人乳頭瘤病毒核酸檢測方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于診斷人乳頭瘤病毒(HPV)感染的檢測方法，以及利用該方法制成的試劑盒檢測患者體內(nèi)分離出的DNA樣本中HPV基因型以診斷其是否屬于所述24個型中的某一型。屬于生命科學(xué)和【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的方法包括一個以PCR為技術(shù)基礎(chǔ)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，包含針對多種型別的熒光標(biāo)記的上游引物和未標(biāo)記簡并下游引物，在特定PCR條件下可在一個反應(yīng)管中同時檢測HPV6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4和cp8304等24種型的DNA，毛細(xì)管變性凝膠電泳后利用測序儀讀取數(shù)據(jù)，利用提供的軟件直接將其分為具體的型。
【專利說明】人乳頭瘤病毒核酸檢測方法和試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于診斷人乳頭瘤病毒（HPV)感染的檢測方法，以及利用該方法 制成的試劑盒檢測患者體內(nèi)分離出的DNA樣本中HPV基因型以診斷其是否屬于所述24個 型中的某一型。屬于生命科學(xué)和【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】：
[0002] 由于感染HPV是引起子宮頸癌的一大原因，所以現(xiàn)在這一研究已成為子宮頸癌預(yù) 防的前沿學(xué)科。在西方工業(yè)化國家，對于所有的惡性腫瘤疾病，子宮頸癌也許是公共預(yù)防措 施做得最好的例子。
[0003] 子宮頸癌是婦女中最常見的惡性腫瘤，主要發(fā)生于多產(chǎn)婦女的早期絕經(jīng)期。每年 全世界有約19萬人死于子宮頸癌，而其中超過3/4的死亡發(fā)生在發(fā)展中國家。子宮頸癌的 發(fā)生率在所有癌癥中排名第七，而在婦女中排名第三，僅次于乳腺癌和大腸癌。在發(fā)展中 國家，少于50 %的患子宮頸癌的婦女能存活5年以上，而在發(fā)達(dá)國家，5年存活率是66 %左 右。
[0004] 在過去的10年中，估計全世界每年有將近371000例新的侵入性子宮頸癌，占到整 個婦女癌癥的10%。子宮頸癌高發(fā)病區(qū)主要位于中南美洲、南非、東非和加勒比地區(qū)，這些 地區(qū)每年的平均發(fā)病率達(dá)到萬分之四。東歐和北美的發(fā)病率低于每年萬分之三，但在巴西 東北部，發(fā)病率要比北美高10倍，一生中累積風(fēng)險性可高達(dá)10%。
[0005] 現(xiàn)有子宮頸癌的篩查技術(shù)可分兩類，基于形態(tài)學(xué)的方法是在細(xì)胞或組織水平檢查 以識別不正常，基于分子生物學(xué)的方法是檢查子宮頸上皮瘤的子宮頸癌的標(biāo)志物。進(jìn)一步 區(qū)分這些方法可根據(jù)他們釋放借助于顯微鏡或物理和電光學(xué)的特性。表1總結(jié)了當(dāng)前各種 子宮頸癌篩查的方法，而其中最關(guān)聯(lián)或最有先兆的方法總結(jié)在如下幾節(jié)。
[0006] Pap細(xì)胞學(xué)：Pap檢測是最早的癌癥檢測方法之一，毫無疑問，它同時也是現(xiàn)代醫(yī) 學(xué)中最有成效的一種方法。Pap檢測主要是檢查子宮頸癌先兆，通過重復(fù)檢測，可以密切監(jiān) 測可疑的或低度異常，或提議病人立即進(jìn)行陰道鏡、細(xì)胞切片檢查，并對高度或嚴(yán)重的損害 進(jìn)行治療。通過Pap檢測預(yù)防侵入性子宮頸癌，可在它還只是上皮組織時就阻止其惡性發(fā) 展。
[0007] 薄層液相為基礎(chǔ)的細(xì)胞學(xué)：ThinPrepTM和Autocyte Prep系統(tǒng)是兩種基于液體的 用于代替?zhèn)鹘y(tǒng)Pap涂片的制片方法。從子宮頸取得的樣本被溶于細(xì)胞保存液而不是直接涂 在玻璃片上。通過這種方法幾乎所有的細(xì)胞都可給予檢測。在傳統(tǒng)Pap涂片法中，約20% 從子宮頸收集的細(xì)胞會被置于玻璃片上，而在薄層樣本中，多余的血細(xì)胞和炎癥細(xì)胞會被 裂解，而含有約50000細(xì)胞的隨機(jī)樣本會由自動細(xì)胞處理機(jī)轉(zhuǎn)移到玻璃片，并形成一薄層 涂片，這涂片經(jīng)染色后由細(xì)胞技術(shù)員進(jìn)行檢查。這種自動的薄層技術(shù)可以使涂片更清晰、均 一，并且沒有血細(xì)胞、炎癥細(xì)胞碎片和細(xì)胞集落這些影響顯微鏡檢測的因子，從而提高對非 典型細(xì)胞、癌癥先兆和癌癥的檢出率。
[0008] 自動化細(xì)胞學(xué)：自動化的系統(tǒng)正處于測試和市場推廣的階段。這些系統(tǒng)包括一種 能自動把子宮頸癌細(xì)胞懸浮液制成標(biāo)準(zhǔn)薄層玻璃片的裝置，及通過計算機(jī)輔助掃描來首先 發(fā)現(xiàn)不正常細(xì)胞，并把這些涂片分離處理以便作進(jìn)一步的人工細(xì)胞學(xué)檢測。這些方法最關(guān) 鍵的優(yōu)點是可減輕因缺乏合格的細(xì)胞學(xué)家而引起的人員緊張。現(xiàn)在在北美和歐洲，有許多 私人公司贊助的比較性實驗正在驗證這些自動化機(jī)器的篩查效率和經(jīng)濟(jì)效益。
[0009] 醋酸法目視篩查（VIA):在低收入國家，目查法已成為一種技術(shù)要求低、能代替細(xì) 胞學(xué)篩查的方法。這些目查法包括直接檢查子宮頸，借助醋酸的目查法（也稱為直接目查 DVI，子宮鏡和輔助目查），低倍鏡醋酸目查（VIAM)，Lugol' s碘酒目查法（VILI)和子宮頸 圖像。
[0010] 篩查中檢查HPV :目前研究人員正在比較HPV檢測與Pap檢測作為子宮頸癌篩查 方法的優(yōu)缺點。由于HPV難以進(jìn)行體外培養(yǎng)，而且不是所有的感染者都有可檢測的抗體反 應(yīng)。因此，HPVDNA的檢測是非介入式檢測HPV感染最好方法。目前HPV檢測的方法主要有 三類：
[0011] 第一類是直接探針結(jié)合，如southern印跡和點印跡，原位雜交過濾法等。這些方 法普遍存在靈敏度低，操作繁瑣等缺點。
[0012] 第二類是信號放大法，大多數(shù)的研究所采用的是唯一經(jīng)FDA批準(zhǔn)的Digene的第一 和第二代Hybrid Capture(HC)系統(tǒng)。另一些用不同的PCR方法來檢測HPV。相比于HC法， PCR的檢測靈敏度更高，但第二代HC2的檢測靈敏度已大大提高，接近于PCR的水平。HC2 檢查是通過微孔板化學(xué)發(fā)光信號擴(kuò)增的核酸雜交技術(shù)，定性檢查子宮頸樣本中高危HPV病 毒，這些病毒通常與子宮頸癌有聯(lián)系，它們是：16、18、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68。
[0013] 第三類是基于PCR的把序列片段擴(kuò)增，PCR方法是用型別特異或通用引物擴(kuò)增目 標(biāo)片段并與特異性探針雜交。實時定量PCR(real-time quantitative PCR)技術(shù)便是一種 具有革命性意義的定量PCR技術(shù)，所謂實時定量PCR是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān) 測熒光信號強(qiáng)弱的變化來M：測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量。實時 PCR技術(shù)較之與以前的以終點法進(jìn)行定量的PCR技術(shù)具有無與倫比的優(yōu)勢。首先，它不僅操 作簡便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特異性。其次，由于是在封閉的體系中完成擴(kuò) 增并進(jìn)行實時測定，大大降低了污染的可能性并且無須在擴(kuò)增后進(jìn)行操作。另外，它還可以 通過不同的引物設(shè)計在同一反應(yīng)體系中同時對多個靶基因分子進(jìn)行擴(kuò)增，即多重擴(kuò)增。
[0014] 基于多重PCR技術(shù)所進(jìn)行的分型技術(shù)有多種，包括：水解探針或Taqman探針、膜 雜交、懸浮芯片等。相比較于水解探針或Taqman探針、膜雜交、懸浮芯片等具有分析靈敏度 高等優(yōu)點，缺點在于價格昂貴。本發(fā)明在使用熒光標(biāo)記引物的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化引物序列和 PCR反應(yīng)體系，使用電泳后讀取熒光的技術(shù)同樣達(dá)到準(zhǔn)確檢測的目的。
[0015] 目前進(jìn)行HPV分型檢測的產(chǎn)品有
[0016] 1.上海之江生物科技有限公司的高危型人乳頭瘤病毒（HPV)分型核酸測定試劑 盒（熒光 PCR 法），分別檢測 13 個型別（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)。
[0017] 2.亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司的人乳頭瘤病毒基因分型（23型）檢測試劑盒 (PCR-反向點雜交法），分別檢測 23 個型別（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、 68、6、11、42、43、44、53、66、73、82、83)。
[0018] 3.上海透景生命科技有限公司的高危型人乳頭瘤病毒核酸檢測試劑盒（流式熒 光雜交法），分別檢測 13 個型別（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)。
[0019] 4.港龍生物技術(shù)（深圳）有限公司的人乳頭瘤病毒分型檢測試劑盒（基因芯片 法），分別檢測 26 個型別（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、6、11、40、42、 43、44、53、54、55、57、66、67、73)。
[0020] 上述專利和產(chǎn)品，分別使用Taqman探針、膜雜交技術(shù)和懸浮芯片技術(shù)，存在通量 低或易污染或者配套耗材價格高等問題使得難以進(jìn)行應(yīng)用于臨床診斷。
[0021] 基于上述內(nèi)容，盡管HPV DNA檢測已發(fā)展諸多技術(shù)，但開發(fā)一種操作簡單、準(zhǔn)確、便 宜及具有多型HPV檢測能力的方法是十分有用的。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0022] 已知與宮頸癌高度相關(guān)的HPV約有20多個型，能導(dǎo)致皮膚疣狀病變的HPV約有5 個型，臨床上需要一種能針對多種HPV進(jìn)行檢測，尤其是能快速、準(zhǔn)確和高通量的方法。結(jié) 合了 PGR的高靈敏度，DNA長度多樣性和光檢測的高精確性等優(yōu)點，具有操作簡單，結(jié)果直 觀和無污染的特點。
[0023] 本方法涉及一種使用熒光標(biāo)記的引物的PGR檢測方法，本方法在在單一管中進(jìn) 行 24 個型別 HPV(6、11、42、43、44、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、53、66、73、 83、MM4和cp8304)的檢測，利用毛細(xì)管電泳后使用測序儀讀取結(jié)果，判讀所檢測人乳頭瘤 病毒的具體型別。
[0024] 為達(dá)到上述目的，采取的技術(shù)方案：
[0025] -種人類乳頭瘤病毒檢測的方法和試劑盒，其特征在于：
[0026] 該試劑盒含有：
[0027] (I)DNA 提?。篘P-40 ;cheIex 100 JRIS-HCL ;
[0028] (2) DNA 聚合酶：Taq DNA 聚合酶；UNG 酶；
[0029] (3) PCR反應(yīng)液：dNTPs，熒光標(biāo)記引物，DNA聚合酶Buffer ;
[0030] (4) PCR反應(yīng)體系：DNA聚合酶選擇Taq HSDNA聚合酶及熒光標(biāo)記引物：
[0031]

【權(quán)利要求】
1. 一種人類乳頭瘤病毒檢測的方法和試劑盒，其特征在于： 該試劑盒含有： (1) DNA 提取：NP-40 ;chelexlOO ;TRIS-HCL。 (2) DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶；UNG酶。 (3) PCR反應(yīng)液：dNTPs，熒光標(biāo)記引物，DNA聚合酶Buffer。 (4) PCR反應(yīng)體系：DNA聚合酶選擇Taq HS DNA聚合酶及熒光標(biāo)記引物，如表1。
表1 (5) 標(biāo)準(zhǔn)品為為SIZ熒光標(biāo)記引物擴(kuò)增的長度為345、355、360、365、370和380的PCR 產(chǎn)物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測，其特征在于將24個型的人類乳頭瘤病毒分為4組，5' 端標(biāo)記熒光基團(tuán)為是FAM、HEX、TAMRA和R0X4種。分組和標(biāo)記方法如表2所述。
表2。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測，其特征在于根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物長度分為6組，分組方法如表 3所述。

表3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中的HPV熒光檢測，使用的方法為多重引物的PCR反應(yīng)，由一組特異 性上游引物和一條下游簡并引物進(jìn)行如下反應(yīng)： A) 模板變性，特征在于，模板變性溫度在95°C。 B) 引物退火及延伸，特征在于，引物退火溫度在52°C，延伸溫度在72°C。 C) 按A-B循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增，特征在于循環(huán)數(shù)為35-45個。
【文檔編號】C12Q1/70GK104293974SQ201310303335
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月19日
【發(fā)明者】浦艷 申請人:浦艷