專利名稱：一種微生物采油礦場試驗檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及油藏中微生物的檢測方法，尤其是涉及一種微生物采油礦場試驗檢測
方法。
背景技術(shù)：
微生物采油是與微生物有關(guān)的提原油高采收率方法的總稱。廣義的微生物采油包 括兩大類方法一類是在地面發(fā)酵生產(chǎn)獲得有用的代謝產(chǎn)物，然后將代謝產(chǎn)物注入到油層 達到提高原油采收率的目的，通常稱為地面發(fā)酵法；另一類是地下發(fā)酵法，簡稱為微生物采 油。地下發(fā)酵法視油藏為巨大的生物反應(yīng)器，將合適的菌種與營養(yǎng)物一起注入到油藏，促使 微生物在油藏中大量生長繁殖，通過微生物自身及其代謝產(chǎn)物與油藏和油藏流體之間的相 互作用，達到提高原油采收率的目的。 作為一項提高原油采收率的技術(shù)，微生物采油技術(shù)的優(yōu)勢主要反映在以下幾方 面。①成本低，據(jù)有關(guān)資料，美國每增產(chǎn)1桶原油的費用分別為聚合物驅(qū)5 8美元，表面 活性劑驅(qū)8 12美元，微生物采油1 4美元；我國微生物采油礦場試驗投入產(chǎn)出比平均 在l : 5左右。②施工簡便，利用常規(guī)注入設(shè)備即可實施。③適用范圍廣，針對不同油藏條 件、流體類型可選用不同菌種，對于枯竭井、邊際井具有處理上的優(yōu)勢。④靈活可控，控制營 養(yǎng)液的成分和用量即可控制地層中微生物的種類、分布和活性。⑤環(huán)境友好，采油微生物菌 種是經(jīng)過嚴(yán)格篩選、評價的安全菌種，培養(yǎng)物質(zhì)以及代謝產(chǎn)物均為可生物降解物質(zhì)，微生物 和代謝產(chǎn)物不損害地層，微生物技術(shù)增產(chǎn)的原油無后處理問題。 我國油田采用微生物采油技術(shù)提高原油采收率具有戰(zhàn)略意義。石油是國家戰(zhàn)略性 資源，近10年來，我國原油消費量以年均5. 77%的速度增加，而同期國內(nèi)原油供應(yīng)增長速 度僅為1.67%。自1993年我國成為原油凈進口國之后，原油進口量逐年增加。據(jù)預(yù)測，到 2020年，我國石油的年進口需求將超過5億噸，對外依存度將達到70% ，國家將面臨重大經(jīng) 濟安全問題。努力提高油田開發(fā)水平、促進油田穩(wěn)產(chǎn)無疑是緩解我國能源短缺局面的有效 措施之一。研究和礦場試驗證明，微生物采油技術(shù)的應(yīng)用對提高我國油藏開發(fā)水平和進一 步延長油藏的開發(fā)壽命具有重要的作用。 微生物采油技術(shù)在我國具有巨大的發(fā)展?jié)摿ΑＮ覈验_發(fā)的多數(shù)油田已經(jīng)進入高 含水中后期開發(fā)階段，目前水驅(qū)采收率平均不及35%，約有2/3的資源還留在地下。絕大多 數(shù)油田面臨著開采難度大、成本高、采收率低等難題和巨大壓力。初步評價表明，我國油藏 適合微生物采油的儲量巨大。 微生物采油技術(shù)具有強大的生命力。微生物采油技術(shù)是科技含量高、多學(xué)科交叉 的新技術(shù)，是現(xiàn)代生物技術(shù)在油田開發(fā)領(lǐng)域的開拓性應(yīng)用。該技術(shù)主要涉及微生物學(xué)、化 學(xué)、油藏工程學(xué)、有機地球化學(xué)、生物技術(shù)等學(xué)科。基因工程、發(fā)酵工程等生物工程技術(shù)的發(fā) 展、分子生物學(xué)的進步、油藏精細(xì)描述技術(shù)的完善將不斷推動微生物采油技術(shù)的發(fā)展，促使 其日益完善、深化，最終在我國處于高含水、近枯竭、開采難度日益加劇的油田開發(fā)領(lǐng)域發(fā) 揮其重要作用，甚至可能引發(fā)油田開發(fā)技術(shù)方面的深刻變革。微生物采油技術(shù)的發(fā)展、應(yīng)用還將帶動能源相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展，創(chuàng)造新的經(jīng)濟增長點，促進經(jīng)濟的進步。 微生物采油是一項適應(yīng)范圍寬、經(jīng)濟有效、具有廣泛應(yīng)用前景的技術(shù)。該技術(shù)通過 油藏中微生物降解原油等有益活動和代謝產(chǎn)物(生物表面活性劑等)來提高原油采收率。 微生物驅(qū)油技術(shù)研究起始于20世紀(jì)20年代，到目前為止，波蘭、美國、前蘇聯(lián)、羅馬尼亞等 國家先后開展了 30余個微生物采油礦場試驗；我國華北、大慶、勝利、大港等油田分別開展 一定規(guī)模的礦場試驗。整體來講，微生物采油在提高油田采收率方面的現(xiàn)實有效性得到證 實，但是，試驗效果參差不齊，具有很大的波動性，試驗動態(tài)掌控能力較差，技術(shù)水平不高。 分析認(rèn)為，對試驗油藏中注入微生物的動態(tài)缺乏準(zhǔn)確的認(rèn)識是導(dǎo)致試驗動態(tài)掌控能力較差 的主要原因之一。 研究證實，長期水驅(qū)的油藏是一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，其中孕育著物種多樣的微生 物。這些微生物中的一部分會隨著地層流體一起由采油井產(chǎn)出。在進行礦場試驗過程中，
對產(chǎn)出液中注入的微生物進行分析鑒定時，這些油藏中本源存在的微生物構(gòu)成了很強的噪
立祖旦 曰冃豕。 長期以來，現(xiàn)有技術(shù)采用兩種方法對微生物采油試驗油藏受益油井產(chǎn)出液中的微 生物進行分析， 一是采用顯微鏡觀察、菌落培養(yǎng)的方法識別注入的微生物，并進行定量分 析；二是分子16S rDNA鑒定結(jié)合DGGE分析的方法。 —般而言，微生物形態(tài)包括桿狀(長桿短桿)、球狀、螺旋狀等。由于微生物處于 不同的生長期，形態(tài)會有些變化(如長桿菌在生長初期時為桿短，生長成熟時才為長桿；如 果為芽孢桿菌，在生長后期會僅存在孢子)；同時，不同種類的微生物可能會有相同或相近 的形態(tài)；即使在10*100放大倍率下，不同觀察者眼睛的分辨也很難達到一致；就菌落鑒定 而言，微生物菌落結(jié)構(gòu)描述只有約20種，即使是自然環(huán)境中普遍存在、豐度較高的微生物 也無法包納完全；同樣，不同微生物可能在固體培養(yǎng)基上發(fā)育形成形態(tài)接近的菌落?；?上述原因，采用顯微鏡觀察、菌落培養(yǎng)的方法識別鑒定注入的微生物誤差很大，很難獲得準(zhǔn) 確、可靠的定性結(jié)果，由此也導(dǎo)致了定量結(jié)果上的巨大誤差。 分子生物學(xué)手段、尤其是分子生態(tài)學(xué)的出現(xiàn)，克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的缺陷，已經(jīng)應(yīng) 用于土壤、活性污泥、生物肥料等環(huán)境微生物生態(tài)的分析，為系統(tǒng)認(rèn)識微生物生態(tài)提供了一 個可行的手段。16S rDNA鑒定結(jié)合DGGE分析的方法從基因水平鑒定微生物，并根據(jù)16S rDNA分析中各種微生物克隆的多少或DGGE分析中特定條帶的相對強度來分析各種微生 物的豐度。該方法避開了培養(yǎng)的限制，使得分析結(jié)果更加科學(xué)、準(zhǔn)確，但是仍然存在以下不 足 a)現(xiàn)有技術(shù)水平條件下，還不能保證無偏差地從環(huán)境樣品中提取各種微生物的 DNA，也不能保證等比例地擴增各種微生物的16S rDNA并等比例地將這些擴增片段克隆建 庫； b)各種微生物擁有的rDNA拷貝數(shù)有很大的差異。 因此，通過文庫中各種克隆的相對豐度或DGGE指紋圖譜中特異條帶的相對強度 或，很難準(zhǔn)確反映微生物群落總DNA中各種16S rDNA的組成比例。 現(xiàn)有技術(shù)采用顯微鏡計數(shù)的方法分析注入油藏中的功能微生物，由于細(xì)胞形態(tài)在 不同發(fā)育階段可能存在差異，不同細(xì)胞可能具有相同相近的形態(tài)，檢測者本身的視覺誤差 都會導(dǎo)致分析結(jié)果的出現(xiàn)很大差異。
16S rDNA鑒定結(jié)合DGGE分析的方法由于在DNA抽提、擴增和克隆過程中都存在偏 好性，不能保證每一種微生物的相關(guān)基因片段都獲得等比例地提取、擴增、克隆，同時不同 微生物細(xì)胞本身的DNA拷貝數(shù)也差別很大，因此，該方法獲得的結(jié)果具有一定的誤差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種夠較準(zhǔn)確地分 析注入油藏的微生物的產(chǎn)出情況，提高了注入微生物量化分析結(jié)果的可靠性的微生物采油 礦場試驗檢測方法。 本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種微生物采油礦場試驗檢測方 法，其特征在于，該方法包括如下步驟(l)由微生物采油試驗油藏受益采油井采集產(chǎn)出液 樣品；(2)產(chǎn)出液樣品預(yù)處理收集細(xì)胞；(3)采用熒光原位雜交(FISH)技術(shù)進行雜交；(4) 對注入微生物進行識別和定量分析。 步驟(2)中所述的預(yù)處理為將產(chǎn)出液樣品通過離心分離或過濾的方法提取微生 物細(xì)胞。 所述的離心分離為在lOOOOg下離心10min。
所述的過濾是采用0. 22 ii m濾膜過濾。 步驟(3)中所述的熒光原位雜交(FISH)技術(shù)包括以下步驟將步驟(2)收集的細(xì) 胞用4% (v/v)多聚甲醛溶液固定，用磷酸鹽緩沖液洗滌，用100% (v/v)乙醇脫水，移取上 述處理后的樣品1PL，涂布在載玻片上，風(fēng)干后與對應(yīng)的探針雜交。 所述的對應(yīng)的探針包括檢測枯草芽孢桿菌(B. subtilis)對應(yīng)的探針為 5 ' -TGGAAGATTCCCTACTGC-3 ';檢測嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophi lus)對 應(yīng)的探針為5 ' -TGGAAGATTCCCTACTGC-3 ';檢測惡臭單胞菌(P. putida)對應(yīng)的探 針5 ' -TCTGGAAAGTTCTCAGCA-3 ';檢測地下地桿菌(G. subterraneus)對應(yīng)的探針為 5' -TGGAAGATTCCCTACTGC-3'。 步驟(4)所述的對注入微生物進行識別和定量分析是采用熒光顯微鏡對注入微 生物進行識別和定量分析。 本發(fā)明所述方法即先根據(jù)注入油藏中的微生物的16S rDNA設(shè)計特異性探針，利用 FISH技術(shù)采用該探針分析鑒定油藏產(chǎn)出液中注入微生物，由此獲得注入的微生物產(chǎn)出的準(zhǔn) 確信息，與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明方法具有安全、準(zhǔn)確、特異性高、靈敏度高等優(yōu)點。將這種 方法應(yīng)用于油藏環(huán)境微生物分析，必將獲得油藏注入微生物的系統(tǒng)的、完整的認(rèn)識。按照本 發(fā)明所述的方法，對試驗油藏產(chǎn)出液進行分析，能夠避免雜菌的干擾，在雜菌背景下，準(zhǔn)確 地定性、定量分析注入的微生物，并取得可靠的結(jié)果。因此是一種科學(xué)、高效的微生物采油 現(xiàn)場試驗產(chǎn)出液檢測方法。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細(xì)說明。
實施例1 油藏注入微生物枯草芽孢桿菌(B. subtilis)的鑒定分析 微生物驅(qū)試驗區(qū)為某油田1注4采井組，試驗區(qū)儲層平均孔隙度為26 % ，平均空氣滲透率為O. 65um2，油層溫度4rC，地層原油粘度22mPa. s，地面脫氣原油密度為0. 87g/cm3， 含蠟量12. 4%，含膠質(zhì)瀝青8. 6%。地層水水型為NaHC03，礦化度為5528mg/L。
微生物驅(qū)試驗首次注入菌液及營養(yǎng)液3500m 其中，注入菌液86m3(B. subtilis)。 注入微生物后6、 12、 18個月時，采集受益中心井產(chǎn)出液樣品，采用FISH技術(shù)檢測注入菌，步 驟如下 (1)由微生物采油試驗油藏受益采油井采集產(chǎn)出液樣品； (2)產(chǎn)出液樣品與石油醚/正己烷/吐溫(io : io : 1，v/v)溶液按2 : i比例
混合，混合液充分搖勻，靜置使油相和水相分層，抽取下層水樣，下層水樣經(jīng)O. 22um濾膜過 濾，收集濾膜上的微生物細(xì)胞。 (3)采用《油藏微生物群落多樣性的分子分析》(華東理工大學(xué)博士論文，李輝， 2007年)公開的方法，采用FISH技術(shù)進行雜交，主要包括以下步驟將收集的細(xì)胞用4X多 聚甲醛溶液固定，用PBS緩沖液洗滌，用100%乙醇脫水，移取上述處理后的樣品1 y L，涂布 在載玻片上，風(fēng)干后與B. subtilis對應(yīng)探針5' -TGGAAGATTCCCTACTGC-3'(探針5'末端 連接Cy3)雜交，采用熒光顯微鏡根據(jù)雜交后細(xì)胞呈現(xiàn)的熒光顏色分析鑒定產(chǎn)出液中的注 入微生物B. subtilis。 檢測結(jié)果表明，在注入微生物后6、12、18個月時，受益中心井產(chǎn)出液樣品中注入 的B. subtilis濃度分別為4. 1 X 106cells/ml、8. 2X 107cells/ml和2. 4X 107cells/ml。
實施例2 油藏注入微生物為嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophilus)、地下地桿菌 (G. subterraneus)和惡臭單胞菌(P. putida)混合菌的鑒定分析 微生物驅(qū)試驗區(qū)為某油田3注10采井組，油層溫度55t:，地層水水型為NaHC03， 礦化度為12428mg/L。 微生物驅(qū)試驗首次注入菌液及營養(yǎng)液3500m 其中，注入菌液86m3(B. subtilis)。 注入微生物后18個月時，采集受益中心井產(chǎn)出液樣品，采用FISH技術(shù)檢測注入菌，步驟如 下 (1)由微生物采油試驗油藏受益采油井采集產(chǎn)出液樣品； (2)產(chǎn)出液樣品與石油醚/正己烷/吐溫(io : io : 1，v/v)溶液按2 : i比例
混合，混合液充分搖勻，靜置使油相和水相分層，抽取下層水樣，10000g離心10min，收集微 生物細(xì)胞。 (3)采用《油藏微生物群落多樣性的分子分析》(華東理工大學(xué)博士論文，李 輝，2007年)公開的方法，采用FISH技術(shù)進行雜交，主要包括以下步驟將收集的細(xì) 胞用4%多聚甲醛溶液固定，用PBS緩沖液洗滌，用100 %乙醇脫水，移取上述處理后 的樣品1 y L，涂布在載玻片上，風(fēng)干后采用探針5 ' -TGGAAGATTCCCTACTGC-3 ' (rhoda min標(biāo)記，檢測B. stearothermophilus) ， 5 ' -TCTGGAAAGTTCTCAGCA-3 ' (FITC標(biāo)記， 檢測P. putida)，5 ' -TGGAAGATTCCCTACTGC-3 ' (cy3標(biāo)記，檢測G. subterraneus)， 5' -GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3' (cy5標(biāo)記，檢測全部細(xì)菌)與樣品進行雜交。采用熒光顯微 鏡根據(jù)雜交后細(xì)胞呈現(xiàn)的熒光顏色識別并定量分析注入的微生物B. stearothermophilus、 P. putida、G. subterraneus。采用通用探針5' -GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'分析樣品中的總 菌濃，將采用對應(yīng)探針分析獲得的嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophilus)、地下地桿菌(G. subterraneus)和惡臭單胞菌(P. putida)的濃度與總菌濃進行比較，獲得注入的每 種微生物的豐度。 檢測結(jié)果表明，在注入微生物18個月時，受益中心井產(chǎn)出液樣品中注入的 B. stearothermophilus、 G. subterraneus、 P. putida菌濃度分別為1. 8X 107cells/ml、 8. lX107cells/ml和7. OX 1()6cells/ml，相對豐度分別為:1. 2%，5. 4%，0. 46%。
權(quán)利要求
一種微生物采油礦場試驗檢測方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)由微生物采油試驗油藏受益采油井采集產(chǎn)出液樣品；(2)產(chǎn)出液樣品預(yù)處理收集細(xì)胞；(3)采用熒光原位雜交(FISH)技術(shù)進行雜交；(4)對注入微生物進行識別和定量分析。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種微生物采油礦場試驗檢測方法，其特征在于，步驟(2)中 所述的預(yù)處理為將產(chǎn)出液樣品通過離心分離或過濾的方法提取微生物細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種微生物采油礦場試驗檢測方法，其特征在于，所述的離 心分離為在10000g下離心10min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種微生物采油礦場試驗檢測方法，其特征在于，所述的過 濾是采用0. 22um濾膜過濾。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種微生物采油礦場試驗檢測方法，其特征在于，步驟(3) 中所述的熒光原位雜交(FISH)技術(shù)包括以下步驟將步驟(2)收集的細(xì)胞用4% (v/v)多 聚甲醛溶液固定，用磷酸鹽緩沖液洗滌，用100% (v/v)乙醇脫水，移取上述處理后的樣品 1 P L，涂布在載玻片上，風(fēng)干后與對應(yīng)的探針雜交。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的 一 種微生物采油礦場試驗檢測方法，其特征在 于，所述的對應(yīng)的探針包括檢測枯草芽孢桿菌(B. subtilis)對應(yīng)的探針為 5 ' -TGGAAGATTCCCTACTGC-3 ';檢測嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophi lus)對 應(yīng)的探針為5 ' -TGGAAGATTCCCTACTGC-3 ';檢測惡臭單胞菌(P. put i da)對應(yīng)的探 針5 ' -TCTGGAAAGTTCTCAGCA-3 ';檢測地下地桿菌(G. subterraneus)對應(yīng)的探針為 5' -TGGAAGATTCCCTACTGC-3'。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種微生物采油礦場試驗檢測方法，其特征在于，步驟(4)所 述的對注入微生物進行識別和定量分析是采用熒光顯微鏡對注入微生物進行識別和定量 分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物采油礦場試驗檢測方法，該方法包括如下步驟(1)由微生物采油試驗油藏受益采油井采集產(chǎn)出液樣品；(2)產(chǎn)出液樣品預(yù)處理收集細(xì)胞；(3)采用FISH技術(shù)進行雜交；(4)對注入微生物進行識別和定量分析。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法能夠較準(zhǔn)確地分析注入油藏的微生物的產(chǎn)出情況，克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對油藏微生物認(rèn)識分析的偏差和片面性，提高了注入微生物量化分析結(jié)果的可靠性，為進一步提高微生物采油的應(yīng)用效果奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/64GK101698888SQ20091019799
公開日2010年4月28日 申請日期2009年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者劉金峰, 楊世忠, 牟伯中, 王立影 申請人:華東理工大學(xué)