專利名稱：一種單純皰疹病毒核酸檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種熒光PCR檢測(cè)單純皰疹病毒的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒(Herpes Simplex Viruses, HSV)屬皰疹病毒科，病毒顆粒直徑 約180nm，具雙鏈DNA，根據(jù)其抗原性的差別和DNA序列限制內(nèi)切酶切點(diǎn)不同，分HSV-I和 HSV-2兩型。臨床上HSV可引起顏面和口唇部位的皰疹(顏面皰疹，如"口瘡")，或生殖器 部位的皰疹(生殖器皰疹)等，生殖器官以外部位的HSV感染多由HSV-I型引起(占95%)， 而生殖器官的HSV感染主要由HSV-2型引起(占78% )，但是兩種類型的HSV均能感染這 兩個(gè)部位，也均能夠感染新生兒。一般HSV可在分娩時(shí)通過產(chǎn)道感染給新生兒，引起新生兒 皰疫，導(dǎo)致皮膚、目艮或口腔感染，損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)和其它內(nèi)臟器官，導(dǎo)致智力缺陷，甚至死 亡(死亡率高達(dá)50%，幸存者中多有智力發(fā)育障礙)。人體是HSV的唯一天然宿主，它可在 人體內(nèi)終生潛伏、在適當(dāng)條件下被激活后能引起復(fù)發(fā)感染。近年來，在全球范圍內(nèi)HSV-II 型的流行率持續(xù)上升，而生殖器皰疹雖然以HSV-2為主，但HSV-I也在日益增多。HSV檢測(cè) 既是臨床婦女孕期優(yōu)生優(yōu)育五項(xiàng)(TORCH)檢測(cè)的項(xiàng)目之一，又是性傳播疾病控制預(yù)防中的 一個(gè)令人關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。目前HSV的實(shí)驗(yàn)室常規(guī)診斷采用酶聯(lián)免疫(ELISA)方法，另外還有金標(biāo)抗原、PCR 等方法。ELISA通常檢測(cè)病原的特異性抗體，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，但對(duì)新感染未 產(chǎn)生高抗體滴度或抗體基因突變者敏感性尚低，影響檢出率。金標(biāo)抗原檢測(cè)試劑操作簡單， 適合基層單位使用，但檢測(cè)靈敏度不及ELISA和PCR方法。PCR具有靈敏度極高的特點(diǎn)，可 直接檢測(cè)病原體基因，特別對(duì)于無癥狀及潛伏期感染的HSV患者，PCR方法檢測(cè)具有較高的 臨床價(jià)值。近年來，隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在病原體檢測(cè)中得到廣泛應(yīng) 用，和傳統(tǒng)PCR電泳檢測(cè)方法比較具有許多優(yōu)點(diǎn)(1)其采用的閉管檢測(cè)消擴(kuò)增產(chǎn)物污染問 題，提高了檢測(cè)準(zhǔn)確度；(2)PCR體系中增加了熒光探針，提高了檢測(cè)特異性和靈敏度；(3) 操作迅速，無需傳統(tǒng)PCR的后處理檢測(cè)步驟，自動(dòng)化程度高。如果在反應(yīng)體系中引入內(nèi)參照 和雙波長熒光探針，還能監(jiān)測(cè)因樣本中可能的PCR抑制劑引起的檢測(cè)結(jié)果假陰性。目前尚 未見到有利用單管雙波長實(shí)時(shí)熒光PCR同時(shí)快速檢測(cè)單純皰疹病毒和內(nèi)參照的試劑盒。因此，本發(fā)明提供一種檢測(cè)單純皰疹病毒核酸的方法與試劑盒，其特征在于利用 實(shí)時(shí)雙波長熒光PCR技術(shù)和人工構(gòu)建的內(nèi)參照系統(tǒng)，在單個(gè)反應(yīng)管中檢測(cè)單純皰疹病毒和 內(nèi)參DNA。本發(fā)明可以用于監(jiān)控PCR擴(kuò)增中可能的抑制物，通過采取措施復(fù)檢獲得正確結(jié) 果，從而避免檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性，最終確定樣本是否存在單純皰疹病毒，試劑盒適合于臨 床HSV病原體的快速檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種單管雙波長熒光PCR檢測(cè)單純皰疹病毒和內(nèi)參DNA的方 法和試劑盒，并能避免因PCR抑制物造成假陰性結(jié)果的，試劑盒包括所需的引物和探針，從而可以提高實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)單純皰疹病毒的準(zhǔn)確性，適合在臨床單純皰疹病毒檢測(cè)中推 廣使用。1.實(shí)時(shí)熒光PCR引物探針的設(shè)計(jì)與合成通過對(duì)GenBank中單純皰疹病毒DNA聚合酶(Pol)基因序列查詢，用分子生物學(xué) 專業(yè)軟件對(duì)各種來源的Pol基因序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，其中一個(gè)區(qū)域序列(靶序列SEQ ID No. 1)高度保守并具有很好的同源性，按照TaqMan熒光PCR設(shè)計(jì)的原則，根據(jù)靶序列SEQ ID No. 1設(shè)計(jì)了一對(duì)單純皰疹病毒特異性引物擴(kuò)增其保守區(qū)域，并用5’端FAM標(biāo)記的特異 性TaqMan水解探針法實(shí)時(shí)檢測(cè)。引物和探針堿基序列如下上游引物為5，-gAgAgggACATCCAggACTTTg-3，，如 SEQ ID No. 2 所示；下游引物為5，-TgAgCTTgTAATACACCgTCAgg-3，，如 SEQ ID No. 3 所示；HSV 熒光探針為 5’ -TCACCgCCgAACTgAgCAgACACC-3’ (5’ 標(biāo)記 FAM (6-羧基熒光素)， 3，標(biāo)記TAMRA(6-羧基-四甲基羅丹明)或BHQ(Black HoleQuencher))，同時(shí)檢測(cè)HSV-I 和 HSV-2，如 SEQ ID No. 4 所示。HSV引物探針序列也可以是上述序列按照靶序列SEQ ID No. 1向前或向后延伸 10 20個(gè)核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上。本發(fā)明的另一方面是采用了人工構(gòu)建的內(nèi)參照系統(tǒng)，用于監(jiān)測(cè)樣品擴(kuò)增反應(yīng)中可 能的PCR抑制物，避免檢測(cè)結(jié)果假陰性，內(nèi)參照系統(tǒng)包括內(nèi)參探針和內(nèi)參DNA，其中內(nèi)參探 針采用SEQ ID No. 5序列5，-TTCAgCgAgCgTgggACATCAgg-3，(5，端標(biāo)記 HEX (六氯-6-羧基熒光素)或 J0E(6-羧基_4，，5，- 二氯_2，，7，- 二甲氧基熒光素)、VIC熒光基團(tuán)，3，標(biāo)記TAMRA或 BHQ)，內(nèi)參探針也可以是和上述序列同源性大于85%以上的序列。內(nèi)參照系統(tǒng)中的內(nèi)參DNA為人工構(gòu)建的DNA模板，它含有待檢核酸(HSV DNA)擴(kuò) 增引物中的一條引物序列和另一條引物互補(bǔ)序列、以及內(nèi)參探針序列或其互補(bǔ)序列，并且 一條引物序列和另一條引物互補(bǔ)序列分別位于內(nèi)參探針序列或互補(bǔ)序列的上下游。通過上述設(shè)計(jì)，獲得的一對(duì)引物和探針序列為單純皰疹病毒所特異，而內(nèi)參照系 統(tǒng)包括內(nèi)參探針和內(nèi)參DNA，上述引物探針及內(nèi)參DNA由商業(yè)序列合成公司(上海生工生物 工程技術(shù)服務(wù)有限公司等)合成后用無菌雙蒸水溶解至濃度為25 μ M, -20°C保存。2.試劑盒的制備含有上述引物探針和內(nèi)參DNA的單純皰疹病毒核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針 法)(32人份)，其主要成分如下(1)核酸提取液 1. 5ml，主要成分為 10 50mM NaOH, 5 IOmM EDTA、1% 10% Triton X_100、l% 10% NP-40。(2) PCR 緩沖液 0. 7ml，主要成分有 Tris-HCl (pH8. 3)、KC1、明膠、dATP、dGTP、dCTP、 dUTP、MgCl2、引物。(3)熒光探針0. Iml，含有HSV熒光探針。 (4) Taq酶70 μ 1，含Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG酶)。(5)內(nèi)參照16 μ 1，含內(nèi)參探針和內(nèi)參DNA。(6)陰性對(duì)照200 μ 1，為Vero細(xì)胞培養(yǎng)物。(7)陽性對(duì)照200 μ 1，為HSV-I和HSV-2病毒培養(yǎng)物。
上述組裝成的試劑盒在-20 V保存。由(2) (5)及模板配制的30 μ 1反應(yīng)體系各主要成分濃度如下Tris-HCl (pH8. 3) 10mM、KCl 50mM、明膠 0. lmg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP 各 0· 2 0. 4mM、MgCl22. 5 5mM、弓|物各0. 2 0. 5 μ M、HSV熒光探針及內(nèi)參探針各0. 1 0. 5 μ Μ、
Taq DNA 聚合酶 1 5U、UNG 酶 0. 1 1U。在本發(fā)明另一優(yōu)選例中，由(2) (5)及模板配制的30 μ 1反應(yīng)體系各主要成分 濃度如下Tris-HCl (pH8. 3) IOmM, KCl 50mM、明膠 0. lmg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP 各 0. 3mM、MgCl23. 5mM、引物各 0. 35 μ Μ、HSV 熒光探針 0. 2 μ Μ、內(nèi)參探針 0. 15 μ Μ、Taq DNA 聚 合酶 2U、UNG 酶 0. 2U。3.試劑盒使用方法本發(fā)明試劑盒在樣本單純皰疹病毒檢測(cè)過程中的使用步驟之一為(1)樣本處理使用棉拭子沾取皮膚、眼或口腔粘膜皰疹滲出液，或者用棉拭子采集尿道生殖道 病變部位分泌物，然后將棉拭子置入Iml生理鹽水，充分振蕩搖勻后擠干棉拭子，取漂洗液 在13，OOOrpm離心6分鐘，用移液器小心吸棄上清(為防止吸走沉淀，可保留5 μ 1殘液)。 在沉淀中加入50 μ 1核酸提取液，旋渦振蕩混勻后100°C保持10分鐘，13，OOOrpm離心6分 鐘取上清進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增檢測(cè)。試劑盒陰性和陽性對(duì)照處理方法和樣本液相同。(2)擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒首次開封使用時(shí)，將內(nèi)參照管低速離心數(shù)秒后全部加入到PCR緩沖液中， 在旋渦振蕩器上振蕩混勻使用。按照待檢測(cè)樣本數(shù)n+2，取PCR緩沖液21 X (n+2)、熒光探 針3X (n+2)、Taq酶2X (n+2)組分，混勻后每個(gè)擴(kuò)增管分裝沈μ 1，分別加入按照樣本處 理方法處理的試劑盒陰性對(duì)照、陽性對(duì)照以及上述處理好的η個(gè)樣本模板各4μ 1。每個(gè) 反應(yīng)擴(kuò)增管體積為30μ 1，將上述擴(kuò)增管放到雙通道實(shí)時(shí)熒光PCR儀器上按照50°C 2min、 94°C 2min后94°C 10sec,60°C 45sec循環(huán)40次的程序運(yùn)行。運(yùn)行結(jié)束后結(jié)果按照下表判斷。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明為一種單純皰疹病毒(HSV)核酸檢測(cè)的方法與試劑盒，其特征在于，采用基 于HSV DNA聚合酶基因(Pol)設(shè)計(jì)的一對(duì)引物和一條熒光探針，利用TaqMan探針熒光PCR 技術(shù)在單管中擴(kuò)增檢測(cè)單純皰疹病毒。
2.如權(quán)利要求1所述，其特征在于，所用HSV核酸檢測(cè)方法與試劑盒引物探針根據(jù)HSV Pol基因序列設(shè)計(jì)，一對(duì)引物擴(kuò)增HSV-I和HSV-2型共有靶序列SEQ ID No. 1上連續(xù)70 300個(gè)核苷酸序列，一條TaqMan熒光探針檢測(cè)HSV (包括HSV-I和HSV_2)DNA，所述引物長 度為15 35個(gè)核苷酸，探針長度20 50個(gè)核苷酸。
3.如權(quán)利要求2所述，其特征在于，試劑盒所用的引物序列可以為SEQIDNo. 2和SEQ ID No. 3的序列；HSV熒光探針可以為SEQ ID No. 4序列，其5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3’端 標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)TAMRA或BHQ。引物探針序列也可以是上述序列按照靶序列SEQ ID No. 1向前或向后延伸10 20個(gè)核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上。
4.如權(quán)利要求1所述的方法與試劑盒，其特征在于，引入了一個(gè)人工構(gòu)建的內(nèi)參照系 統(tǒng)用于避免檢測(cè)結(jié)果假陰性，內(nèi)參照系統(tǒng)包括內(nèi)參探針和內(nèi)參DNA。
5.如權(quán)利要求4所述，其特征在于，HSV核酸檢測(cè)方法與試劑盒所用的內(nèi)參探針采用 SEQ ID No. 5序列，探針5，端標(biāo)記HEX或JOE、VIC熒光基團(tuán)，3，端標(biāo)記TAMR或BHQ淬滅基 團(tuán)；內(nèi)參探針也可以是和上述序列同源性大于85 %以上的序列。
6.如權(quán)利要求4所述，其特征在于，所用的內(nèi)參DNA為人工構(gòu)建的DNA模板，它含有待 檢核酸(HSV DNA)擴(kuò)增引物中的一條引物序列和另一條引物互補(bǔ)序列、以及內(nèi)參探針序列 或其互補(bǔ)序列，并且一條引物序列和另一條引物互補(bǔ)序列分別位于內(nèi)參探針序列或互補(bǔ)序 列的上下游位置。
7.如權(quán)利要求1所述方法和引物探針建立的試劑盒，包括核酸提取液、PCR緩沖液、熒 光探針、Taq酶、內(nèi)參照、陰性及陽性對(duì)照。
8.如權(quán)利要求1所述方法和引物探針建立的試劑盒，其特征在于按照以下濃度配制成 的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)Tris-HCl (pH8. 3) IOmM, KCl 50mM、明膠 0. lmg/ml、dATP、dGTP、 dCTP、dUTP各0. 2 0. 4mM、MgCl22. 5 5mM、引物各0· 2 0· 5 μ Μ、單純皰疹病毒熒光探 針和內(nèi)參探針各0. 1 0. 5 μ M、Taq DNA聚合酶1 5U、UNG酶0. 1 1U。
9.如權(quán)利要求1所述試劑盒在HSV快速鑒定中的應(yīng)用，包括以下步驟(1)樣本處理提取模板DNA，樣本為皰疹感染病變部位滲出液或分泌物。(2)模板DNA擴(kuò)增檢測(cè)，以熒光PCR儀上兩個(gè)檢測(cè)通道擴(kuò)增模板的熒光信號(hào)強(qiáng)弱和循環(huán) 閾值來判斷樣品中HSV的存在。
全文摘要
本發(fā)明為一種利用熒光PCR鑒定單純皰疹病毒(HSV)的方法與試劑盒，它采用基于HSV DNA聚合酶基因設(shè)計(jì)的引物探針和人工構(gòu)建的內(nèi)參照系統(tǒng)，利用TaqMan探針雙波長熒光PCR技術(shù)在單管中檢測(cè)單純皰疹病毒和內(nèi)參DNA，以擴(kuò)增模板的熒光信號(hào)強(qiáng)弱和循環(huán)閾值來判斷樣品中HSV的存在。試劑盒組分包括核酸提取液、PCR緩沖液、Taq酶、內(nèi)參照、陰性對(duì)照及陽性對(duì)照；其使用包括樣本處理和擴(kuò)增檢測(cè)兩個(gè)步驟。試劑盒操作簡便快速，靈敏度高，不僅可避免自身PCR產(chǎn)物核酸污染產(chǎn)生的假陽性，而且能解決因樣本中PCR抑制劑引起的假陰性問題，可廣泛應(yīng)用于臨床中該病原體的快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102071261SQ200910199299
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2009年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月24日
發(fā)明者吳大治, 夏懿 申請(qǐng)人:上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司, 上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司