一種熱帶植物多糖多酚小rna提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熱帶植物多糖多酚小RNA提取方法，該熱帶植物多糖多酚小RNA提取方法包括以下步驟：采樣熱帶植物葉片，凍入液氮，-80℃保存；準備小RNA提取的試劑，CTAB裂解緩沖液、PEG8000沉淀緩沖液、EDC交聯(lián)緩沖液、miRNA?Northern?blotting雜交緩沖液、7%dPAGE、Washing?Buffer；按照小RNA提取的預(yù)處理、Trizol抽提、分級沉淀高分子量RNA、沉淀小RNA，提取小RNA；按照17%dPAGE分離、轉(zhuǎn)膜及交聯(lián)、miRNA雜交及洗膜、小RNA雜交及洗膜、曝光及保存，實現(xiàn)RNA雜交；miRNA?stem-loop?RT-PCR擴增；開展多糖多酚植物小RNA的提取以及檢測分析。本發(fā)明克服了目前植物小RNA提取方法的不足，具有快速、穩(wěn)定、操作簡便的特點，可以針對miRNA和siRNA進行快速提取和檢測分析，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種熱帶植物多糖多酚小RNA提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于RNA提取【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種熱帶植物多糖多酚小RNA提取方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]植物小RNA是一種負調(diào)控因子，根據(jù)序列的特異性在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達、DNA和組蛋白甲基化以及抵抗外源遺傳因子，如病毒、轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)基因的入侵。依據(jù)小RNA的生物合成特點，植物小RNA主要分為兩類:植物小干擾RNA (siRNA, small/shortinterfering RNA)和微 RNA(miRNA，miRNA)。二者長度約為 20 ~25nt，均由類似 RNAe III的核酸內(nèi)切酶Dicer(或Dicer類似蛋白)加工產(chǎn)生，它們的形成既有聯(lián)系又有區(qū)別。微RNA(或miRNA)是一種長度介于20-24nt的單鏈小分子RNA，由III型RNAeDicer從含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本中切割產(chǎn)生。siRNA途徑是由dsRNA引發(fā)的，而miRNA途徑由內(nèi)源性hpRNA誘導。siRNA和miRNA都由DCL (或Dicer類似蛋白)剪切形成，其中與mRNA互補的鏈結(jié)合RNA誘導的沉默復(fù)合體。
[0003]miRNA基因廣泛分布于植物基因組中，在基因組上通常具有獨立的基因座位(locus),轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物自身折疊成不完全配對的發(fā)卡結(jié)構(gòu)(hairpin)。miRNA與祀基因絕大多數(shù)情況下以不完全互補的方式起作用。[0004]小干擾RNA (siRNA)來自長的完全互補的雙鏈RNA，如病毒RNA，反向重復(fù)序列或由依賴于 RNA 的 RNA 聚合酶(RNA dependent RNA polymerase, RdRp)合成的 dsRNA。在擬南芥中siRNA還可以分成反式作用siRNA (trans-acting siRNA, tasiRNA)、內(nèi)源順反轉(zhuǎn)錄本 siRNA (natural cis-antisense siRNA, nat-siRNA)、異染色質(zhì) siRNA (HeterochomaticsiRNA, hcsiRNA),它們的RNA沉默途徑各異。其中反式作用siRNA研究比較清楚，tasiRNA是由內(nèi)源TAS轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生，其生物發(fā)生途徑將miRNA和siRNA生物途徑有機融合，產(chǎn)生級聯(lián)tasiRNA,其中tasiR_ARF3和tasiR_ARF4是兩個保守的siRNA序列，參與擬南芥葉片的極性發(fā)育，在玉米中ragged seedling2編碼AG07_like蛋白，產(chǎn)生的ta-siARFs參與玉米極性發(fā)育。
[0005]獲得高質(zhì)量的小RNA是后續(xù)研究其表達和功能的前提條件。目前，模式植物的小RNA提取方法已經(jīng)非常成熟，采用Trizol或者miRNA kit可以獲得很好的結(jié)果。然而，對于熱帶植物而言，體內(nèi)含有多糖多酚，一般的裂解液既不能去除多糖也不能去除多酚，所以無法很好的提取多糖多酚植物的小RNA，阻礙了其分子生物學方面研究的進展。在RNA提取過程中，細胞破碎后多糖多酚物質(zhì)與RNA發(fā)生作用。酚類化合物被氧化后會與RNA不可逆地結(jié)合，導致RNA活性喪失及在用苯酚、氯仿抽提時RNA的丟失，或形成不溶性復(fù)合物；而多糖會形成難溶的膠狀物，與RNA共沉淀下來；萜類化合物和RNase會分別造成RNA的化學降解和酶解。因此，摸索一種適合多糖多酚植物的小RNA提取方法對于后續(xù)的研究至關(guān)重要。
[0006]Trizol是植物中應(yīng)用最廣泛、最簡便的商業(yè)化總RNA提取方法,開發(fā)Trizol作為植物小RNA提取方法是最簡便和適用的技術(shù)。但是，熱帶植物含有高濃度的多糖多酚，還有單寧以及其他次生物質(zhì)。在植物材料勻漿時，多酚物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì)后與RNA穩(wěn)定地結(jié)合；多糖理化性質(zhì)與RNA很相似，因此很難將它們分開，沉淀后與RNA —起產(chǎn)生凝膠狀沉淀。而Trizol主要成份是異硫氰酸胍和苯酚，即使添加了如2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)或半胱氨酸之類的防止酚氧化的試劑也很難提取。因此，在前期樣品處理的時候去除這些雜質(zhì)是后續(xù)提取聞質(zhì)量小RNA的關(guān)鍵。
[0007]目前，關(guān)于植物小RNA提取方法已有報道。Song et al.(2010)利用Trizol和LiCl 分級沉淀分離柑桔小 RNA (Song et al., 2010) ；Cheng et al.(2010)采用低鹽 CTAB緩沖液提取擬南芥的小RNA (Cheng et al.，2010);還有多糖植物的CTAB方法(Carra etal.，2007; 2009)等都是先分離總RNA，然后再利用LiCl或者PEG8000沉淀大分子RNA，再將上清中的小RNA沉淀從而獲得高質(zhì)量的小RNA。de Fdtima et al.(2011)報道利用LiCl緩沖液和PEG8000不僅可以從擬南芥等模式植物，還可以從仙人掌、龍舌蘭以及香蕉等植物中提取高質(zhì)量的小 RNA 用于 northern blotting 分析(deFdtima et al.，2011)。
[0008]目前，Song et al.(2010) >Carra et al., (2007; 2009)、Cheng et al.(2010)等建立的小RNA提取方法主要針對一些模式植物，而對于多糖多酚的植物小RNA提取方法，只有 de Fatima etal., (2011)有相關(guān)的研究。但是 de Fatima et al., (2011)米用 LiCl緩沖液提取總RNA，結(jié)合LiCl沉淀分離小RNA，并沒有將植物中的多糖多酚有效去除，導致提取的小RNA由于結(jié)合不同的雜質(zhì)，在PAGE電泳過程中出現(xiàn)彌散的電泳譜帶，雜交后出現(xiàn)兩條雜交條帶，這給后續(xù)小RNA的檢測以及功能分析帶來相當?shù)碾y度。
[0009]因此，改良小RNA提取方法，有效去除植物中的多糖多酚雜質(zhì)防止其與小RNA結(jié)合而出現(xiàn)遷移率的變化，快速提取高質(zhì)量的miRNA和siRNA并進行后續(xù)小RNAnorthernblotting和Stem-1oop RT-PCR檢測分析是目前急迫需要解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明實施例的目的在于提供一種熱帶植物多糖多酚小RNA提取方法，旨在解決去除植物中的多糖多酚雜質(zhì)與小RNA結(jié)合而出現(xiàn)遷移率的變化的問題。
[0011]本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，本發(fā)明實施例的熱帶植物多糖多酚小RNA提取方法，該熱帶植物多糖多酚小RNA提取方法包括以下步驟:
[0012]步驟一、采樣熱帶植物葉片,凍入液氮，_80°C保存；
[0013]步驟二、準備小RNA提取的試劑，CTAB裂解緩沖液、PEG8000沉淀緩沖液、EDC交聯(lián)緩沖液、miRNA Northern blotting 雜交緩沖液、7%dPAGE、Washing Buffer ；
[0014]步驟三、按照小RNA提取的預(yù)處理、Trizol抽提、分級沉淀高分子量RNA、沉淀小RNA，提取小RNA ；
[0015]步驟四、按照17%dPAGE分離、轉(zhuǎn)膜及交聯(lián)、miRNA雜交及洗膜、小RNA雜交及洗膜、曝光及保存，實現(xiàn)RNA雜交；
[0016]步驟五、miRNAstem-loopRT-PCR 擴增；
[0017]步驟六、開展多糖多酚植物小RNA的提取以及檢測分析。
[0018]進一步，在步驟二中，提取小RNA的試劑如下:
[0019]CTAB裂解緩沖液:4M異硫氰酸胍，2%w/vCTAB, IOOmMTris-HCLpH8.5，25mM EDTA, 2MNaCl, 2%w/vPVP-40, and2%v/v2-疏基乙醇；
[0020]PEG8000 沉淀緩沖液:20%w/vPEG8000，IM NaCl ；[0021]EDC 交聯(lián)緩沖液 12ml:122.5 μ 112.5Μ1-甲基咪唑ρΗ8.0,0.373gl_ 乙基-3-(3-二
甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽；
[0022]miRNA Northern blotting 雜交緩沖液:5XSSC，20mM NaHP04pH7.2,7%SDS,
3X Denhardt's 溶液；
[0023]17%dPAGE:尿素 12.6g，水 1.25ml, 10XTBE1.5ml, Acr/Bis30%17ml，在微波爐中溶解尿素，待冷卻后加入240 μ 110%ΑΡ,混勻后再加入10 μ l TEMED ；
[0024]Washing Buffer:2XSSC,0.1%SDS。
[0025]進一步，在步驟三中，小RNA提取的具體方法如下:
[0026]第一步,預(yù)處理:
[0027]取2g~3g葉片液氮研磨后將粉末轉(zhuǎn)入DEPC處理過的50ml的離心管中，加入20ml的CTAB-PVPP裂解緩沖液，渦旋不少于30s后將裂解產(chǎn)物放在室溫3_5分鐘，然后12000g4°C 離心 5min ；
[0028]第二步，Trizol抽提:
[0029]離心后的上清轉(zhuǎn)入一干凈的50-ml離心管，加入等體積的Trizol試劑，充分渦旋后室溫放置5min~IOmin ;加入4ml氯仿:異戍醇,氯仿:異戍醇的比值為24:1,潤旋后靜置 3min 離心，I, 2000g4°C離心 IOmin ；
[0030]第三步，分級沉淀聞分子量RNA:
[0031]離心后上清轉(zhuǎn)入另外50ml離心管，65°C孵育15min，然后加入等體積的PEG8000沉淀緩沖液，渦旋后馬上冰浴30min~45min后離心IOmin沉淀高分子量RNA ；
[0032]第四步，沉淀小RNA:
[0033]離心后的上清液加入1/10體積的3M NaAcpH5.2和2.5倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，_20°C沉淀過夜，I, 2000g4°C離心20min，沉淀用80%的乙醇洗滌I次~2次，DEPC水溶解后放入_80°C備用。
[0034]進一步，小RNA雜交的具體方法如下:
[0035]第一步，17%dPAGE分離:
[0036]將提取的小RNA溶入等體積的小RNA Loading buffer, 100°C變性5min后，立即冰浴5min ;變性后的小RNA樣品在17%dPAGE上樣，0.5 X TBE電泳緩沖液，300V電泳3h~6h即可；
[0037]第二步，轉(zhuǎn)膜及交聯(lián):
[0038]將含有RNA的凝膠切下，先在I X TBE轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸潤30s，同時準備好NX中性電荷的尼龍膜和轉(zhuǎn)膜濾紙，進行轉(zhuǎn)膜，從上到下的順序依次是:濾紙-凝膠-NX尼龍膜-濾紙；趕走氣泡后用GETE77PWR半干轉(zhuǎn)膜儀進行轉(zhuǎn)膜，用400mA轉(zhuǎn)膜Ih ;轉(zhuǎn)完膜后將膜放在EDC交聯(lián)緩沖液浸潤的濾紙上，轉(zhuǎn)膜時接觸RNA的一面朝上，60°C烘烤2h后，清水沖洗膜上殘留的EDC交聯(lián)緩沖液，_20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0039]第三步，miRNA雜交及洗膜:
[0040]將交聯(lián)后的膜放入雜交管，接觸RNA的一面朝內(nèi)接觸雜交緩沖液，加入32P-ATP標記的探針后37°C雜交過夜；雜交結(jié)束后倒掉帶有同位素的雜交液，用washing buffer洗膜2次，每次15min~20min ;洗完后用monitor檢測信號,信號過強時繼續(xù)洗膜；
[0041]第四步，小RNA雜交及洗膜:[0042]siRNA雜交，40°C~42°C雜交過夜，探針采用32P-ATP標記，其他與miRNA雜交方法
一致；
[0043]第五步，曝光及保存:
[0044]洗完膜后將膜加載保鮮膜，也可置于拉伸膜上，放在磷屏中曝光30min_3h左右，放入Typoon掃描保存圖片。
[0045]進一步，該熱帶植物多糖多酚小RNA提取方法采用CTAB來沉淀多糖；預(yù)處理的CTAB-PVPP緩沖液中包括三種物質(zhì)，即CTAB沉淀多糖、PVPP結(jié)合多酚、異硫氰酸胍防止RNA降解。
[0046]本發(fā)明提供的熱帶植物多糖多酚小RNA提取方法，采用CTAB-PVPP緩沖液進行樣品的預(yù)處理，結(jié)合Trizol試劑建立了熱帶植物快速、高效的提取方法，獲得的高質(zhì)量小RNA可以作為后續(xù)Northern blotting、stem-loopRT-PCR等檢測分析。本發(fā)明在TRIZOL提取方法前，用CTAB-PVPP緩沖液預(yù)處理樣品預(yù)先去除多糖多酚，結(jié)合Trizol試劑快速提取植物的小RNA，提取的小RNA可以滿足雜交和PCR檢測的需要，為后續(xù)進一步研究小RNA在熱帶植物中的生物學功能提供技術(shù)支持。本發(fā)明克服了目前植物小RNA提取方法的不足，具有快速、穩(wěn)定、操作簡便的特點，可以針對miRNA和siRNA進行快速提取和檢測分析，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0047] 圖1是本發(fā)明實施例提供的熱帶植物多糖多酚小RNA提取方法流程圖；
[0048]圖2是本發(fā)明實施例提供的提取番木瓜(Carica papayaL.)小RNA的雜交結(jié)果示意圖；
[0049]圖3是本發(fā)明實施例提供的提取的小RNA電泳及雜交檢測結(jié)果示意圖；
[0050]圖4是本發(fā)明實施例提供的番木瓜預(yù)測miRNA的實驗驗證以及tasiRNA相關(guān)siRNA的雜交檢測示意圖；
[0051]圖5是本發(fā)明實施例提供的其他熱帶植物提取的小RNA進行雜交以及RT-PCR檢測示意圖；
[0052]圖6是本發(fā)明實施例提供的檢測分析其他熱帶亞熱帶植物中tasiR-ARFs示意圖。【具體實施方式】
[0053]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0054]下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進一步描述。
[0055]如圖1所示，本發(fā)明實施例的熱帶植物多糖多酚小RNA提取方法包括以下步驟:
[0056]SlOl:采樣熱帶植物葉片，凍入液氮，_80°C保存；
[0057]S102:準備小RNA提取的試劑，CTAB裂解緩沖液、PEG8000沉淀緩沖液、EDC交聯(lián)緩沖液、miRNA Northern blotting 雜交緩沖液、7%dPAGE、Washing Buffer ；
[0058]S103:按照小RNA提取的預(yù)處理、Trizol抽提、分級沉淀高分子量RNA、沉淀小RNA，提取小RNA ；[0059]S104:按照17%dPAGE分離、轉(zhuǎn)膜及交聯(lián)、miRNA雜交及洗膜、小RNA雜交及洗膜、曝光及保存，實現(xiàn)RNA雜交；
[0060]S105:miRNA stem-loop RT-PCR 擴增；
[0061]S106:開展多糖多酚植物小RNA的提取以及檢測分析。
[0062]結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明:
[0063]1、材料
[0064]1.1植物材料:熱帶植物采取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所種質(zhì)資源圃，部分樣品采自中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術(shù)學院園藝系溫室大棚中種植的熱帶果樹。采樣部位為植物葉片，采取后立即凍入液氮，-80°C保存直到使用。
[0065]1.2主要試劑
[0066]CTAB 裂解緩沖液:4M 異硫氰酸胍，2%(w/v)CTAB, IOOmM Tris-HCL(pH8.5), 25mMEDTA, 2M NaCl, 2%(w/v) PVP-40, and2%(v/v) 2-巰基乙醇。
[0067]PEG8000 沉淀緩沖液:20% (w/v) PEG8000, IMNaCl。
[0068]EDC 交聯(lián)緩沖液(12ml):122.5u 112.5M1-甲基咪唑(pH8.0)，0.373gl_ 乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)。
[0069]miRNA Northern blotting 雜交緩沖液:5 X SSC, 2 0 mMNaHP04 (pH7.2)，7%SDS, 3 X Denhardt's 溶液。
[0070]17%dPAGE:尿素 12.6g，水 1.25ml, 10 X TBEl.5ml, Acr/Bis (30%) 17ml，在微波爐或者熱水中溶解尿素，待冷卻后加入240iill0%AP，混勻后再加入lOiUTEMED。
[0071]Washing Buffer:2XSSC,0.1%SDS。
[0072]2、小RNA提取步驟
[0073]2.1預(yù)處理
[0074]取2g~3g葉片液氮研磨后將粉末轉(zhuǎn)入DEPC處理過的50_ml的離心管中，加入20ml的CTAB-PVPP裂解緩沖液，渦旋至少30s后將裂解產(chǎn)物放在室溫3min~5min，然后UOOOgfC 離心 5min。
[0075]2.2Trizol 抽提
[0076]離心后的上清轉(zhuǎn)入一干凈的50-ml離心管，加入等體積的Trizol試劑，充分渦旋后室溫放置5min~lOmin。加入4ml氯仿:異戍醇(24:1),潤旋后靜置3min離心，
I,2000g4°C離心 IOmin0
[0077]2.3分級沉淀高分子量RNA
[0078]離心后上清轉(zhuǎn)入另外50-ml離心管，65°C孵育15min，然后加入等體積的PEG8000沉淀緩沖液，渦旋后馬上冰浴30min~45min后離心IOmin沉淀高分子量RNA。
[0079]2.4 沉淀小 RNA
[0080]離心后的上清液加入1/10體積的3MNaAc (pH5.2)和2.5倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，_20°C沉淀過夜，I, 2000g4°C離心20min，沉淀用80%的乙醇洗滌I次~2次，DEPC水溶解后放入_80°C備用。
[0081]3、小 RNA 雜交
[0082]3.117%dPAGE 分離
[0083]將提取的小RNA 溶入等體積的小 RNALoading buffer (ABI, cat.AM8547), 10CTC變性5min后，立即冰浴5min使RNA樣品完全變性。變性后的小RNA樣品在17%dPAGE上樣，0.5 X TBE電泳緩沖液，300V電泳3h~6h即可。
[0084]3.2轉(zhuǎn)膜及交聯(lián)
[0085]將含有RNA的凝膠切下，先在I X TBE轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸潤30s，同時準備好NX中性
電荷的尼龍膜(Hybond-NX'GE)和轉(zhuǎn)膜濾紙，按照說明進行轉(zhuǎn)膜。從上到下的順序依
次是:濾紙-凝膠-NX尼龍膜-濾紙。趕走氣泡后用GETE77PWR半干轉(zhuǎn)膜儀進行轉(zhuǎn)膜，用400mA轉(zhuǎn)膜Ih即可。轉(zhuǎn)完膜后將膜放在EDC交聯(lián)緩沖液浸潤的濾紙上，轉(zhuǎn)膜時接觸RNA的一面朝上，一定避免交聯(lián)緩沖液浸到RNA上，60°C烘烤2h后，清水沖洗膜上殘留的EDC交聯(lián)緩沖液，_20°C保存?zhèn)溆?Kim etal.，2007)。
[0086]3.3miRNA雜交及洗膜
[0087]將交聯(lián)后的膜放入雜交管，接觸RNA的一面朝內(nèi)接觸雜交緩沖液，加入32P-ATP標記的探針后37°C雜交過夜。雜交結(jié)束后倒掉帶有同位素的雜交液，用washingbuffer洗膜2次，每次15min~20min。洗完后用monitor檢測信號，估測陽性區(qū)域的信號應(yīng)該比膜邊緣地方的信號強，并且最好將信號控制在5 μ Ci以內(nèi)，如果信號過強，繼續(xù)洗膜。
[0088]3.4小RNA雜交及洗膜
[0089]siRNA 雜交采用 AmbioiT? 公司的ULTRAhyb.!<.-Oligohybridization buffer(Cat#AM8663)，40°C~42°C雜交過夜。探針采用32P-ATP標記。其他與miRNA雜交方法一致。
[0090]3 .5曝光及保存
[0091]洗完膜后將膜加載保鮮膜或者拉伸膜上，放在磷屏中曝光30min_3h左右，放入Typoon掃描保存圖片。
[0092]4、miRNAstem-loopRT-PCR 擴增
[0093]RT引物的5'末端與miRNAS'末端的后6nt反向互補，引物序列見表1。10 μ g小RNA65。C5min后立即冰浴變性，按照Promega A3500反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行試劑配制。16。C30min，隨后 30。C30s，42。C30s，50。Cls60 個循環(huán)。PCR 采用圖 4 的引物，94° C2min, 94° C15s，60° Clmin35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用4%的瓊脂糖電泳，EB染色凝膠成像拍照。
[0094]表1:本發(fā)明所使用的miRNA引物以及探針序列
[0095]Table 1:miRNA, primer and probe sequences.[0096]
【權(quán)利要求】
1.一種熱帶植物多糖多酚小RNA提取方法，其特征在于，該熱帶植物多糖多酚小RNA提取方法包括以下步驟: 步驟一、采樣熱帶植物葉片,凍入液氮，-80°C保存； 步驟二、準備小RNA提取的試劑，CTAB裂解緩沖液、PEG8000沉淀緩沖液、EDC交聯(lián)緩沖液、miRNANorthernblotting 雜交緩沖液、7%dPAGE、WashingBuffer ； 步驟三、按照小RNA提取的預(yù)處理、Trizol抽提、分級沉淀高分子量RNA、沉淀小RNA，提取小RNA ； 步驟四、按照17%dPAGE分離、轉(zhuǎn)膜及交聯(lián)、miRNA雜交及洗膜、小RNA雜交及洗膜、曝光及保存，實現(xiàn)RNA雜交；
步驟五、miRNAstem-loopRT-PCR 擴增； 步驟六、開展多糖多酚植物小RNA的提取以及檢測分析。
2.如權(quán)利要求1所述的熱帶植物多糖多酚小RNA提取方法，其特征在于，在步驟二中，提取小RNA的試劑如下: CTAB 裂解緩沖液:4M 異硫氰酸胍，2%w/vCTAB，IOOmMTris-HCLpH8.5,25mMEDTA,2MNaCl,2%w/vPVP-40, and2%v/v2-巰基乙醇； PEG8000 沉淀緩沖液:20%w/vPEG8000，IMNaCl ； EDC 交聯(lián)緩沖液 12ml:122.5u 112.5M1-甲基咪唑 pH8.0，0.373gl_ 乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽； miRNANorthernblotting 雜交緩沖液:5XSSC，20mMNaHP04pH7.2，7%SDS，3X Denhardt's 溶液； 17%dPAGE:尿素 12.6g，水 1.25ml, 10XTBE1.5ml, Acr/Bis30%17ml，在微波爐中溶解尿素，待冷卻后加入240iill0%AP，混勻后再加入IOiUTEMED ；
WashingBuffer:2XSSC,0.1%SDS。
3.如權(quán)利要求2所述的熱帶植物多糖多酚小RNA提取方法，其特征在于，在步驟三中，小RNA提取的具體方法如下: 第一步，預(yù)處理: 取2g~3g葉片液氮研磨后將粉末轉(zhuǎn)入DEPC處理過的50ml的離心管中，加入20ml的CTAB-PVPP裂解緩沖液，渦旋不少于30s后將裂解產(chǎn)物放在室溫3分鐘~5分鐘，然后12000g4°C 離心 5min ； 第二步，Trizol抽提: 離心后的上清轉(zhuǎn)入一干凈的50-ml離心管，加入等體積的Trizol試劑，充分渦旋后室溫放置5min~IOmin ;加入4ml氯仿:異戍醇，氯仿:異戍醇的比值為24:1,潤旋后靜置3min 離心，I, 2000g4°C離心 IOmin ； 第三步，分級沉淀高分子量RNA: 離心后上清轉(zhuǎn)入另外50ml離心管，65°C孵育15min，然后加入等體積的PEG8000沉淀緩沖液，渦旋后馬上冰浴30min~45min后離心IOmin沉淀高分子量RNA ； 第四步，沉淀小RNA: 離心后的上清液加入1/10體積的3MNaAcpH5.2和2.5倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，_20°C沉淀過夜，I, 2000g4°C離心20min，沉淀用80%的乙醇洗滌I次~2次，DEPC水溶解后放入_80°C備用。
4.如權(quán)利要求1所述的熱帶植物多糖多酚小RNA提取方法，其特征在于，小RNA雜交的具體方法如下: 第一步，17%dPAGE分離: 將提取的小RNA溶入等體積的小RNALoadingbuffer，100 °C變性5min后，立即冰浴5min ;變性后的小RNA樣品在17%dPAGE上樣，0.5 X TBE電泳緩沖液，300V電泳3h~6h即可； 第二步，轉(zhuǎn)膜及交聯(lián): 將含有RNA的凝膠切下，先在1 X TBE轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸潤30s，同時準備好NX中性電荷的尼龍膜和轉(zhuǎn)膜濾紙，進行轉(zhuǎn)膜，從上到下的順序依次是:濾紙-凝膠-NX尼龍膜-濾紙；趕走氣泡后用GETE77PWR半干轉(zhuǎn)膜儀進行轉(zhuǎn)膜，用400mA轉(zhuǎn)膜Ih ;轉(zhuǎn)完膜后將膜放在EDC交聯(lián)緩沖液浸潤的濾紙上，轉(zhuǎn)膜時接觸RNA的一面朝上，60°C烘烤2h后，清水沖洗膜上殘留的EDC交聯(lián)緩沖液，_20°C保存?zhèn)溆茫? 第三步，miRNA雜交及洗膜: 將交聯(lián)后的膜放入雜交管，接觸RNA的一面朝內(nèi)接觸雜交緩沖液，加入32P-ATP標記的探針后37°C雜交過夜；雜交結(jié)束后倒掉帶有同位素的雜交液，用washingbuffer洗膜2次，每次15min~20min ;洗完后用monitor檢測信號,信號過強時繼續(xù)洗膜； 第四步，小RNA雜交及洗膜: siRNA雜交，40°C~42°C雜交過夜，探針采用32P-ATP標記，其他與miRNA雜交方法一致； 第五步，曝光及保存: 洗完膜后將膜加載保鮮膜，也可置于拉伸膜上，放在磷屏中曝光30min-3h左右，放入Typoon掃描保存圖片。
5.如權(quán)利要求1所述的熱帶植物多糖多酚小RNA提取方法，其特征在于，該熱帶植物多糖多酚小RNA提取方法采用CTAB來沉淀多糖；預(yù)處理的CTAB-PVPP緩沖液中包括三種物質(zhì)，即CTAB沉淀多糖、PVPP結(jié)合多酚、異硫氰酸胍防止RNA降解。
【文檔編號】C12N15/10GK103740698SQ201310547550
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月6日
【發(fā)明者】彭軍, 張賀, 蒲金基, 張欣, 謝藝賢, 漆艷香 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所