段，有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12Q1/68GK101613762SQ20091016373
公開日2009年12月30日 申請日期2009年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月14日
發(fā)明者史雨紅, 宋超霞, 游玉容, 范建忠, 聞偉剛, 黃寶福 申請人:寧波博奧生物工程有限公司