專利名稱：一種檢測甲型h1n1流感病毒rna的靶序列及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種檢測甲型Hmi流感病毒RNA的靶序列及試劑盒。
背景技術(shù)：
甲型流感病毒(Influenza A virus)是正粘病毒科的線狀單股負(fù)鏈RNA病毒，根 據(jù)病毒表面血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)分成許多亞型，目前已發(fā)現(xiàn)的血凝素有16個(gè)亞 型(Hl 16)、神經(jīng)氨酸酶有9個(gè)亞型(附 9)。甲型Hmi流感病毒作為其中的一個(gè)病毒 亞型，病毒顆粒呈多形態(tài)，一般為球形，直徑為80 120nm，有囊膜。囊膜上有許多放射狀排 列的突起糖蛋白，即纖突和刺突，分別是柱狀的血凝素(HA)、蘑菇狀的神經(jīng)氨酸酶(NA)和 膜上的M2基質(zhì)蛋白。病毒顆粒內(nèi)為核衣殼，呈螺旋狀對稱，直徑lOnm，兩端具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)， 存在于病毒的囊膜內(nèi)，由大小不等的8個(gè)獨(dú)立片段組成，基因組大小約為13161Λ。甲型流感病毒基因之間重排、重組現(xiàn)象非常普遍和廣泛，重組變異的病毒株常會 造成不同程度的季節(jié)性流感流行和流感大流行。甲型Hmi流感病毒Q009)作為2009年在 全球引起爆發(fā)和流行的新型重組流感病毒，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)它是由4種病毒重組變異形成的1 種禽流感病毒、1種普通流感病毒和2種在豬之間廣泛傳播的豬流感病毒。人感染了甲型 Hmi流感病毒Q009)后的癥狀與普通人流感相似，包括發(fā)熱、咳嗽、喉嚨痛、身體疼痛、頭 痛、發(fā)冷和疲勞等，有些還會出現(xiàn)腹瀉和嘔吐，重者會繼發(fā)肺炎和呼吸衰竭，甚至死亡。一般流感病毒診斷常用的方法包括血清學(xué)診斷法、病毒分離培養(yǎng)法和特異性抗體 檢測法等。和這些方法比較，熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)具有準(zhǔn)確靈敏、簡 便快速的優(yōu)點(diǎn)，因此目前世界衛(wèi)生組織和國家衛(wèi)生部均推薦采用熒光RT-PCR技術(shù)檢測甲 型Hmi流感病毒Q009)并公布了引物探針序列，由于病毒的高度變異性、以及該序列在設(shè) 計(jì)之初可供參考的病毒株基因公布序列較少，推薦使用的引物探針存在序列和現(xiàn)有公布的 多數(shù)病毒株基因序列錯(cuò)配的問題，從而導(dǎo)致檢測熒光值低、靈敏度不足甚至漏檢。為了準(zhǔn)確 鑒定甲型Hmi流感病毒(2009)，有必要尋找另外的甲型Hmi流感病毒Q009)特異性核苷 酸檢測序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種用于檢測甲型Hmi流感病毒Q009)RNA的靶序列與試劑盒，其特 征在于，采用基于甲型Hmi流感病毒O009)HA和NA基因靶序列設(shè)計(jì)的特異性引物探針， 在單個(gè)反應(yīng)管中通過一步法熒光RT-PCR檢測甲型Hmi病毒RNA。本發(fā)明克服了世界衛(wèi)生 組織推薦使用的引物探針序列和現(xiàn)有公布病毒株基因靶序列錯(cuò)配的不足，所篩選的檢測靶 序列對2009年爆發(fā)的甲型Hmi流感病毒Q009)基因序列具有更高的特異性，從而提高了 檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性，試劑盒適用于疾控和臨床中甲型Hmi流感病毒Q009)的快速鑒 定。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測甲型Hmi流感病毒O009)的靶序列，它包 括來源于該病毒HA和NA基因特定區(qū)域的兩條序列，具有SEQ IDNo. 1和SEQ ID No. 2中連
3續(xù)的70 300個(gè)核苷酸。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測甲型Hmi流感病毒Q009)RNA的試劑盒， 它含有兩對特異性擴(kuò)增甲型Hmi流感病毒Q009)靶序列的引物及相應(yīng)的兩條熒光探針， 所述引物長度為15 35個(gè)核苷酸，探針長度20 50個(gè)核苷酸。一對引物序列中一條序 列與SEQ ID No. 1所示的序列相同，另一條序列與SEQ ID No. 1所示的序列互補(bǔ)；另一對引 物序列中一條序列與SEQ IDNo. 2所示的序列相同，另一條序列與SEQ ID No. 2所示的序列 互補(bǔ)；兩條熒光探針序列分別與SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的序列相同或互補(bǔ)，其中 一條探針5 ’端標(biāo)記FAM (6-羧基熒光素)熒光基團(tuán)，另一條探針5 ’端標(biāo)記HEX (六氯-6-羧 基熒光素)熒光基團(tuán)，兩條探針3’端均標(biāo)記淬滅基團(tuán)如TAMRA(6-羧基-四甲基羅丹明) 或BHQ(Black Hole Quencher)。在另一優(yōu)選例中，所述兩對引物序列可以選自SEQ ID No. 3和SEQ IDNo. 4、SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7 ；所述兩條探針序列可以選自SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 8的序列。 引物探針序列也可以是上述序列向前或向后延伸10 20個(gè)核苷酸的序列，或者和上述序 列同源性大于85%以上。在另一優(yōu)選例中，含有引物探針的試劑盒還包括PCR緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq DNA 聚合酶混合酶(RT/Taq混合酶)、陰性對照及陽性對照。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種快速鑒定樣品中甲型Hmi流感病毒Q009)的 方法，它包括步驟 (1)樣品處理提取模板RNA(2)模板RNA擴(kuò)增檢測用特異性引物和探針進(jìn)行一步法熒光RT-PCR，通過檢測熒光信號的強(qiáng)弱和擴(kuò)增循 環(huán)閾值(Ct值)來檢測樣品中的甲型Hmi流感病毒Q009)RNA。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入廣泛的研究，從國內(nèi)國外公開的甲型Hmi流感病毒株基因序 列中比對篩選出兩條較為保守的核苷酸序列，這兩條序列分別屬編碼病毒顆粒囊膜表面的 血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因特定區(qū)域的一部分，是2009年爆發(fā)的Hmi型病毒本 身特有的結(jié)構(gòu)性、功能性蛋白的基因序列，且序列在Hmi型病毒株之間較為保守，選擇它 們作為擴(kuò)增引物的靶序列，具有很好的特征性，這兩條靶序列具體序列示于SEQ ID No. 1和 SEQ ID No. 2。通過同源性比較，甲型Hmi流感病毒O009)基質(zhì)蛋白基因中有多個(gè)區(qū)域可以作 為病毒RNA檢測的特異性區(qū)域，但SEQ ID No. 1和2所示的核苷酸序列是一種特別優(yōu)選的 適合作為甲型Hmi流感病毒Q009)RNA檢測的序列。因此，基于序列SEQ ID No. 3 8， 本發(fā)明提供了一種應(yīng)用一步法熒光RT-PCR同時(shí)擴(kuò)增HA和NA基因檢測甲型Him流感病毒 (2009) RNA的方法；還提供一種快速檢測甲型Hmi流感病毒Q009)RNA的試劑盒。本發(fā)明的關(guān)鍵是使用了特異性擴(kuò)增病毒基因序列的引物對，以及熒光探針，所述 引物長度為15 35個(gè)核苷酸，探針長度20 50個(gè)核苷酸。一對引物序列中一條序列與 SEQ ID No. 1所示的序列相同，另一條序列與SEQ ID No. 1所示的序列互補(bǔ)；另一對引物序 列中一條序列與SEQ ID No. 2所示的序列相同，另一條序列與SEQ ID No. 2所示的序列互補(bǔ)；兩條熒光探針序列分別與SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的序列相同或互補(bǔ)，其中一 條探針5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，另一條探針5’端標(biāo)記HEX熒光基團(tuán)，兩條探針3’端均標(biāo) 記淬滅基團(tuán)如TAMRA或BHQ。本發(fā)明所用的兩對引物對和兩條熒光探針屬于區(qū)分2009年爆 發(fā)的甲型Him流感病毒Q009)型特異性序列，由于它們和已知公開的甲型Hmi流感病毒 (2009)基因序列同源性好，互補(bǔ)性高，從而減少了兩者之間的錯(cuò)配，因此試劑盒熒光檢測信 號好、檢出極限低、靈敏度高。在一優(yōu)先例中一種快速檢測甲型Hmi流感病毒Q009)RNA的試劑盒，該試劑盒 包括PCR緩沖液、RT/Taq混合酶、陰性對照及陽性對照，其特征是(I)PCR緩沖液含有Tris-HCl、KCl、dNTPs、MgCl2、兩對引物(序列例如SEQ ID No. 3 和4、SEQ ID No. 6和7)、兩條熒光探針(序列例如SEQ ID No. 5和8，一條5，端標(biāo)記FAM熒 光基團(tuán)，另一條5’端標(biāo)記HEX熒光基團(tuán)，兩條探針3’端均標(biāo)記淬滅基團(tuán)如TAMRA或BHQ)、 無菌去離子水。(2) RT/Taq混合酶含有鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(M_MLV RT酶)和I^aqDNA聚合酶。(3)陽性對照含有以SEQ ID No. 1和2序列為模板、經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄獲得的人工RNA。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，由PCR緩沖液、RT/Taq混合酶配制好的熒光RT-PCR 反應(yīng)液包含 IOmM Tris-HCl (pH8. 3), 50mM KCl,3mM MgCl2,0. ；35 μ M 的兩對引物，0. 2 μ M 的 兩條探針、3U M-MLV RT酶和1.5U Taq DNA聚合酶，無菌去離子水。其中引物為SEQ ID No. 3 和 4、SEQ ID No. 6 和 7 序列，熒光探針為 SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 8 序列，SEQ ID No. 5 探針5，端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，SEQ ID No. 8探針5，端標(biāo)記HEX熒光基團(tuán)，兩條探針3，端 均標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ-I。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，陽性對照是以SEQ ID No. 1和2序列為模板、經(jīng)體外 轉(zhuǎn)錄獲得的人工RNA。SEQ ID No. 1和2序列片段插入到pBluescriptIISK+載體質(zhì)粒T7 RNA聚合酶啟動子的序列下游，含有這兩個(gè)序列片段的質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶線性化處理，經(jīng) 純化后作為T7 RNA聚合酶的模板，采用商用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄獲得RNA，該RNA經(jīng)純化后 用分光光度計(jì)法測定濃度并稀釋到lX105cOpy/ml，作為試劑盒陽性對照_20°C保存。本發(fā)明提供的一步法熒光RT-PCR檢測甲型Hmi流感病毒Q009)的試劑盒，經(jīng)過 對反應(yīng)體系各組分，例如引物濃度、熒光探針濃度、Mg2+濃度、退火溫度等的優(yōu)化，將特異性 引物探針篩選技術(shù)和熒光RT-PCR系統(tǒng)相結(jié)合，通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方案，試劑盒能完全滿足快速 特異檢測甲型Hmi流感病毒Q009)的實(shí)際需要。本發(fā)明還提供一種利用本發(fā)明試劑盒檢測甲型Hmi流感病毒Q009)的方法，該 方法包括以下檢測步驟(1)采用商業(yè)病毒RNA提取試劑盒進(jìn)行樣品處理和模板RNA提??；(2)分別取試劑盒陰性對照、陽性對照及提取的RNA、加入由PCR緩沖液和RT/Taq 混合酶一起配制的熒光RT-PCR反應(yīng)液，在熒光PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增檢測，通過對樣品反應(yīng)管 熒光信號的強(qiáng)弱和擴(kuò)增循環(huán)閾值(Ct值)的檢測，比較待測樣品和試劑盒對照的循環(huán)閾值， 判斷樣品中甲型Hmi流感病毒Q009)RNA陽性或陰性。本發(fā)明與現(xiàn)用的病毒分離培養(yǎng)法、血清學(xué)診斷法及特異性抗體檢測法比較，具有 以下主要優(yōu)點(diǎn)和效果(1)和分離培養(yǎng)法比較具有檢測速度快和靈敏的特點(diǎn)，本發(fā)明試劑盒加上RNA提取，2 3小時(shí)完成檢測獲得結(jié)果。(2)和血清學(xué)、抗體檢測方法比較具有靈敏的特點(diǎn)，并能縮短病毒檢測的“窗口期”。(3)試劑盒使用了基于檢測甲型Hmi流感病毒Q009)型特異性靶序列的兩種熒 光探針，探針采用不同熒光標(biāo)記，兩種熒光信號相互干擾，保證了檢測特異性和靈敏度。(4)試劑盒閉管檢測，操作簡便快速。(5)試劑盒可以實(shí)現(xiàn)高通量樣品檢測。此外，和WHO推薦使用的甲型Hmi流感病毒Q009)引物探針序列比較，本發(fā)明試 劑盒所用引物探針序列和已知公開的2009年爆發(fā)甲型Hmi流感病毒Q009)基因序列同 源性好，互補(bǔ)性高，從而減少了兩者之間的錯(cuò)配，因此試劑盒熒光檢測信號好、檢出極限低、 靈敏度高。本發(fā)明的上述特點(diǎn)，均為采用檢測靶序列的引物探針和熒光RT-PCR技術(shù)組合應(yīng) 用而直接引起。從原理上說，本發(fā)明試劑盒通過對實(shí)時(shí)熒光RT-PCR兩個(gè)檢測通道熒光擴(kuò)增 信號和循環(huán)閾值的分析，判斷甲型Hmi流感病毒Q009)RNA的存在。作為一種甲型Hmi 流感病毒O009) RNA快速檢測的手段，本發(fā)明的技術(shù)方案設(shè)計(jì)合理，可以廣泛應(yīng)用于疾控 和臨床中該病原體的快速鑒定。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以通過技術(shù)常識對本發(fā)明作各種技術(shù)性改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所 附權(quán)利要求書所限定的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人的分子克隆手冊中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明中所涉及的主要試劑說明鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV RT酶)為hvitrogen公司生產(chǎn)的Superscript III逆轉(zhuǎn)錄酶，Taq DNA聚合酶、dNIPs (dATP、dUTP、dCTP、dGTP)均為上海宏誼公司生產(chǎn)，引 物探針以及其它化學(xué)試劑購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。病毒RNA提取試劑盒 采用QIAGEN公司的QIAampViral RNA Mini Kit等商業(yè)病毒RNA提取試劑盒。實(shí)施例1 甲型Hmi流感病毒Q009)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)的制 備采用常規(guī)方法制備一種快速檢測甲型Hmi流感病毒Q009) RNA的熒光RT-PCR試 劑盒，該試劑盒包括PCR緩沖液、RT/Taq混合酶、陰性對照、陽性對照。其中(I)PCR 緩沖液含有 Tris-HCl、KC1、dNTPs、MgCl2、兩對引物(序列例如 SEQ ID No. 3和4,SEQ ID No. 6和7)、兩條熒光探針(序列例如SEQ ID No. 5和8，一條5，端標(biāo)記 FAM熒光基團(tuán)，另一條5’端標(biāo)記HEX熒光基團(tuán)，兩條探針3’端均標(biāo)記淬滅基團(tuán)如TAMRA或 BHQ-1)、無菌去離子水。具體地，由PCR緩沖液、RT/Taq混合酶配制好的熒光RT-PCR反應(yīng)液包含1 OmM Tris-HCl (pH8. 3), 50mM KCl,3mM MgCl2,0. 35 μ M的兩對引物，0. 2 μ M的兩條探針、3U M-MLV RT酶和1.5U Taq DNA聚合酶，無菌去離子水。其中引物為SEQ ID No. 3和4、SEQ ID No. 6 和7序列，熒光探針為SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 8序列，SEQ ID No. 5探針5’端標(biāo)記FAM 熒光基團(tuán)，SEQ ID No.8探針5’端標(biāo)記HEX熒光基團(tuán)，兩條探針3’端均標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán) BHQ-I。
(2) RT/Taq混合酶含有鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(M_MLV RT酶)和I^aqDNA聚合酶。(3)陽性對照含有以SEQ ID No. 1和2序列為模板、經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄獲得的人工RNA。具體地，陽性對照是以SEQ ID No. 1和2序列為模板、經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄獲得的人工RNA。 SEQ ID No. 1和2序列片段插入到pBluescriptll SK+載體質(zhì)粒T7RNA聚合酶啟動子的序 列下游，含有這兩個(gè)序列片段的質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶線性化處理，經(jīng)純化后作為T7 RNA聚 合酶的模板，采用商用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄獲得RNA，該RNA經(jīng)純化后用分光光度計(jì)法測定 濃度并稀釋到1 X 105copy/ml，作為試劑盒陽性對照。陰性對照采用無RNase的無菌去離子 水。陰性對照和陽性對照均保存于-20°C。試劑盒制備工藝簡述如下(1)合成的引物探針定量配制、濃度檢測、抽樣質(zhì)檢。(2)將PCR緩沖液、RT/Taq混合酶無菌分裝，抽樣質(zhì)檢。(3)將陰性、陽性對照品進(jìn)行濃度測定、分裝，抽樣質(zhì)檢。(4)將上述分裝后的4種組分置于同一容器中，組裝為成品試劑盒，封裝后保存 于-20 0C ο實(shí)施例2 甲型Hmi流感病毒Q009)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)的應(yīng) 用(1)樣品處理樣品采用中國藥品生物制品檢定所分發(fā)的甲型Hmi流感病毒Q009)RNA參考 品(包括陽性參考品、陰性參考品、最低檢測量參考品等，最低檢測量參考品有5管包含 1 X 101、1 X 102、1 X 103、1 X IO4 和 1 X 105copy/ml 濃度的甲型 HlNl 流感病毒(2009)雞胚培 養(yǎng)物)和臨床采集的具有病毒性流感癥狀的患者咽拭子。臨床采集的咽拭子樣本需要進(jìn)行 預(yù)處理，即先在運(yùn)輸(保存)液中漩渦振蕩混勻，洗下拭子上粘附的病毒和含病毒細(xì)胞獲得 咽拭子漂洗液。然后取參考品、咽拭子漂洗液、以及試劑盒兩個(gè)對照品各140μ 1，每管中加 入 QIAGEN 公司的 QIAamp Viral RNA Mini Kit 中的 AVL 560 μ 1 (預(yù)混有 Carrier RNA)，按 照其說明書進(jìn)行后續(xù)步驟，最后獲得洗脫的RNA進(jìn)行熒光RT-PCR擴(kuò)增檢測。(2)擴(kuò)增檢測按照發(fā)明內(nèi)容中的方法，按樣品數(shù)η取PCR緩沖液14. 5Χ (n+2)、RT/Taq混合 酶2X (n+2)組分，混勻后每個(gè)擴(kuò)增管分裝15 μ 1，分別加入上述采用QIAGEN公司QIAamp Viral RNA Mini Kit提取的試劑盒陰性對照和陽性對照、η個(gè)樣品RNA模板各10 μ 1。每 個(gè)反應(yīng)擴(kuò)增管體積為25 μ 1，將上述擴(kuò)增管放到LC480實(shí)時(shí)熒光PCR儀器(Roche公司)上 按照 50°C 15min、95°C 2min 后 94°C 15sec、55°C 40sec 循環(huán) 45 次的程序運(yùn)行。熒光PCR儀運(yùn)行結(jié)束后，試劑盒結(jié)果判斷方法為在FAM和HEX熒光波長檢測通道 陰性對照均為陰性，陽性對照均為陽性；在這兩個(gè)熒光波長檢測通道中樣品擴(kuò)增曲線呈明 顯的S形且其循環(huán)閾值(Ct值)<45者為甲型Hmi流感病毒Q009)RNA陽性，無Ct值或 該值為45者為陰性。經(jīng)過分析試劑盒檢測樣品的熒光RT-PCR結(jié)果，發(fā)現(xiàn)中國藥品生物制品所甲型 Hmi流感病毒Q009)參考品中12個(gè)陰性參考品檢測全部為陰性，2個(gè)陽性參考品Pl和P2 檢測均為陽性，5個(gè)最低檢測量參考品檢測4個(gè)為陽性，S5管檢測為陰性，表明試劑盒最低 能檢測lX102COpy/ml RNA的病毒培養(yǎng)物樣品。5個(gè)臨床咽拭子漂洗液樣品中2個(gè)為陽性。核苷酸序列表 SEQUENCE LISTING
<110>上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司 上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司 吳大治，夏懿
<120> 一種檢測甲型Hmi流感病毒RNA的靶序列及試劑盒
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<140>CN
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<211>500
<212>DNA
<213>Influenza A virus(A/2009 (HlNl)) <220>
<221>SEQ ID No. 1 <222>(1). . (500) <400>1taccgagatatgcattcgcaatggaaagaaatgctggatctggtattatcatttcagata60
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<212>DNA
<213>Influenza A virus (A/2009 (HlNl)) <220>
<221>SEQ ID NO. 2 <222>(1). . (500) <400>2
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60 120 1800095]gccctaatgataagacaggc agttgtggtc cagtatcgtctaatggagcaaatggagtaa2400096]aaggattttcattcaaatac ggcaatggtg tttggatagggagaactaaaagcattagtt3000097]caagaaacggttttgagatg atttgggatc cgaacggatggactgggacagacaataact3600098] 0 0￡1￡Ι ￡1￡1￡1gcaagatatc gtaggaataa atgagtggtcaggatatagcgggagttttg4200099]ttcagcatccagaactaaca gggctggatt gtataagaccttgcttctgggttgaactaa4800100]tcagagggcgacccaaagag5000101]<210>30102]<211>210103]<212>DNA0104]<213>Influenza A virus (A/2009 (HlNl))0105]<220>0106]<221>SEQ ID No. 30107]<222> ⑴· ·(21)0108]<400>30109]ggaaagaaatgctggatctg g210110]<210>40111]<211>240112]<212>DNA0113]<213>Influenza A virus (A/2009 (HlNl))0114]<220>0115]<221>SEQ ID No. 40116]<222> ⑴· ·(24)0117]<400>40118]atcggatgta tattctgaaa tggg240119]<210>50120]<211>240121]<212>DNA0122]<213>Influenza A virus (A/2009 (HlNl))0123]<220>0124]<221>SEQ ID No. 50125]<222> ⑴· ·(24)0126]<400>50127]tcagatacaccagtccacga ttgc240128]<210>60129]<211>240130]<212>DNA0131]<213>Influenza A virus(A/2009 (HlNl))0132]<220>0133]<221>SEQ ID No. 60134]<222>(1). . (24)
0135]<400>6
0136]ataaatgagt ggtcaggata tagc24
0137]<210>7
0138]<211>20
0139]<212>DNA
0140]<213>Influenza A virus (A/2009 (HlNl))
0141]<220>
0142]<221>SEQ ID No. 7
0143]<222>(1). . (20)
0144]<400>7
0145]cgccctctga ttagttcaac20
0146]<210>8
0147]<211>24
0148]<212>DNA
0149]<213>Influenza A virus (A/2009 (HlNl))
0150]<220>
0151]<221>SEQ ID No. 8
0152]<222>(1). . (24)
0153]<400>8
0154]agcaaggtct tatacaatcc agcc2權(quán)利要求
1.本發(fā)明提供一種用于檢測甲型Hmi流感病毒O009)RNA的靶序列與試劑盒，其特征 在于，采用基于該病毒血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因設(shè)計(jì)的兩對引物探針，在單個(gè)反 應(yīng)管中經(jīng)一步法熒光RT-PCR同時(shí)檢測甲型Hmi流感病毒Q009)兩個(gè)靶序列RNA ；試劑盒 組分包括PCR緩沖液、RT/Taq混合酶、陰性對照及陽性對照。
2.如權(quán)利要求1所述，其特征在于，用于檢測甲型Hmi流感病毒Q009)兩個(gè)靶序列 來源于該病毒血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因，分別具有SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2 中連續(xù)的70 300個(gè)核苷酸。
3.如權(quán)利要求1所述，其特征在于，所用的試劑盒含有兩對特異性擴(kuò)增甲型Hmi流感 病毒Q009)的引物及兩條熒光探針，所述引物長度為15 35個(gè)核苷酸，探針長度20 50 個(gè)核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，一對引物序列中一條序列與SEQID No. 1中所示的序 列相同，另一條序列與SEQ ID No. 1中所示的序列互補(bǔ)；另一對引物序列中一條序列與SEQ ID No. 2中所示的序列相同，另一條序列與SEQ ID No. 2中所示的序列互補(bǔ)；兩條熒光探針 序列分別與SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2中所示的序列相同或互補(bǔ)。
5.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，所述一對引物序列可以選自SEQID No. 3和SEQ ID No. 4 ；另一對引物序列可以選自SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7 ；所述兩條探針序列可以選自 SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 8的序列，其中一條探針5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，另一條探針 5，端標(biāo)記HEX或J0E、VIC熒光基團(tuán)，兩條探針3，端均標(biāo)記淬滅基團(tuán)TAMRA或BHQ。引物探 針序列也可以是上述序列向前或向后延伸10 20個(gè)核苷酸的序列，或者和上述序列同源 性大于85%以上。
6.如權(quán)利要求1所述方法和引物探針建立的試劑盒，其特征在于按照以下濃度配制 成的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)Tris-HCl (pH8. 3) IOmM, KCl 50mM, MgCl2L 5 5mM,引物各 0. 2 0. 5 μ M，兩條探針各0. 1 0. 5 μ M、M-MLVRT酶和Taq DNA聚合酶各1 5U。
7.如權(quán)利要求1所述建立的試劑盒，在甲型Hmi流感病毒Q009)快速鑒定中的應(yīng)用， 包括以下步驟(1)樣品處理提取模板RNA，樣本包括鼻咽拭子、組織或培養(yǎng)物。(2)模板RNA擴(kuò)增檢測，以熒光PCR儀上FAM和HEX通道擴(kuò)增模板的熒光信號強(qiáng)弱和循 環(huán)閾值來判斷樣品中甲型Hmi流感RNA的存在。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測甲型H1N1流感病毒(2009)RNA的靶序列與試劑盒，其特征在于采用基于該病毒兩個(gè)核苷酸靶序列設(shè)計(jì)的特異性引物探針，在單個(gè)反應(yīng)管中經(jīng)一步法熒光RT-PCR檢測甲型H1N1流感病毒(2009)RNA，以擴(kuò)增模板的熒光信號強(qiáng)弱和循環(huán)閾值來判斷樣品中甲型H1N1流感RNA的存在。試劑盒組分包括PCR緩沖液、RT/Taq混合酶、陰性對照及陽性對照。試劑盒的使用包括樣品處理和擴(kuò)增檢測兩個(gè)步驟，試劑盒操作簡便快速，靈敏度高，可廣泛應(yīng)用于疾控和臨床中甲型H1N1流感病毒(2009)的快速鑒定。
文檔編號C12R1/93GK102071260SQ20091019929
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月24日
發(fā)明者吳大治, 夏懿 申請人:上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司, 上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司