專利名稱：Ⅱ型副流感病毒熒光定量pcr試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬病原體核酸檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種II型副流感病毒熒光定量PCR檢測(cè) 試劑盒，同時(shí)，本發(fā)明還涉及一種熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)II型副流感病毒的方法，熒光定 量PCR是通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)控收集PCR體系中的熒光信號(hào)，對(duì)樣品中的初始模板進(jìn)行定量，可廣泛 應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等相應(yīng)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
副流感病毒(parainfluenza virus，PIV)，與流感病毒同屬粘病毒。1992年 第四次國(guó)際病毒命名委員會(huì)將其劃歸副粘病毒科(paramyxiviridae)，副粘病毒亞科 (paranyxivirinae) 0其成員多數(shù)是引起人畜共患病的重要病原體。近年來(lái)又發(fā)現(xiàn)一些新 現(xiàn)病毒如 megamyxoviruses (Hendra and Nipah viruses)以及 metapneumovirus。副流感病毒是幼兒、兒童和成人的顯著上呼吸道感染最常見(jiàn)的病原體， 據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約30 % 40 %的嬰幼兒急性呼吸道感染都是由人副流感病毒(human parainfluenzavirus, HPIV)引起的。和呼吸道合孢病毒一樣，副流感病毒可以重復(fù)感染。 副流感病毒分為一至四型，每種亞型都有不同的臨床和流行病學(xué)特點(diǎn)。一型和二型副流感 病毒是兒童哮吼癥的主要原因，在2-4歲兒童中癥狀最嚴(yán)重。一型和二型副流感病毒也可 導(dǎo)致其他上/下呼吸道病癥。二型副流感病毒較少發(fā)現(xiàn)。三型副流感病毒雖然也導(dǎo)致哮吼 癥，但是它作為僅次于呼吸道合孢病毒的幼兒支氣管炎、肺炎的病原體更為人熟知。三型副 流感病毒在1歲以下兒童中癥狀最嚴(yán)重。四型副流感病毒一般引起輕微上呼吸道疾病。副流感病毒根據(jù)遺傳性與抗原性，HPIV可分為4種血清型HPIV 1 4。其中HPIV4 又可分為A、B兩個(gè)亞型。病毒有包膜，包膜上有兩種刺突，一種是HN蛋白，具有HA和NA的 作用；另一種是F蛋白，具有使細(xì)胞融合及溶解紅細(xì)胞的作用，它由Fl和F2亞基通過(guò)2個(gè) 二硫鍵連接而成。病毒包膜內(nèi)為核衣殼，也稱RNP核心，由病毒RNA(vRNA)，N蛋白，P蛋白 和L蛋白組成。副流感病毒基因組由不分節(jié)段的ssRNA組成，包括約15，500個(gè)核苷酸，編 碼至少6種常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)蛋白(3’ -N-P-C-M-F-HN-L-5’)。研究發(fā)現(xiàn)，HN糖蛋白很可能以四 聚體形式存在于HPIV包膜和被感染細(xì)胞的胞膜上，通過(guò)唾液酸受體使病毒吸附于宿主細(xì) 胞表面，發(fā)揮神經(jīng)氨酸酶活性。Moscona和I^aluso的實(shí)驗(yàn)表明，HN與細(xì)胞受體的相互作用 是特異而復(fù)雜的，它涉及HN和F這兩種表面糖蛋白，且因HPIV型別的不同而多有變化，因 此，人副流感病毒血清型可根據(jù)HN基因進(jìn)行分型。目前副流感病毒的臨床檢測(cè)常用分離培養(yǎng)、免疫熒光試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)和PCR 等方法；病原體分離培養(yǎng)法雖然有“金標(biāo)準(zhǔn)”之稱，但其技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，而且其靈敏度容 易受病原體不穩(wěn)定的影響，不適合用于早期診斷。而免疫熒光試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)等方法由 于特異性差、敏感性低等問(wèn)題在臨床應(yīng)用價(jià)值受限。普通PCR只能定性或半定量檢測(cè)，無(wú)法 評(píng)價(jià)治療方案的效果，且操作步驟繁瑣，技術(shù)要求高，易造成產(chǎn)物污染，出現(xiàn)假陽(yáng)性，無(wú)法標(biāo) 準(zhǔn)化，不利于推廣。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的熒光定量PCR(Fluoroenetic Quantitative PCR, FQ-PCR)技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已在病原體的定性檢測(cè)(McgolddrikA， Lowing J P, Ibata G,et al.A Novel Approach to the Detection of Classical Swine Fever Virus by RT-PCR with aFluorogenic Probe (TaqMan) [J].J Virol Methods, 1998,72 :125-135 ；Bhudevi B, Weinstock D.Fluorogenic RT-PCR assay (TaqMan) for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus[J]. Vet. Microbiol., 2001,83 :1-10)、定量檢測(cè)(Desire N, Dehee A, Schneider V, etal. Quantification if Human Immndeficiency Virus Type I Proviral Load by a TaqMan Real-Time PCR Assay[J],J. Clin. Microbiol, 2001, 39 :1301-1310 ；Martell Μ, Gomez J, Esteban H, etal. High-Throughput Real-Time Reverse Transcription-PCR Quantitation of Hepatitis C Virus RNA[J], J. Clin. Microbiol, 1999,37 :327-332 ；Kearns AM, Turner AJL, Eltringham GJA, et al. Rapid Detection and Quantification of CMV DNA in Uring Using Lightcycler-based Real-Time PCR[J], J. Clin, Virol,2002, 24 :131-134 ； Florence KP,Glaucia PB,Mireille S,et al. Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry [J] · J. Virol. Methods，2001，95 :111-119)、腫瘤基因檢測(cè)(Gelmini S et al. Clin Chem. 1997,43(5) :752-758 ；Bieche I et al. Int J Cancer. 1998,78(5) 661-666)、免疫分析(Lang R et al. J Immunol Methods. 1997，203 (2) : 181-192)、基因表 達(dá)水平分析(Hirayama Y et al. Blood, 1998,92(1) :46-52 ；Shimokama T et al. Biochem Biophys Res Commun,1998,246(1) :287-292 ；Nellemann C, Vinggaard AM, Dalgaard Μ, et al.Quantification of Antiandrogen Effect Determined by LightCycler ^Technology [J]· ^Toxicology，2001，163 :29-38)及其多態(tài)性(Ibrhim MS et al. Mol Cell Probes, 1997,11 (2) :143-147)的研究等多個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用。對(duì)感染者體內(nèi)病原體性性的 直接檢測(cè)和定量研究，不僅對(duì)于了解患病程度，預(yù)測(cè)、評(píng)價(jià)治療效果有十分重要意義，同時(shí) 也使對(duì)病原體感染發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)入量化階段，點(diǎn)面而且對(duì)新藥的研究與試用等極為重 要。經(jīng)檢索尚無(wú)檢測(cè)II型副流感病毒的熒光定量PCR試劑盒的的開發(fā)和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種II型副流感病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，能快 速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)II型副流感病毒。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種熒光定量PCRII型副流感病毒檢測(cè)方法，該 方法簡(jiǎn)便，檢測(cè)速度快，操作方便安全，省時(shí)效率高。本發(fā)明的熒光定量PCR試劑盒在快速定量檢測(cè)II型副流感病毒中可廣泛應(yīng)用。為了解決上述任務(wù)，本發(fā)明有取以下措施一種II型副流感病毒檢測(cè)試劑盒，其 特征在于，該試劑盒包括RNA提取液；RT-PCR反應(yīng)液；混合酶；陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板；陽(yáng)性對(duì)照和 陰性對(duì)照。所述的RT-PCR反應(yīng)液含PCR Buffer溶液；0. 1 10 μ M濃度的引物P1、P2 ；0. 1 10 μ M濃度的熒光探針FP ；0. 1 ImM的dNIPs溶液和1 IOmM的MgCl2。所述的RT-PCR反應(yīng)液中引物(P1、P2)和探針(FP)為II型副流感病毒HN 基因片段，其中引物Pl序列為5’ -CAATGGGACGCCTAAATATGGA-3’，引物P2序列為5，-GAGGCAATCTCCAAGCATTACA-3，，熒光探針 FP 序列為5，-AGACCCATTGGTGTTACACTCACAA-3 ，
或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長(zhǎng)的序列；或者與上述序列同源性大于85%的序列；或者上述序列的堿基互補(bǔ)序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。所述的熒光探針標(biāo)記的發(fā)光基團(tuán)為FAM、HEX、JOE、ΤΕΤ、Cy3、Cy5、ROX, Fluorescein、Rhodamine> Rhodamine Red、Rhodamine 6G、Orengon Green 488、Orengon Green 500、Orengon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、FITC 或 Acridine orange 中 的任意一種；熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL或DABSl中的任意一種。所述的混合酶由1 IOU的逆轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptIII禾Π 1 IOU的iTaq DNA聚 合酶配制而成。所述的陽(yáng)性性標(biāo)準(zhǔn)模板為含有II型副流感病毒HN基因片段SEQ ID NO. 1與 PGEM-TEasy 載體構(gòu)成的 PGEMT151 重組質(zhì)粒 SEQ ID N0. 2，SEQ ID NO. 1 序列為 5 ’ -CAATGGGACGCCTAAATATGGACCTCTCCTAAATATTCCCAGCTTTATCCCCTCAGCAACATCTC CCAACGGGTGCACTAGAATACCATCATTTTCACTCATTAAGACCCATTGGTGTTACACTCACAATGTAATGCTTGG AGATTGCCTC-3’該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α增殖后用超純質(zhì)粒提取試劑盒提取純化，用紫外分光 光度計(jì)測(cè)A26tl定量并稀釋至1 X IO7拷貝數(shù)/ μ 1，-20°C保存，使用前10倍稀釋至1 X IO6拷 貝數(shù)/μ IUXlO5拷貝數(shù)/μ IUXlO4拷貝數(shù)/μ 1。所述的陽(yáng)性對(duì)照為滅活的II型副流感病毒陽(yáng)性樣本；陰性對(duì)照為無(wú)模板熒光定
量反應(yīng)液。所述的RNA提取液為提取效率>80%、RNA完整性好、穩(wěn)定性好且操作簡(jiǎn)便的核酸 提取液。根據(jù)本發(fā)明提供的試劑盒，采用II型副流感病毒檢測(cè)試劑盒，按以下步驟進(jìn)行(a)采RNA提取液從待測(cè)標(biāo)本中提取RNA ；(b)將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板進(jìn)行10倍梯度稀釋；(c)分別取第(a)步中的RNA和第(b)步中的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板，加入到含有混合酶的 RT-PCR反應(yīng)體系中，與標(biāo)準(zhǔn)陰性質(zhì)控品一起用熒光定量PCR檢測(cè)儀進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)；(d)通過(guò)比較待測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值而對(duì)待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定 量，在熒光定量PCR儀自帶軟件生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)濃度。所述的待測(cè)樣本為痰液、咽拭子。在本發(fā)明提供檢測(cè)II型副流感病毒的熒光定量PCR試劑盒中，有一條兩端標(biāo)記有 熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的特異性熒光探針，在探針完整時(shí)，兩基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上距離相互靠 近，5’端熒光報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)而被3’端淬滅基團(tuán)淬滅，故體系中 沒(méi)有熒光信號(hào)的變化，在PCR退火和伸延過(guò)程中，探針與模板特異性結(jié)合，隨引物的延伸， Taq DNA聚合酶利用其5’ 一 3’外切酶活性對(duì)探針進(jìn)行切割，釋放出報(bào)告基團(tuán)，破壞了兩基 團(tuán)之間的FRET，從而脫離了 3’端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，報(bào)告基團(tuán)所釋放的熒光可以被內(nèi)置 在定量檢測(cè)儀內(nèi)的熒光計(jì)檢測(cè)，熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈比例關(guān)系。對(duì)II型副
5流感病毒的定量可通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct，ThroShold Cycle)相比較得出。Ct值與 起始模板數(shù)呈一定比例關(guān)系，Ct值越小，起始模板數(shù)越多，相反，Ct值越大，起始模板數(shù)越 少。利用陽(yáng)性梯度標(biāo)準(zhǔn)模板的Ct值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)樣本的Ct值可準(zhǔn)確測(cè)出該 樣本的起始拷貝數(shù)。在本發(fā)明提供II型副流感病毒的熒光定量PCR試劑盒中，針對(duì)II型副流感病毒 的特殊性，對(duì)不同的靶序列進(jìn)行反應(yīng)體系(引物和探針濃度、Mg2+濃度、退火溫度等)的優(yōu) 化，并將FQ-PCR技術(shù)與定量檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，將其用于II型副流感病毒的定量檢測(cè)，通過(guò) 優(yōu)化方案，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，建立了定量檢測(cè)II型副流感病毒(HPIV)的方法，并研制出II型副流 感病毒定量檢測(cè)試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個(gè)反應(yīng)體系中檢測(cè)IO1個(gè)病毒粒子。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)特異性更強(qiáng)，靈敏度更高，由于多使用了一條可與模板互補(bǔ)配對(duì)的熒光探針， 提高了特異性，而且所設(shè)計(jì)的引物和探針與RV特異性結(jié)合，與其它病原體無(wú)明顯的同源 性，特異性極高。另外，由自動(dòng)化儀器收集熒光信號(hào)，避免了肉眼判斷的主觀性，結(jié)果可靠， 又進(jìn)一步提高了靈敏度，即使僅存在單拷貝的目的片段也可得到有效的檢測(cè)。(2)全封閉反應(yīng)，無(wú)須PCR后處理，避免污染，保證了結(jié)果的可靠可重復(fù)。(3)分析PCR產(chǎn)物的對(duì)數(shù)期，摒棄常規(guī)PCR受多因素干擾的終點(diǎn)分析法，使得定理 更準(zhǔn)確可靠，而且定量范圍可寬達(dá)10個(gè)數(shù)量級(jí)。(4)在線性實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光，結(jié)果客觀又直觀。(5)可實(shí)現(xiàn)單管雙檢或多檢，還可設(shè)計(jì)針對(duì)性對(duì)標(biāo)，監(jiān)控模板抽提效率及排除抑制 干擾。(6)不接觸有毒試劑，操作安全，省時(shí)高效。(7)檢測(cè)速度快，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程共僅需2 3小時(shí)。(8)可同時(shí)進(jìn)行大批量的樣本檢測(cè)，有利于規(guī)?；詣?dòng)化。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:11型副流感病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的制備(1) RNA 提取液，dNTPs (25mM)，逆轉(zhuǎn)錄酶 Superscript III (200U/ μ 1)，RNA 酶抑制 劑(40U/ μ 1)，Taq DNA 聚合酶(5U/ μ 1)，MgCl2 (IOOmM)。(2)熒光 PCR 5 X buffer 組成50mM Tris-HCl (PH8. 3)，250mM KCl，lmg/ml 明膠。(3)混合酶組成1. 5U/μ 1 逆轉(zhuǎn)錄酶 Superscript III, 1. 5U/μ 1 Taq DNA 聚合酶，5U/yl RNA 酶 抑制劑。(4)熒光定量PCR反應(yīng)液PCR 5Xbuffer 6 μ 1，PI、P2 各 0. 3 μ 1 Q5 μ Μ)，熒光探針 FP 0. 2 μ 1 (25 μ Μ), MgCl2 0· 9 μ 1 (IOOmM)，dNTPs 0. 24 μ 1 (25mM)，DEPC 處理水 15. 86 μ 1。實(shí)施例2 用熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)II型副流感病毒(1)取離心處理過(guò)的痰液或咽拭子抽提液500 μ 1，加入Iml RNA提取液，再加入 200 μ 1氯仿，振蕩15s，室溫孵化lOmin。4°C 12000g離心lOmin，RNA位于上層。將上層更換至新的1. 5ml的EP管，加入500 μ 1異丙醇，_20°C下孵化lOmin，再室溫下12000g離心 IOmin0棄上清，加入Iml 75%的乙醇洗RNA沉淀，振蕩混勻，4°C 12000g離心5min。棄上 清，37°C干燥5min，從而得到病毒RNA。(2)將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板10倍稀釋至1 X IO6拷貝數(shù)/ μ 1、1 X IO5拷貝數(shù)/ μ 1、1 X IO4 拷貝數(shù)/μ 。(3)取熒光定量PCR反應(yīng)液M μ 1，分別加2 μ 1混合酶，再加入第1步提取的RNA 和第2步稀釋好的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板各4 μ 1，另外一管加(f)標(biāo)準(zhǔn)陰性質(zhì)控液，在熒光定量PCR 檢測(cè)儀(ABI 7500)上平行做PCR檢測(cè)。循環(huán)條件為先在37°C反應(yīng)30分鐘，然后94°C保 溫5分鐘，再按94°C 10秒一600C 45秒循環(huán)40次，60°C采集FAM熒光通道的信號(hào)。(4)循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)行ABI 7500 PCR檢測(cè)儀自帶軟件，讀取待測(cè)樣品拷貝數(shù)。(5)結(jié)果為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板1 X IO6拷貝數(shù)/ μ 1、1 X IO5拷貝數(shù)/ μ 1、1 X IO4拷貝 數(shù)/ μ 1其Ct值分別為20. 51、23. 90、27. 32。檢測(cè)的樣品Ct值為30. 87，換算為每毫升檢 測(cè)樣本中含有3. 41 X IO4拷貝個(gè)病原體。核苷酸序列表
SEQUENCE LISTING
<110>上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司
上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司
<120>11型副流感病毒熒光定量PCR試劑盒及其檢測(cè)方法
<160>2
<170>PatentIn version 3. 3
<210>1
<211>151
<212>DNA
<213>Human parainfluenza virus 2
<400>1
caatgggacg cctaaatatg gacctctcct aaatattcccagctttatcccctcagcaac60
atctcccaac gggtgcacta gaataccatc attttcactcattaagacccattggtgtta120
cactcacaat gtaatgcttg gagattgcct c151
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<211>1716
<212>DNA
<213>Human parainfluenza virus 2
<400>2
atggaagatt acagcaatct atctcttaaa tcaattcctaaaaggacatgtagaatcatt60
ttccgaactg ccacaattct tggaatatgc acattgattgttctatgttcaagtattctt120
catgagataa ttcatcttga tgtttcctct ggtctcatggattccgatgattcacagcaa180
ggcattattc agcctattat agaatcatta aaatcattaattgctttggctaaccagatt240
ctgtacaatg ttgcaataat aattcctctt aaaattgacagtatcgagactgtaatattc300
tctgctttaa aggatatgca tactgggagc atgtccaacaccaactgtacacccggaaat360
ctgcttctgcatgatgcagcgtacatcaatggaataaaca aattccttgtacttaaatca420
tacaatgggacgcctaaatatggacctctcctaaatattcccagctttatcccctcagca480
acatctcccaacgggtgcactagaatacca tcattttcactcattaagacccattggtgt540
tacactcacaatgtaatgcttggagattgcctcgatttca cgacatctaa tcagtattta600
gcaatgggga 3.3. 3. C 3.3. C 3.atctgctgca gcatttccaa tcttcaggactatgaaaacc660
atttacctaagtgatggaatcaatcgcaaa agctgttcag tcactgctataccaggaggt720
tgtgtcttgtattgctatgtagctacaaga tctgagaaag aagattatgccacaactgat780
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tacaacaagcagtcctcacgctattttatcC C3<3<3HC3< t CccaacataacCtgtgCCggt1020
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tt C3<3<C3HC3<ccaatcacaaagcagcatatacgtcttcaacctgctttaagaatactgga1620
actcaaaagatttattgtttgataataattgaaatgggctcatctcttttaggggagttc1680
caaataataccatttctaagggaactaataccttaa171權(quán)利要求
1.一種II型副流感病毒檢測(cè)試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括RNA提取液；RT-PCR 反應(yīng)液；混合酶；陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板；陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
2.如權(quán)利要求1所述的II型副流感病毒檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的RT-PCR反應(yīng) 液含PCR Buffer溶液；0. 1 10 μ M濃度的引物Pl、P2 ；0. 1 10 μ M濃度的熒光探針FP ； 0. 1 ImM 的 dNTPs 溶液和 1 IOmM 的 MgCl2。
3.如權(quán)利要求2所述的II型副流感病毒檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的RT-PCR反 應(yīng)液中引物(P1、P2)和探針(FP)為II型副流感病毒HN基因片段，其中引物Pl序列為 5，-CAATGGGACGCCTAAATATGGA-3，，引物 P2 序列為5，-GAGGCAATCTCCAAGCATTACA-3，，熒光 探針 FP 序列為5’ -AGACCCATTGGTGTTACACTCACAA-3’ ；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長(zhǎng)的序列；或者與上述序列同源性大于85%的序列；或者上述序列的堿基互補(bǔ)序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
4.如權(quán)利要求3所述的風(fēng)疹病毒檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的熒光探針標(biāo)記的發(fā) 7 FAM> HEX> JOE> TET> Cy3> Cy5> ROX> Fluorescein、Rhodamine> Rhodamine Red、 Rhodamine 6G、Orengon Green 488、Orengon Green 500、Orengon Green 514、Texas Red、 TAMRA, Inosine, FITC 或 Acridine orange 中的任意一種；熒光淬滅基團(tuán)為 TAMRA、BHQU BHQ2、BHQ3、DABCYL 或 DABSYL 中的任意一種。
5.如權(quán)利要求1所述的II型副流感病毒檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的混合酶由 1 IOU的逆轉(zhuǎn)錄酶Superscripts和1 IOU的Taq DNA聚合酶配制而成。
6.如權(quán)利要求1所述的II型副流感病毒檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的陽(yáng)性性標(biāo) 準(zhǔn)模板為含有II型副流感病毒HN基因片段SEQ ID NO. 1與PGEM-T Easy載體構(gòu)成的 PGEMT151 重組質(zhì)粒 SEQ ID NO. 2。
7.如權(quán)利要求1所述的II型副流感病毒檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的陽(yáng)性對(duì)照為 滅活的II型副流感病毒陽(yáng)性樣本；陰性對(duì)照為無(wú)模板熒光定量反應(yīng)液。
8.如權(quán)利要求1所述的II型副流感病毒檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的RNA提取液 為提取效率>80%、RNA完整性好、穩(wěn)定性好且操作簡(jiǎn)便的核酸提取液。
9.一種II型副流感病毒檢測(cè)方法，其特征在于，采用II型副流感病毒檢測(cè)試劑盒，按 以下步驟進(jìn)行(a)采RNA提取液從待測(cè)標(biāo)本中提取RNA；(b)將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板進(jìn)行10倍梯度稀釋；(c)分別取第(a)步中的RNA和第(b)步中的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板，加入到含有混合酶的 RT-PCR反應(yīng)體系中，與標(biāo)準(zhǔn)陰性質(zhì)控品一起用熒光定量PCR檢測(cè)儀進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)；(d)通過(guò)比較待測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值而對(duì)待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量，在 熒光定量PCR儀自帶軟件生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)濃度。
10.如權(quán)利要求9所述的II型副流感病毒檢測(cè)方法，其特征在于，所述的待測(cè)樣本為痰 液、咽拭子。
全文摘要
本發(fā)明公開了Ⅱ型副流感病毒(Parainfluenza virus，PIV)檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，該試劑盒包括RNA提取液、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板、Taq DNA聚合酶、熒光定量PCR反應(yīng)液和標(biāo)準(zhǔn)陰性質(zhì)控品。利用該試劑盒，首先提取待測(cè)樣品病原體RNA，然后與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)控品、內(nèi)對(duì)照模板以及陰性質(zhì)控品一起作熒光定量RT-PCR，根據(jù)熒光定量PCR儀器所帶有的軟件計(jì)算出待測(cè)樣本中Ⅱ型副流感病毒的起始濃度。本發(fā)明檢測(cè)速度快、操作方便安全，省時(shí)效率高，可有效的對(duì)Ⅱ型副流感病毒感染患者進(jìn)行病毒RNA檢測(cè)，從而達(dá)到了早期診斷和有效預(yù)防Ⅱ型副流感病毒感染。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102061340SQ20091019890
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2009年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月17日
發(fā)明者何劍軍, 吳大治, 夏懿, 沈維祥 申請(qǐng)人:上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司, 上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司