一種檢測豬2型圓環(huán)病毒的基因芯片試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測豬2型圓環(huán)病毒（PCV2）的基因芯片試劑盒，該試劑盒用于檢測豬2型圓環(huán)病毒的方法是基于納米金標(biāo)記探針應(yīng)用于基因芯片建立的。該試劑盒的檢測原理是基因芯片上連接有5’端氨基修飾的寡核苷酸基因探針作為捕獲探針，3’端-巰基修飾的寡核苷酸與納米金顆粒共價連接作為檢測探針，將待檢目標(biāo)核酸與二者以雙探針夾心方式雜交后，通過加入銀顯影液放大，用肉眼觀察或者用平面掃描儀分析結(jié)果，可以定量研究靶序列的雜交。本發(fā)明提供的基因芯片試劑盒檢測PCV2核酸，成本低、操作簡單、靈敏度高，特異性強(qiáng)，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】—種檢測豬2型圓環(huán)病毒的基因芯片試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種檢測豬2型圓環(huán)病毒的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]1997年，Clark、Harding等首次在美國養(yǎng)豬生產(chǎn)者協(xié)會年會上報告了加拿大西部發(fā)生了一種仔豬新病，并根據(jù)其組織病理學(xué)特征命名為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)。自 PMWS 暴發(fā)后，病原學(xué)鑒定證明是由豬2型圓環(huán)病毒(PCV2)引起的，由此開展了對PCV2的深入研究。PCV2感染還可引起其他幾種綜合征和疾病，包括豬皮炎腎病綜合征、繁殖障礙、豬呼吸綜合征、肉芽腫性腸炎、壞死性淋巴腺炎以及滲出性皮炎。該病毒持續(xù)性感染，在感染豬的分泌物和排泄物中可檢測到PCV2的核酸；該病毒能引起豬群發(fā)生原發(fā)感染甚至死亡，嚴(yán)重時使機(jī)體的免疫功能受到損害，導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降，引起并發(fā)或寄發(fā)感染，使病情加重，造成更大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]近年來PCV2感染流行廣泛，造成了養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)損失巨大，引起了人們高度重視。豬2型圓環(huán)病毒感染也是當(dāng)前嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一，且經(jīng)常以亞臨床感染的形式出現(xiàn)，易被忽視。因此，應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)，研制及開發(fā)新型診斷檢測PCV2技術(shù)并將其應(yīng)用于動物疫病的疫情監(jiān)測、診斷、疫情預(yù)警預(yù)報以及疫病的凈化工作極為迫切。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種基于納米金復(fù)合探針的基因芯片試劑盒，該試劑盒能夠用于快速檢測豬2型圓環(huán)病毒(PCV2)核酸。
[0005]本發(fā)明的另一個目的是上述基于納米金復(fù)合探針的基因芯片試劑盒在檢測PCV2核酸上的應(yīng)用。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0007]本發(fā)明提供一種基因芯片，該基因芯片上連接有PCV2核酸的捕獲探針。
[0008]上述基因芯片上連接的PCV2核酸的捕獲探針是:5’-H2N-GTATTGACGTCGGCTAC-3’。
[0009]上述基因芯片的制備方法包括以下步驟:將經(jīng)過氨基修飾的捕獲探針于100°C加熱5min，迅速冰浴90s，將DNA探針濃度2.3 X 10_6~2.3 X 10-8Μ按設(shè)計好的陣列每點3 μ I點在玻片上，然后將玻片在37°C潮濕的環(huán)境下避光放置lh，超輕水洗3-4次去除未共價結(jié)合的探針，之后在42°C恒溫水浴箱上用封閉劑封閉30min，再于恒溫水浴箱上微震蕩下PBS洗3次,然后室溫晾干。
[0010]本發(fā)明還提供一種包含上述基因芯片的用于檢測豬2型圓環(huán)病毒的試劑盒。
[0011]上述試劑盒還包括納米金探針，該探針是:5’ -GGGAGCCTAGCAGTGAC-SH-3’ -納米
金顆粒。
[0012]上述試劑盒還包括用于PCV2核酸中保守區(qū)域擴(kuò)增的引物，洗滌母液A，洗滌母液B，洗滌母液C和銀染液。
[0013]其中，上述用于PCV2核酸中保守區(qū)域擴(kuò)增的引物是:[0014]上游引物5 ’ -TTCTGACTGTGGTTCGCTTG-3 ’ ；
[0015]下游引物5 ’ -ACGTATCCAAGGAGGCGTTA-3 ’。
[0016]上述試劑盒各部分的組分與配比如下:
[0017]洗滌母液A:超純水；
[0018]洗滌母液B:PBS ;
[0019]洗滌母液C:PBN;
[0020]銀染液:硝酸銀水溶液。
[0021]本發(fā)明試劑盒檢測PCV2核酸，包括如下步驟:
[0022]I)靶基因樣品的制備
[0023]提取感染PCV2細(xì)胞的全DNA，通過PCR反應(yīng)對PCV2核酸的保守區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增；
[0024]2)芯片雜交
[0025]PCV2擴(kuò)增產(chǎn)物于100°C加熱5min，然后迅速冰浴2min，加入PBS中，在恒溫雜交箱中密閉輕微搖蕩下50°C雜交120min，芯片取出在40°C預(yù)溫的PBS中洗3次，將納米金標(biāo)記探針加在PBS中預(yù)溫到40°C，與芯片雜 交120min，取出用2 XPBN室溫洗2次；
[0026]3)芯片染色
[0027]將銀染液加入到芯片上，置于25°C顯色，然后肉眼進(jìn)行觀察。
[0028]本發(fā)明用納米金探針代替?zhèn)鹘y(tǒng)的探針標(biāo)記應(yīng)用于基因芯片，綜合了 PCR擴(kuò)增技術(shù)和Southern雜交技術(shù)的優(yōu)勢，研制了一種成本低、操作簡單、靈敏度高，特異性強(qiáng)的PCV2基因檢測技術(shù)。本發(fā)明的試劑盒用于PCV2核酸時，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，可供臨床參考，具有良好的市場前景和應(yīng)用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1是優(yōu)化捕獲探針濃度的芯片掃描圖，其中，A:陽性對照，B:PCV2, C:陰性，從I~6分別為捕獲探針的濃度從2.3 X IO-5M~2.3X 10_10M。
[0030]圖2是優(yōu)化捕獲探針濃度的信號強(qiáng)度學(xué)分析圖，其中，橫坐標(biāo)中E-5至E-1O代表捕獲探針的濃度從2.3 X KT5M~2.3 X ΙΟ—、。
[0031]圖3是PCV2核酸陽性保守片段PCR結(jié)果圖，其中，A:PCV2, B:陰性，C =Marker0
[0032]圖4是DNA-納米金探針對檢測芯片的信噪比的影響結(jié)果圖。
[0033]圖5是不同PCV2擴(kuò)增的濃度在不同銀染時間下的信號強(qiáng)度，其中橫軸的1-6分別代表擴(kuò)增片段的濃度為 10000fM、5000fM、1000fM、500fM、100fM 和 50fM。
[0034]圖6是PCV2納米金芯片檢測I~24號樣品結(jié)果圖。
[0035]圖7是利用PCR方法檢測I~24號樣品結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0036]以下實施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的前提下，對本發(fā)明所作的修飾或者替換，均屬于本發(fā)明的范疇。
[0037]實施例1 一種檢測豬2型圓環(huán)病毒的基因芯片試劑盒
[0038]1、探針合成:
[0039]根據(jù)GenBank中豬2型圓環(huán)病毒編碼結(jié)構(gòu)蛋白的0RF2基因，然后利用DNAStar軟件對各個序列進(jìn)行對比，找出其中高度保守序列。然后利用primerf軟件設(shè)計出特異性引物。最后再在NCBI中比對，將設(shè)計出的特異性引物和豬2型圓環(huán)病毒序列中的0RF2基因進(jìn)行對比,重合率為100%。引物均為上海英駿公司(Invitrogen)合成。
[0040]氨基修飾捕獲探針:5’-H2N-GTATTGACGTCGGCTAC-3’ ；
[0041]巰基修飾檢測探針:5’-GGGAGCCTAGCAGTGAC-SH-3’ ；
[0042]0RF2 保守區(qū)域上游引物:5’ -TTCTGACTGTGGTTCGCTTG-3’ ；
[0043]0RF2 保守區(qū)域下游引物:5’ -ACGTATCCAAGGAGGCGTTA-3’。
[0044]2、納米金探針的制備
[0045]I) 2ml 納米金溶液，4°C, 14000rpm, 20min 離心。
[0046]2)棄去上清液，H2O洗納米金沉淀,4°C, 14000rpm, 20min再次離心,棄去上清留沉淀。
[0047]3) 3 μ IlOOymol 巰基標(biāo)記探針 +47 μ I H2O,混勻。
[0048]4)加入納米金沉淀中，輕輕混勻。4°C，12h自身組裝。
[0049]5)自身組裝的納米金+巰基探針混合液(47 μ I DDW+3 μ 1100 μ mol)，加入40 μ IΤΕ+5μ llmol/L NaCl0 輕輕混勻。置于 4°C，24h。
[0050]6)將上述處理的納米 金樣品,直接4°C, 14000rpm,20min離心。棄去上清,用超純水(DDW)洗沉淀2次，分別4°C，14000rpm, 20min離心。去除多余未結(jié)合的納米金-DNA。4°C保存。
[0051 ] 3、基因芯片的制備
[0052]捕獲探針按照十倍的濃度遞比稀釋，得到一系列的濃度，從2.3X10_5M~
2.3Χ10-10Μ。
[0053]將上述各個濃度下的捕獲探針于100°C加熱5min，迅速冰浴90s。將DNA探針濃度從2.3X10_5M~2.3X10_1°M按設(shè)計好的陣列每點3μl點在玻片上，同時設(shè)置陽性、陰性對照。
[0054]然后將玻片在37°C潮濕的環(huán)境下避光放置lh，DDW洗3~4次去除未共價結(jié)合的探針，之后在42°C恒溫水浴箱上用封閉劑封閉30min，再于恒溫水浴箱上微震蕩下PBS洗3次，然后室溫晾干，備用。
[0055]取PCV2核酸和陽性對照的濃度均為1000fM,于100°C加熱5min，然后迅速冰浴2min。加入Iml0.3M PBS中，將制備好的芯片恒溫雜交箱中密閉輕微搖蕩下50°C雜交120min。芯片取出后，在40°C預(yù)溫的0.1M的PBS中洗3次。將濃度為1.2nM的納米金標(biāo)記探針加在Iml0.1M PBS中預(yù)溫到40°C，與芯片雜交120min，取出用2 XPBN室溫洗2次。并晾干。
[0056]然后用銀染色進(jìn)行染色反應(yīng)，置于25°C顯色8min，然后肉眼進(jìn)行觀察，結(jié)果見圖1和2。從圖中可以看出，當(dāng)捕獲探針的濃度高于2.3X 10? PCV2和陽性對照檢測與陰性的不能區(qū)分，當(dāng)捕獲探針的濃度為2.3X10_8M，檢測效果較好，且當(dāng)捕獲探針的濃度為
2.3X10_8M時，芯片的信號強(qiáng)度最強(qiáng)。
[0057]4、試劑盒內(nèi)其他成分部分的配置
[0058]洗滌母液A是超純水；
[0059]洗滌母液B 是 PBS，其每升中含 NaC18g，KC10.2g，KH2PO40.2g，Na2HPO4.12Η202.9g ；[0060]洗滌母液C 是 PBN，其每升中含 IM NaN03300ml,0.2M Na2HP049.5ml,0.2MNaH2P0430.1ml
[0061]銀染液是硝酸銀水溶液，其濃度是每升中含有250g硝酸銀。
[0062]實施例2試劑盒的測定程序的建立
[0063]1、DNA核酸模板提取和目的核酸片斷擴(kuò)增與鑒定
[0064]I)病毒DNA模板制備
[0065]細(xì)胞收集
[0066]A、用無菌細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞于15ml離心管中，4°C,800rpm/min, IOmin,離心；棄
去上清O
[0067]B、在離心管中加入預(yù)冷的PBSlml到各離心管中，將細(xì)胞沉淀輕輕吹勻，加入到預(yù)冷的EP管中，離心，條件同I。棄去上清。
[0068]C、再次加入預(yù)冷PBSlml洗I次，離心，棄上清。
[0069]D、將 PBS 洗凈，-80°C保存。
[0070]細(xì)胞總DNA提取:
[0071]將PCV2感染細(xì)胞利用QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit提取DNA，而后通過設(shè)計的PCV20RF2的特異性引物擴(kuò)增 PCV20RF2片段，PCR鑒定后，純化片段，作為熒光定量PCR的靶片段。
[0072]2)利用 QIAGEN DNasy Blood & Tissue Kit 提取 DNA
[0073]KM 20 μ I proteinase K 加入到 200 μ I 的細(xì)胞懸液中(含有 PBS)；
[0074]B、在樣品中加入buffer AL200 μ I，顛倒混勻，并且在56°C水浴IOmin ；
[0075]C、在瞬離心，在樣品中加入200 μ I的無水乙醇，顛倒混勻，再瞬離心；
[0076]D、將上述混合液加入到DNeasy Mini spin column中，室溫8000rpm,離心lmin,棄液；
[0077]E、再在 DNeasy Mini spin column 中加入 500 μ I AWl,室溫 8000rpm,離心 lmin,
棄液；
[0078]F、在DNeasy Mini spin column 中加入 500 μ I AW2,室溫 14000rpm,離心 lmin,棄液；
[0079]G、在DNeasy Mini spin column柱子膜中加入水，室溫孵育lmin,室溫8000rpm,離心Imin ;重復(fù)次步驟得到DNA，測定濃度。_20°C保存待用。
[0080]3)將提取total DNA PCR擴(kuò)增PCV20RF2保守片段
[0081]A、利用 Takara PrimeSTAR HS DNA polymerase 試劑盒，PCR 儀 Bio-Rad DNAengine，擴(kuò)增目的片段，具體反應(yīng)物質(zhì)的含量見表1，執(zhí)行條件見表2:
[0082]表1:PCR反應(yīng)具體物質(zhì)的量
[0083]
【權(quán)利要求】
1.一種基因芯片，其特征在于，該基因芯片上連接有豬2型圓環(huán)病毒核酸的捕獲探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述捕獲探針是:5’ -H2N-GTATTGACGTCGGCTAC-3’。
3.權(quán)利要求1或2所述的基因芯片，其特征在于，其制備方法包括以下步驟:將經(jīng)過氨基修飾的捕獲探針于100°C加熱5min，迅速冰浴90s，將DNA探針濃度2.3X10_6~2.3X10_8M按設(shè)計好的陣列每點3μ I點在玻片上，然后將玻片在37°C潮濕的環(huán)境下避光放置lh，超輕水洗3-4次去除未共價結(jié)合的探針，之后在42°C恒溫水浴箱上用封閉劑封閉30min，再于恒溫水浴箱上微震蕩下PBS洗3次，然后室溫晾干。
4.一種檢測豬2型圓環(huán)病毒的基因芯片試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的基因芯片。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，其還包括納米金探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述納米金探針是:5’ -GGGAGCCTAGCAGTGAC-SH-3’ 納米金顆粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，其還包括用于豬2型圓環(huán)病毒核酸中保守區(qū)域擴(kuò)增的引物、洗滌液或銀染液中的一種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述用于豬2型圓環(huán)病毒核酸中保守區(qū)域擴(kuò)增的引物包括上游引物和下游引物，其分別是5’ -TTCTGACTGTGGT TCGCTTG-3’，5’ -ACGTATCCAAGGAGGCGTTA-3’;所述洗滌液包括洗滌液A和洗滌液B和洗滌液C，其分別是超純水、PBS和PBN ;所述銀染液是硝酸銀水溶液。
9.權(quán)利要求4所述的試劑盒在檢測豬2型圓環(huán)病毒核酸上的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，其包括如下步驟: 1)革E基因樣品的制備 提取感染豬2型圓環(huán)病毒細(xì)胞的全DNA，通過PCR反應(yīng)對豬2型圓環(huán)病毒核酸的保守區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增； 2)芯片雜交 豬2型圓環(huán)病毒擴(kuò)增產(chǎn)物于100°C加熱5min，然后迅速冰浴2min，加入PBS中，在恒溫雜交箱中密閉輕微搖蕩下50°C雜交120min，芯片取出在40°C預(yù)溫的PBS中洗3次，將納米金標(biāo)記探針加在PBS中預(yù)溫到40°C，與芯片雜交120min，取出用2 XPBN室溫洗2次； 3)芯片染色 將銀染液加入到芯片上，置于25°C顯色，然后肉眼進(jìn)行觀察。
【文檔編號】C12Q1/68GK103555858SQ201310547668
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月7日
【發(fā)明者】朱珊珊 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院