專利名稱：：一類蘆丁脂肪酸酯衍生物,其制備方法及應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及蘆丁衍生物，尤其是涉及蘆丁脂肪酸酯衍生物及其制備方法，和在制備抗心腦血管疾病藥物和抗病毒性肝炎藥物中的應用。
背景技術：
：隨著生活水平的提高，心腦血管疾病成為健康的重大威脅，我國每年死于心腦血管疾病近300萬人，占我國每年總死亡病因的51%。而幸存下來的患者75%不同程度喪失勞動能力。血栓形成、動脈粥樣硬化、炎癥反應、缺血和再灌注自由基損傷等諸多心腦血管疾病的發(fā)病過程均與血小板活化因子(plateletactivatingfactor,PAF)介導密切相關。蘆丁具有拮抗PAF的作用(陳文梅等，中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2002，22(4):283-285)。蘆丁的藥理作用能抑制血小板的凝集，有防止血栓形成的作用。同時能對抗5_羥色胺、緩激肽引起的血管損傷，增加毛細血管抵抗力，降低毛細血管通透性，可防止血管通透性升高引起的水腫。對急性缺血性腦損傷有顯著的保護作用。國家藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準蘆丁作為藥物使用，現(xiàn)有蘆丁片劑等劑型，臨床適用于脆性增加的毛細血管出血癥，也用于高血壓腦病、腦出血、視網(wǎng)膜出血、出血性紫癜、急性出血性腎炎、再發(fā)性鼻出血、創(chuàng)傷性肺出血、產(chǎn)后出血等的輔助治療。病毒性乙型肝炎是一種嚴重危害人類健康的常見病，它的防治是一個全球性公共衛(wèi)生問題，已引起世界各國政府的關注。我國是病毒性肝炎的高發(fā)區(qū)，平均發(fā)病率為120140/10萬。其中尤以乙型肝炎為突出。乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒引起的一種世界性疾病。發(fā)展中國家發(fā)病率高，據(jù)統(tǒng)計，全世界無癥狀乙肝病毒攜帶者超過2.8億，我國約占9300萬；其中1/3出現(xiàn)肝損害的臨床表現(xiàn)，目前我國有乙肝患者3000萬，每年約有30萬人死于與乙肝有關的肝硬化或肝癌。中國肝炎防治基金會于2005年公布的《中國肝炎的流行現(xiàn)狀及其相關問題分析報告》顯示，僅有19%的人目前正在接受抗病毒這一正確的治療方式。我國肝炎病毒攜帶者的數(shù)量正以每年平均250萬人左右的速度迅猛增長。乙型肝炎不僅嚴重危害我國人民的健康，而且還給國家?guī)韲乐氐纳鐣?jīng)濟負擔。乙型肝炎的治療時間長，醫(yī)療費用較高，再加不恰當?shù)臑E用藥物，更加重了額外的經(jīng)濟負擔。我國每年用于治療乙型肝炎、肝硬化、肝癌的直接醫(yī)療耗費約為300億元人民幣。因此，加強病毒性肝炎的預防，探求乙型肝炎的有效治療方法，是當前亟待解決的重大課題。慢性乙型肝炎治療關鍵是抗病毒治療。病毒性丙型肝炎是波及全球的傳染病之一，全球有1.7億人感染了丙肝病毒，我國可能有37004000萬丙型肝炎病毒感染者；其發(fā)病率有逐年增高趨勢，而美國疾病控制中心預測，從1990年至2015年，具有慢性肝臟疾病的危險人群中，丙型肝炎患者將增加4倍。以此推算，如果我國丙型肝炎的感染和流行不能得到很好的控制，至2015年，我們所面臨的丙型肝炎狀況和今天所面臨的慢性乙型肝炎的局面一樣嚴峻。因此，加強丙型肝炎的研究具有重要性和迫切性。而且，由于缺乏有效的預防性疫苗，對丙型肝炎的防治還將是長期的。丙型肝炎病毒感染是慢性肝病的重要原因，約50%的感染者可轉(zhuǎn)為慢性肝炎，約310%-20%的丙型肝炎20年內(nèi)演變?yōu)楦斡不?，且與肝細胞癌(HCC)的發(fā)生關系密切。丙型肝炎的病理機制及藥物研究是研究熱點之一，但目前還缺乏特異的病理動物模型，且臨床上也沒有理想的藥物進行治療。中國發(fā)明專利(申請?zhí)枮?00810038858.1)公開了戸丁在制備抗乙肝病毒藥物中的應用，經(jīng)乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝核心抗原(HBeAg)檢測試劑實驗，結(jié)果表明蘆丁能顯著抑制乙肝表面抗原(HBsAg)和核心抗原(HBeAg)，具有顯著抑制乙肝病毒作用。上述蘆丁雖能制備抗心腦血管病和抗乙肝病毒的藥物，但由于蘆丁幾乎不溶于水，難溶于脂肪，口服后在腸道吸收較差，生物利用度低。因此，為了增強藥物的療效，本發(fā)明將蘆丁制成親脂性的蘆丁脂肪酸酯衍生物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一類蘆丁脂肪酸酯衍生物。本發(fā)明提供這類蘆丁脂肪酸酯衍生物的制備方法。本發(fā)明提供這類蘆丁脂肪酸酯衍生物在制備抗心腦血管疾病藥物中的應用。本發(fā)明提供這類蘆丁脂肪酸酯衍生物在制備抗病毒性肝炎藥物中的應用。本發(fā)明蘆丁脂肪酸酯衍生物的化學結(jié)構(gòu)通式如下式中為(:2-(:24脂肪酸的?；?，其中c12、c18的飽和脂肪酸的?；?。本發(fā)明蘆丁脂肪酸酯衍生物制備方法的步驟如下蘆丁(陜西森弗生物技術有限公司產(chǎn)品)和脂肪酸以i:1-8的摩爾比溶于溶劑叔丁醇中，叔丁醇用量為蘆丁重量的5-10倍，反應溫度30-10(TC，按每毫升反應液加入3-8mg的催化劑脂肪酶Novozym435(上海恒臣實業(yè)有限公司產(chǎn)品)，攪拌，反應4-20小時后，按每毫升反應液加入50-200mg的3A分子篩，反應82-120小時。過濾除去分子篩和酶，溶液減壓蒸干，剩余物以硅膠柱層析，洗脫劑為體積比10-15:l的乙酸乙酯-甲醇混合液，收集產(chǎn)物成分，蒸干溶劑，得蘆丁脂肪酸酯，收率可達70-75%。本發(fā)明蘆丁脂肪酸酯衍生物的藥理試驗1.以比濁法測定家兔洗滌血小板(WRP)聚集率，研究蘆丁脂肪酸酯衍生物對家兔血小板活化因子誘導的血小板聚集的影響(參見實施例6)，蘆丁為對照試藥，結(jié)果顯示蘆丁脂肪酸酯對家兔PAF誘導血小板聚集有很強的抑制作用(參見表4)。2.以兔體內(nèi)注射給藥實驗，研究蘆丁脂肪酸酯衍生物對Na25-二磷酸腺苷二鈉4(ADP)及花生四稀酸誘導的血小板聚集的影響(參見實施例7)，結(jié)果顯示蘆丁脂肪酸酯能顯著地抑制血小板聚集(參見表5)。3.采用放射免疫法進行蘆丁脂肪酸酯衍生物體外對乙肝HBsAg和HBeAg抑制作用實驗(參見實施例5)，結(jié)果以復孔平均值表示，結(jié)果顯示蘆丁脂肪酸酯具有顯著抑制乙肝病毒作用(參見表1，表2和表3)。4.進行蘆丁脂肪酸酯衍生物體內(nèi)抗乙肝病毒試驗，采用1日齡北京鴨靜脈注射強陽性鴨乙型肝炎病毒后，采用斑點雜交方法及放射自顯影方法，觀察鴨血清乙肝病毒DNA(DHBV-DNA)的動態(tài)變化(參見實施例8)。結(jié)果顯示蘆丁脂肪酸酯衍生物在給藥期間對DHBV-DNA有明顯抑制作用(參見表6和表7);且在停藥后未見明顯乙肝病毒重新復制的"反跳"現(xiàn)象。5.進行蘆丁脂肪酸酯衍生物體內(nèi)對卡介苗(BCG)和脂多糖(LPS)所致小鼠免疫性肝損傷模型的肝保護作用的實驗(參見實施例9)。結(jié)果顯示蘆丁脂肪酸酯衍生物可不同程度地抑制BCG和LPS誘導的小鼠血清ALT、AST水平的升高，對小鼠免疫性肝損傷具有顯著的保護作用(參見表8)。6.進行蘆丁脂肪酸酯衍生物體內(nèi)急性毒性實驗(參見實施例10)。結(jié)果顯示蘆丁脂肪酸酯衍生物具有非常低的毒性(參見表9)。根據(jù)藥理實驗結(jié)果，蘆丁脂肪酸酯衍生物在抗血小板聚集、抗肝炎病毒活性和肝損傷保護實驗中顯示出顯著的效果，而且毒性極低。因此，它們可作為抗心腦血管疾病藥物和抗病毒性肝炎藥物用于動物，優(yōu)選用于哺乳動物，特別是人。本發(fā)明蘆丁脂肪酸酯衍生物可以按藥物制備的常規(guī)方法制成藥物，藥物中含有有效量的蘆丁脂肪酸酯衍生物及常規(guī)的可藥用載體。將蘆丁脂肪酸酯衍生物與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和(或)輔劑結(jié)合，制成可作為藥物使用的適當?shù)氖┯眯问交騽┝啃问?，如片齊U、丸齊U、膠囊劑、口服液、注射劑等劑型的制劑，也可以制成緩釋制齊U、控釋制齊U、靶向制劑以及各種微粒給藥制劑。制劑中含有O.1_90重量％的蘆丁脂肪酸酯衍生物。為了將給藥單元制成片劑，可以廣泛使用本領域公知的各種藥用載體。關于藥用載體，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、糖粉、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、糖粉、蜂蜜、飴糖、液狀葡萄糖、阿拉伯膠漿、明膠漿、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸鈉與枸櫞酸、碳酸f丐、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、吐溫-80、泡騰崩解劑、交聯(lián)羧甲基淀粉鈉、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進劑，如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，如月桂醇硫酸鎂、棕櫚酸、富馬酸、滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等；甜味劑，如蛋白糖、甜蜜素、環(huán)己烷氨基磺酸、醇糖、糖精鈉(鈣)、甘草甜素等；矯味劑，如薄荷腦、各種香精、肉桂及各種果味料等。還可以將片劑進一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領域公知的各種藥用載體。關于藥用載體，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、糖漿、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；冷卻劑，如液狀石蠟、二甲硅油和植物油等。為了將給藥單元制成栓劑，可以廣泛使用本領域公知的各種藥用載體。關于這類藥用載體例如可可脂、高級醇的酯等。為了將給藥單元制成膠囊劑，將蘆丁脂肪酸酯衍生物與上述的各種藥用載體混合，并將由此得到的混合物置于明膠、阿拉伯膠、甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮及其它高分子材料制成的硬膠囊或軟膠囊中。也可將蘆丁脂肪酸酯衍生物制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑。為了將給藥單元制成注射用制劑，例如溶液劑、乳劑、凍干粉針劑和混懸劑，可以使用本領域常用的所有稀釋劑與乳化劑，如水、乙醇、聚乙二醇、l，3-丙二醇、卵磷脂、吐溫類、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等；例如脂質(zhì)體，可以使用本領域常用的薄膜法、逆相蒸發(fā)法、溶劑注入法、復乳法等方法制備。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油；此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、ra調(diào)節(jié)劑等。此外，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑或其它材料。本發(fā)明蘆丁脂肪酸酯衍生物的給藥劑量取決于諸多因素，例如所要預防或治療疾病的性質(zhì)和嚴重程度，患者的性別、年齡、體重及個體反應，給藥途徑及給藥次數(shù)等。通常體重約75公斤患者，用于心腦血管疾病所給蘆丁脂肪酸酯衍生物的日劑量為0.lmg/kg體重-100mg/kg體重，優(yōu)選lmg/kg體重-10mg/kg體重；用于病毒性肝炎所給蘆丁脂肪酸酯衍生物的日劑量為0.001mg/kg體重-50mg/kg體重，優(yōu)選0.01mg/kg體重-10mg/kg體重。給藥劑量可以單一劑量形式或分成幾個，例如二、三或四個劑量形式給藥。具體病例可由醫(yī)師根據(jù)病情調(diào)整。本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于1.通過化學合成得到本發(fā)明蘆丁脂肪酸酯衍生物，所需的原料價格低，原料易得，且其制備方法簡便，得率較高，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。2.通過活性藥理試驗表明，本發(fā)明蘆丁脂肪酸酯衍生物具有顯著抗血小板聚集和抗肝炎病毒活性，而且在蘆丁脂肪酸酯衍生物停藥后未見明顯乙肝病毒重新復制的"反跳"現(xiàn)象。3.本發(fā)明將蘆丁制成親脂性前體藥即脂肪酸酯衍生物，可以溶于脂肪，使用后在血液或組織器官中能迅速被酯酶水解，并可以在體內(nèi)停留更長的時間。藥理試驗結(jié)果顯示，蘆丁脂肪酸酯衍生物比較酯化前的蘆丁具有更強抑制血小板聚集和肝炎病毒活性的作用，酯化后在低濃度下也表現(xiàn)出顯著的抑制作用，提高了吸收率，從而很大程度上增強了藥物的療效。4.本發(fā)明提供了蘆丁脂肪酸酯衍生物在制備抗心腦血管疾病藥物和抗病毒性肝炎藥物方面的應用。5.本發(fā)明蘆丁脂肪酸酯衍生物制備的抗心腦血管疾病藥物和抗病毒性肝炎藥物，可以制成不同劑型，可以不同方式給藥，增加臨床應用的選擇性。具體實施例方式下面的實施例僅用來進一步說明本發(fā)明，但這并不意味著對本發(fā)明的任何限制。實施例l蘆丁棕櫚酸酯的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>0.lmol蘆丁和0.5mol棕櫚酸溶于叔丁醇500ml中，加熱，6(TC加入2.5克的脂肪酶Novozym435，攪拌，反應10小時后，加入50克3A分子篩，反應96小時，過濾除去分子篩和酶，溶液減壓蒸干，剩余物以硅膠柱層析，洗脫劑乙酸乙酯-甲醇混合液(重量比10:1)，收集產(chǎn)物成分，蒸干溶劑，得蘆丁棕櫚酸酯，收率70%。下列波譜數(shù)據(jù)顯示為蘆丁棕櫚酸酯。Mp:210-213°C。電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)m/z:871.5[M+Na]。力-NMR(C5DsN):S7.53(2H，m，H-2，和H_6，)，6.79(1H，d，J=9Hz，H-5，)，6.29(1H，s，H-8)，6.12(1H，s，H-6)，5.32(1H，d，J=7.4Hz，H—l")，4.65(1H，t，J=9Hz，H—4'")，4.48(1H，s，H-l，")，3.72-2.65(9H，m，H2"-H6"，H2，"_H5，")，2.21—2.13(2H，m，H-a)，1.5(2H，m，H-P)，1.24-1.13(32H，m，脂肪鏈中亞甲基質(zhì)子)。13CNMR(C5D5N):S177.5(C4)，173.5(C=0，酯羰基)，168(C7)，157.5(C9或C2)，150.2(C4，)，133(C3)，122.2(C6，)，116.5(C5")，77.9(C3")，75.5(C4")，74.7(C4，")，71.6(C2")70.8(C2，")，69.2(C3，")，67(C5，")。棕櫚酸部分34.6，31.8，29.6，25.4，25，24.6，23.8，23.1，18.5，15.2，12.1。實施例2蘆丁肉豆蔻酸酯的合成0.lmol戸丁禾口0.15mol肉豆蔻酸溶于叔丁醇500ml中，加熱，75"C加入2.8克的脂肪酶Novozym435，攪拌，反應8小時后，加入40克3A分子篩，反應90小時，過濾除去分子篩和酶，溶液減壓蒸干，剩余物以硅膠柱層析，洗脫劑乙酸乙酯-甲醇混合液(重量比12:1)，收集產(chǎn)物成分，蒸干溶劑，得蘆丁肉豆蔻酸酯，收率75%。下列波譜數(shù)據(jù)顯示為蘆丁肉豆蔻酸酯。Mp:218-220°C。ESI-MSm/z:843.5[M+Na]。力-NMR(C5DsN):S7.52(2H，m，H-2，和H_6，)，6.78(1H，d，J=9Hz，H-5，)，6.27(1H，s，H-8)，6.14(1H，s，H-6)，5.34(1H，d，J=7.4Hz，H—l")，4.67(1H，t，J=9Hz，H—4'")，4.49(1H，s，H-1，")，3.71-2.63(9H，m，H2"-H6"，H2，"_H5，")，2.23—2.13(2H，m，H_a)，1.45(2H，m，H-P)，l.22-1.14(28H，m，脂肪鏈中亞甲基質(zhì)子)。13CNMR(C5D5N):S177.5(C4)，173.7(C=0，酯羰基)，167(C7)，157.7(C9或C2)，150.4(C4，)，133.2(C3)，122.2(C6，)，116.4(C5")，77.8(C3")，75.4(C4")，74.6(C4，")，71.7(C2")70.9(C2，")，69.4(C3，")，67.2(C5，")。肉豆蔻酸部分34.5，31.7，29.5，25.3，25,24.5，23.8，23.1，18.4，15.3，12.3。實施例3蘆丁亞麻酸酯的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>0.2mo1蘆丁和0.6mo1亞麻酸溶于叔丁醇800ml中，加熱，7(TC加入4克的脂肪酶Novozym435，攪拌，反應10小時后，加入100克3A分子篩，反應100小時，過濾除去分子篩和酶，溶液減壓蒸干，剩余物以硅膠柱層析，洗脫劑乙酸乙酯-甲醇混合液(重量比15:1)，收集產(chǎn)物成分，蒸干溶劑，得蘆丁亞麻酸酯，收率71%。下列波譜數(shù)據(jù)顯示為蘆丁亞麻酸酯。Mp:202-204°C。ESI-MSm/z:893.6[M+Na]。'H-NMR(C5DsN):S7.55(2H，m，H—2，和H_6，)，6.83(1H，d，J=9Hz，H-5，)，6.27(1H，s，H-8)，6.11(1H，s，H-6)，5.34(1H，d，J=7.4Hz，H—l")，4.61(1H，t，J=9Hz，H—4'")，4.43(1H，s，H-1，")，3.71-2.63(9H，m，H2"-H6"，H2，"_H5，")，2.25—2.11(2H，m，H-a)，1.45(2H，m，H-P)，1.21-1.12(24H，m，脂肪鏈中亞甲基質(zhì)子)。13CNMR(C5D5N):S177.2(C4)，173.3(C=0，酉旨羰基)，167.6(C7)，157.3(C9或C2)，150.6(C4')，132.8(C3)，122.4(C6')，116.7(C5，，)，77.6(C3，，)，75.7(C4，，)，74.6(C4，")，71.5(C2")70.6(C2，")，69.3(C3，")，66.8(C5，")。亞麻酸部分122.3，138.5，120.5，137.4，121.3，135，4，34.5,31.7,29.5,25.7，25，24.8,23.5,23.4，18.7，15.3，12.2。實施例4DHA-蘆丁酯的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>0.2mol戸丁和1.6molDHA溶于叔丁醇1000ml中，加熱，65。C加入5克的脂肪酶Novozym435，攪拌，反應10小時后，加入100克3A分子篩，反應96小時，過濾除去分子篩和酶，溶液減壓蒸干，剩余物以硅膠柱層析，洗脫劑乙酸乙酯-甲醇混合液(重量比12:1)，收集產(chǎn)物成分，蒸干溶劑，得DHA-蘆丁酯，收率72%。下列波譜數(shù)據(jù)顯示為DHA-蘆丁酯。Mp:208-211°C。ESI—MSm/z:943.6[M+Na]。力-NMR(C5DsN):S7.55(2H，m，H-2，和H_6，)，6.72(1H，d，J=9Hz，H-5，)，6.25(1H，s，H-8)，6.14(1H，s，H-6)，5.33(1H，d，J=7.4Hz，H—l")，4.62(1H，t，J=9Hz，H—4'")，4.43(1H，s，H-l，")，3.70-2.64(9H，m，H2"-H6"，H2，"_H5，")，2.20—2.12(2H，m，H-a)，1.48(2H，m，H-P)，1.23-1.12(20H，m，脂肪鏈中亞甲基質(zhì)子)。13CNMR(C5D5N)S177.1(C4)，173.2(C=0，酯羰基)，167.6(C7)，157.2(C9或C2)，150.1(C4，)，132.4(C3)，122.1(C6，)，116.2(C5")，77.5(C3")，75.2(C4")，74.3(C4，")，71.4(C2")70.5(C2，")，69.0(C3，")，66.7(C5，")。DHA部分127133(12C)，34.3，31.5，29.3,25.1，24.6，24.3,23.4,23.1，18.2，15.1，11.8。實施例5蘆丁脂肪酸酯衍生物抗乙肝病毒試驗1.材料和方法1.l細胞培養(yǎng)及藥物以H印G22.2.15細胞為模型，將H印G22.2.15細胞接種至25cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶加入DMEM培養(yǎng)基混合培養(yǎng)液(含10%FBS及380yg/mlG418)5ml，置37°C，5%C02恒溫培養(yǎng)箱中，34天傳代。用5%NaHC03調(diào)pH值至7.2(DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清為GIBCO公司產(chǎn)品；G418為Sigma公司產(chǎn)品)。蘆丁(陜西森弗生物技術有限公司產(chǎn)品)，以二甲基亞砜溶解，制成lmg/ml的溶液，以培養(yǎng)液稀釋成5iig/ml。阿德福韋酯(蘇州葛蘭素史克制藥有限公司產(chǎn)品)，以二甲基亞砜溶解，制成lmg/ml的溶液，以培養(yǎng)液稀釋成5g/ml。蘆丁棕櫚酸酯，蘆丁肉豆蔻酸酯，蘆丁亞麻酸酯(自制，參見實施例1，2，3)，以二甲基亞砜溶解，制成lmg/ml的溶液，以培養(yǎng)液分別稀釋成1yg/ml，2.5yg/ml，5yg/ml的溶液。培養(yǎng)細胞消化液用0.25%胰蛋白酶(Costar公司產(chǎn)品)消化成單個細胞，吹打混勻后，分別接種于96孔培養(yǎng)板(每孔細胞數(shù)為1X104)及24孔培養(yǎng)板(每孔細胞數(shù)為1X105)上。分別加入培養(yǎng)液200ul及l(fā)ml，37°C5%C02孵箱培養(yǎng)48h;待細胞貼壁后，棄培養(yǎng)上清液，換用含不同藥物濃度的培養(yǎng)液，每3天換用含同等藥物濃度的新鮮培養(yǎng)液；實驗共進行9天，第9天末收集培養(yǎng)上清液，-2(TC保存；同批試劑盒檢測上清液中HBsAg、HBeAg1.2實驗分組聯(lián)合用藥采用棋盤法設計。分為單用蘆丁脂肪酸酯衍生物，陽性對照藥物為阿德福韋酯、蘆丁，不加藥物的陰性對照組。蘆丁脂肪酸酯衍生物濃度取1、2.5和5g/ml，陽性對照藥物阿德福韋酯濃度取5iig/ml，蘆丁Sug/ml。每組重復實驗3次。1.2.1每孔加入待測標本50ul，設陰、陽性對照各2孔，每孔加入陰性對照(或陽性對照)各一滴，并設空白對照一孔；1.2.2每孔加入酶結(jié)合物1滴(空白對照孔除外)，充分混勻，封板，置37t:孵育30分鐘;1.2.3棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔，靜置5秒，甩干，重復五次后拍干；1.2.4每孔加顯色劑A液、B液(酶作用底物)各1滴，充分混勻，封板，置37。C孵育15分鐘;1.2.5每孔加入終止液1滴，混勻；1.2.6用酶標儀讀數(shù)，取波長450nm，參考波長630nm，讀取各孔讀數(shù)。1.3上清液HBsAg和HBeAg的檢測采用放射免疫法，結(jié)果以復孔平均值表示。立可讀HBeAg、HBsAg診斷試劑盒(上海科華生物技術有限公司產(chǎn)品)操作方法按試劑盒說明書進行。計算方法抑制率(％)=〔(陰性對照組cpm-實驗組cpm)/陰性對照組cpm〕X100%2.結(jié)果組間比較用方差分析，采用SPSS11.0完成(見表1，表2，表3)。表1戸丁棕櫚酸酯對HBsAg和HBeAg抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2戸丁肉豆蔻酸酯對HBsAg和HBeAg抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表3戸丁亞麻酸酯對HBsAg和HBeAg抑制作用名稱濃度HBsAg抑制率(％)HBeAg抑制率(％)陰性對照組蘆丁阿德福韋酯蘆丁亞麻酸酯蘆丁亞麻酸酯蘆丁亞麻酸酯4ug/ml5lig/ml1yg/ml2.5Pg/ml5Pg/ml29.799.4636.3531.6810.5335.0340.1474.4748.3464.24上述實驗結(jié)果表明，蘆丁脂肪酸酯衍生物具有顯著的乙肝病毒抑制作用，蘆丁脂肪酸酯衍生物與蘆丁相比較具有更顯著的乙肝病毒抑制作用；因此，可將蘆丁脂肪酸酯衍生物用于制備抗病毒性乙肝的藥物。實施例6蘆丁棕櫚酸酯抗血小板聚集試驗1.藥品與試劑戸丁(陜西森弗生物技術有限公司產(chǎn)品)，以二甲基亞砜配制。PAF(Sigma公司產(chǎn)品)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。蘆丁棕櫚酸酯(自制，參見實施例l)。蘆丁和蘆丁棕櫚酸酯分別以匿S0溶解，制成2mmol/L的溶液，以生理鹽水稀釋成0.2mmol/L，0.4mmol/L，0.8mmol/L，1.2mmol/L，1.6mmol/L的溶液。2.動物新西蘭大耳白兔，雄性，體重(2.0士0.5)kg(第二軍醫(yī)大學實驗動物中心產(chǎn)品)，為一級合格動物。3.儀器Chrono-log型血小板聚集儀。4.實驗方法4.1洗滌血小板懸液制備兔耳正中動脈取血，ACD(檸檬酸鈉85mmol/L，檸檬酸71mmol/L，葡萄糖110mmo1/L)與全血以l:6體積比抗凝，30Xg離心5min，取上清液富含血小板血漿(PRP)500Xg離心5min，棄上清，沉淀的血小板以pH7.4血小板洗滌液(NaC1300mmol/L，EDTA4mmo1/L.Tris5mmol/L)洗滌兩次，最后將血小板混懸于pH7.4TT—牛血清白蛋白臺氏液[TTBSA溶液，KC12.62mmol/L.MgCl2l.0mmol/L，NaCI137mmol/L，CaCl2l.3mmol/L，Trisl0mmol/L，葡萄糖5.6mmol/L，0.25%牛血清白蛋白(BSA)]中即為兔洗滌血小板懸液(WRP)。以TTBSA調(diào)節(jié)血小板濃度為2.5X10"/L。4.2血小板聚集性測定實驗，分為二甲基亞砜對照組、不同劑量蘆丁組及不同劑量蘆丁棕櫚酸酯組。取上述WRP180ul分別加入二甲基亞砜，蘆丁，蘆丁棕櫚酸酯溶液各10ul，加入1.91X10—7mol/LPAF-0.25%BSA-生理鹽水10ul，37。C下描記聚集曲線，計算血小板聚集率及藥物對血小板聚集抑制率(1)，以觀察蘆丁棕櫚酸酯對PAF誘導血小板聚集的抑制作用。抑制率=[(100%_加藥管血小板聚集率)/匿50管血小板聚集率]乂100%5.結(jié)果見表4。表4蘆丁棕櫚酸酯對PAF誘導血小板聚集的影響(f±s)藥物濃度(mmol/L)實驗次數(shù)聚集率(％)抑制率(％)對照組…盧丁0.20盧丁0.40戸丁0.80盧丁1.20盧丁1.60蘆丁棕櫚酸酯0.20蘆丁棕櫚酸酯0.40蘆丁棕櫚酸酯0.80蘆丁棕櫚酸酯1.20蘆丁棕櫚酸酯1.603333333333348.8±8.044.5±6.242.2±5.331.6±5.08.0±1.87.2±1.810.5±5.26.6±4.33.6±3.02.2±1.71.8±1.88.813.535.283.685.278.586.592.695.596.3P<0.01.上述實驗結(jié)果表明，蘆丁棕櫚酸酯體外給藥能明顯抑制PAF(9.55X10—5mol/L)誘導的兔血小板聚集，并呈劑量依賴性，ICs。為0.12mmol/L。蘆丁棕櫚酸酯組與蘆丁組相比較對PAF誘導的血小板聚集具有更顯著的抑制作用；因此，可將蘆丁脂肪酸酯衍生物用于制備抗心腦血管疾病的藥物。實施例7蘆丁棕櫚酸酯體內(nèi)抗血小板聚集試驗1.蘆丁棕櫚酸酯對5-二磷酸腺苷二鈉(ADP)誘導的兔血小板聚集的影響兔7只，體重2.1±0.3kg，雄性。將蘆丁棕櫚酸酯制成脂質(zhì)體20mg/ml靜脈注射給藥，給藥后10、30、60和120min頸動脈取血，制備PRP。ADP的終濃度為8mmol/L。結(jié)果各時間組均顯著地抑制血小板聚集(見表5)。2.蘆丁棕櫚酸酯對花生四稀酸誘導的兔血小板聚集作用的影響兔7只，體重2.1±0.3kg，雄性。將蘆丁棕櫚酸酯制成脂質(zhì)體20mg/ml，靜脈注射給藥，給藥后10、30、60和120min頸動脈取血，制備PRP?；ㄉ南┧?Fhtka產(chǎn))的終濃度為95.5mmol/L。結(jié)果各時間組均顯著地抑制血小板聚集(見表5)。表5蘆丁棕櫚酸酯靜注對兔血小板聚集的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>x±SDP<0.05上述實驗結(jié)果表明，蘆丁棕櫚酸酯對5-二磷酸腺苷二鈉(ADP)或花生四稀酸誘導的血小板聚集有明顯的抑制作用；因此，可將蘆丁脂肪酸酯衍生物用于制備抗心腦血管疾病的藥物。實施例8蘆丁棕櫚酸酯體內(nèi)抗乙肝病毒試驗1.實驗材料1.1病毒鴨乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)強陽性血清，采自上海麻鴨，-70°C保存。1.2動物1日齡北京鴨購自北京醫(yī)科院藥植所動物飼養(yǎng)場。1.3藥物阿德福韋酯(蘇州葛蘭素史克制藥有限公司產(chǎn)品)；蘆丁棕櫚酸酯(自制，參見實施例1)。以上分別制成lmg/ml的脂質(zhì)體，以注射用水稀釋后給藥。1.4試劑a-32P-dCTP(北京福瑞公司產(chǎn)品)；缺口翻譯藥盒(普洛麥格公司產(chǎn)品)；S印hadexG-50，F(xiàn)icollPVP(瑞典Pharmacia公司產(chǎn)品)；SDS(德國Merck公司產(chǎn)品)；魚精DNA、牛血清白蛋白(中國科學院生物物理所產(chǎn)品)；硝酸纖維素膜0.45um(安普公司產(chǎn)口、2.實驗方法2.1復制鴨乙型肝炎病毒感染模型取1日齡北京鴨30只，隨機分成5組模型對照組、陽性對照組、蘆丁棕櫚酸酯高、中、低劑量組。每組6只。每只經(jīng)腿脛靜脈注射0.2ml上海麻鴨DHBV-DNA強陽性鴨血清。2.2藥物治療在感染后7天自鴨腿脛靜脈取血，分離血清，為治療前樣本(TO)，-7(rC保存待檢。DHBV感染雛鴨7天后進行藥物治療試驗，蘆丁棕櫚酸酯高、中、低劑量組分別給予蘆丁棕櫚酸酯10、25和50iig/kg，陽性對照組給予阿德福韋酯50iig/kg，模型對照組給予生理鹽水。灌胃給藥，每日2次，連續(xù)10天，在用藥第5天(T5)，第10天(T10)和停藥后第3天(P3)，自鴨腿脛靜脈取血，分離血清，-7(TC保存待檢。2.3DHBV-DNA的測定鴨血清樣品用32P_DHBVDNA探針作斑點雜交，X射線底片上得到放射自顯影像，以酶標儀于490nm處測定其OD值，半定量計算DNA水平。3.結(jié)果雛鴨感染乙肝病毒后DHBV-DNA全部陽性，蘆丁棕櫚酸酯25yg/kg、50yg/kg對DHBV-DNA有明顯抑制作用(P<0.05)，且蘆丁棕櫚酸酯在停藥后未見明顯乙肝病毒重新復制的"反跳"現(xiàn)象。陽性藥物阿德福韋酯在用藥期間可顯著抑鴨DHBV-DNA(P<0.05)，但停藥后出現(xiàn)乙肝病毒重新復制的"反跳"現(xiàn)象(P<0.05)(見表6和表7)。表6戸丁棕櫚酸酯對鴨血清DHBV-DNA水平的影響(n=6)組別劑量DHBV-DNA的OD值(Pg/kg)TOT5T10P3模型對照組—0.678±0.110.708±0.080.732±0.050.697±0.06低劑量組100.698±0.040.656±0.060.635±0.070.695±0.04中劑量組250.680±0.070.610±0.050.563±0.030.648±0.06高劑量組500.702±0.050.502±0.070.504±0.080.613±0.05陽性對照組500.712±0.070.528±0.030.512±0.090.832±0.07P<0.05。表7戸丁棕櫚酸酯對鴨血清DHBV-DNA水平抑制率的影響(n=6)組別劑量抑制率(％)("g/kg)T5T10P3模型對照組—-5.13-9.7-1.23低劑量組104.245.841.24中劑量組2512.6315.824.6740]高劑量組5029.2324.039.28陽性對照組5029.6230.84-11.63P<0.05。上述實驗結(jié)果表明，蘆丁棕櫚酸酯具有顯著的乙肝病毒抑制作用；因此，可將蘆丁脂肪酸酯衍生物用于制備抗病毒性乙肝的藥物。實施例9蘆丁亞麻酸酯體內(nèi)對卡介苗(BCG)和脂多糖(LPS)所致小鼠免疫性肝損傷模型的肝保護作用的實驗1.實驗材料1.1實驗動物昆明種小鼠，S，1822g(第二軍醫(yī)大學實驗動物中心產(chǎn)品)。1.2藥品與試劑利巴韋林注射液(上海信誼藥業(yè)有限公司產(chǎn)品)?？ń槊?BCG)(上海生物制品公司產(chǎn)品)。脂多糖(LPS)(Sigma公司產(chǎn)品)。ALT、AST試劑盒(南京建成生物工程研究所產(chǎn)品)蘆丁亞麻酸酯(自制，參見實施例3)，制成lmg/ml的脂質(zhì)體，以注射用水稀釋后給2.實驗方法動物隨機分組，尾ivBCG2Sit/只，正常對照組給予等量生理鹽水，治療組給予不同劑量的藥物，每日l次。陽性對照組給予利巴韋林50ug/kg，每日l次。正常飼養(yǎng)10天，未次給藥后再次尾ivLPS10ug/只，進行攻擊，16h后眼眶靜脈取血，進行肝功能檢測(血清ALT、AST測定)。3.結(jié)果蘆丁亞麻酸酯25、50iig/kg對BCG和LPS誘導的小鼠血清ALT、AST水平升高有明顯抑制作用(P<0.05)(見表8)。表8蘆丁亞麻酸酯對免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響(n=6)組別劑量(ug/kg)ALT(u/L)AST(u/L)正常對照組43.67±7.8983.52±17.83模型組138.62±57.36208.67±64.35陽性對照組5066.27±53.82108.64±70.82戸丁亞麻酸酯1088.83±56.45143.83±98.81蘆丁亞麻酸酯2573.66±52.39120.25±77.62盧丁亞麻酸酯5064.82±37.7998.64±47.46P<0.05上述實驗結(jié)果表明，蘆丁亞麻酸酯可不同程度地抑制BCG和LPS誘導的小鼠血清ALT、AST水平的升高，對小鼠免疫性肝損傷具有保護作用；因此，可將蘆丁脂肪酸酯衍生物用于制備抗病毒性丙肝的藥物。實施例10蘆丁亞麻酸酯，蘆丁棕櫚酸酯，蘆丁肉豆蔻酸酯急性毒性實驗1.材料1.1藥物蘆丁(陜西森弗生物技術有限公司產(chǎn)品)，以0.5%CMC-Na水溶液制成藥物濃度0.4g/ml的混懸液。蘆丁亞麻酸酯，自制，以0.5%CMC-Na水溶液制成藥物濃度0.4g/ml的混懸液。蘆丁棕櫚酸酯，自制，以0.5%CMC-Na水溶液制成藥物濃度0.4g/ml的混懸液。蘆丁肉豆蔻酸酯，自制，以0.5%CMC-Na水溶液制成藥物濃度0.4g/ml的混懸液。1.2動物NIH小鼠250只，雌雄各半，5_6周齡，體重18_22g(第二軍醫(yī)大學實驗動物中心產(chǎn)品)。每籠5只，雌雄分籠飼養(yǎng)，觀察1周，均健康存活。2.l預實驗NIH種小鼠60只，禁食不禁水12h，分設陰性對照組，陽性對照組(戸丁組)，實驗組1(蘆丁亞麻酸酯)，實驗組2(蘆丁棕櫚酸酯)，實驗組3(蘆丁肉豆蔻酸酯)。陽性對照15組，實驗組以最大給藥濃度，最大劑量(0.3ml/10g)，一次灌胃，連續(xù)觀察7天，記錄期間小鼠死亡數(shù)和一般情況，若死亡數(shù)>30%，則進行半數(shù)致死量(LD50)的測定，若不足以引起死亡，則測定最大耐受量(MTD)。陰性對照組灌胃等量飲用水，余同給藥組。結(jié)果在預實驗中小鼠無一死亡，測不出！A。，故測定MTD。2.2最大耐受量MTD的測定NIH種小鼠180只，禁食不禁水12h，根據(jù)性別、體重隨機分成5組，雌雄各半，每組20只。分設陰性對照組，陽性對照組1(蘆丁組1)，陽性對照組2(蘆丁組2)，實驗組，對照組給予同量飲用水；實驗組以最大給藥濃度，最大劑量(0.3ml/10g)灌胃，其中陽性對照組l(蘆丁組l)灌胃每日2次，折合給藥量為24g/kg/d、陽性對照組2(蘆丁組2)灌胃每日3次，折合給藥量為36g/kg/d。蘆丁亞麻酸酯，蘆丁棕櫚酸酯，蘆丁肉豆蔻酸酯實驗組分為低、高劑量組，分別灌胃每天2次，折合給藥量為24g/kg/d，灌胃每天3次，折合給藥量為36g/kg/d。灌胃l天，連續(xù)觀察7天，詳細記錄對照組、試驗組動物每天攝食、飲水、糞便、尿液及精神、四肢活動方面的情況反應和死亡情況(見表9)。實驗結(jié)束時，將全部動物處死，解剖，肉眼檢查主要臟器組織病變情況，計算MTD。表9蘆丁亞麻酸酯，蘆丁棕櫚酸酯，蘆丁肉豆蔻酸酯急性毒性實驗小鼠反應情況iH四肢活動精神毛發(fā)飲水糞便尿液死亡3.結(jié)果以最大給藥濃度、最大給藥劑量分別灌胃給藥，試驗觀察發(fā)現(xiàn)，陽性對照組第3次灌胃后，小鼠出現(xiàn)活動減少，豎毛、閉目等異常情況，癥狀持續(xù)7天，實驗表明，小鼠口服戸丁MTD低于36g/kg/d。實驗組第3次灌胃后，部分小鼠出現(xiàn)倦縮及活動減少，但無豎毛懶動、抽搐、翻倒等異常情況，l-3h后活動如常，整個過程中沒有出現(xiàn)驚厥，抽搐。7天后處死動物并解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎等主要臟器，外觀未見異常改變。實驗表明，小鼠口服蘆丁亞麻酸酯，蘆丁棕櫚酸酯，蘆丁肉豆蔻酸酯MTD為36g/kg/d，說明蘆丁亞麻酸酯，蘆丁棕櫚酸酯，戸丁肉豆蔻酸酯毒性都非常小。陰性對照組蘆丁組l蘆丁組2盧丁亞麻酸酯(低劑量)盧丁亞麻酸酯(高劑量)蘆丁棕櫚酸酯(低劑量)盧丁棕櫚酸酯(高劑量)戸丁肉豆蔻酸酯(低劑量)戸丁肉豆蔻酸酯(高劑量)ooooooooo常常常常常常常常常正正正正正正正正正常常常常常常常常常正正正正正正正正正常常少常常常常常常正正減正正正正正正常常毛常常常常常常正正豎正正正正正正常常目常常常常常常正正閉正正正正正正常常少常常常常常常正正減正正正正正正權(quán)利要求一類蘆丁脂肪酸酯衍生物，其特征在于具有下列化學結(jié)構(gòu)通式式中R1為C2-C24脂肪酸的?；?，其中C12、C18的飽和脂肪酸的?；?。F2009101984242C0000011.tif2.權(quán)利要求1所述蘆丁脂肪酸酯衍生物的制備方法，其特征在于制備方法的步驟如下蘆丁和脂肪酸以l:1-8的摩爾比溶于溶劑叔丁醇中，叔丁醇用量為蘆丁重量的5-10倍，反應溫度30-10(TC，按每毫升反應液加入3-8mg的催化劑脂肪酶Novozym435，攪拌，反應4-20小時后，按每毫升反應液加入50-200mg的3A分子篩，反應82-120小時，過濾除去分子篩和酶，溶液減壓蒸干，剩余物以硅膠柱層析，洗脫劑為體積比10-15:l的乙酸乙酯_甲醇混合液，收集產(chǎn)物成分，蒸干溶劑，得蘆丁脂肪酸酯。3.按權(quán)利要求2所述蘆丁脂肪酸酯衍生物的制備方法，其特征在于制備方法步驟中所述脂肪酸是C2-C24的飽和脂肪酸，其中C12、C18的飽和脂肪酸的酰基除外，或是C2-C24的不飽和脂肪酸。4.按權(quán)利要求3所述蘆丁脂肪酸酯衍生物的制備方法，其特征在于所述C2-C24的飽和脂肪酸優(yōu)選是棕櫚酸、肉豆蔻酸；所述C2-C24的不飽和脂肪酸優(yōu)選是亞麻酸、DHA、亞油酸。5.權(quán)利要求1所述蘆丁脂肪酸酯衍生物的應用，其特征在于所述蘆丁脂肪酸酯衍生物在制備抗心腦血管疾病藥物中的應用。6.權(quán)利要求1所述蘆丁脂肪酸酯衍生物的應用，其特征在于所述蘆丁脂肪酸酯衍生物在制備抗病毒性肝炎藥物中的應用。7.按權(quán)利要求6所述蘆丁脂肪酸酯衍生物的應用，其特征在于所述蘆丁脂肪酸酯衍生物在制備抗病毒性乙肝藥物中的應用。8.按權(quán)利要求6所述蘆丁脂肪酸酯衍生物的應用，其特征在于所述蘆丁脂肪酸酯衍生物在制備抗病毒性丙肝藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明提供一類蘆丁脂肪酸酯衍生物，它們可由蘆丁和脂肪酸通過化學合成制得，原料易得且價格低，制備方法簡便，得率較高，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。通過藥理試驗表明，該蘆丁脂肪酸酯衍生物具有顯著抗血小板聚集和抗肝炎病毒活性，可應用于制備抗心腦血管疾病藥物和抗病毒性乙肝和丙肝藥物。文檔編號C12P19/60GK101704866SQ20091019842公開日2010年5月12日申請日期2009年11月6日優(yōu)先權(quán)日2009年11月6日發(fā)明者徐從立,黃山申請人:上海雙科醫(yī)藥科技有限公司