本發(fā)明涉及腫瘤的分子診斷領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及骨髓瘤細(xì)胞中的分子標(biāo)志物mk2基因及其在制備診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma，mm)是一種漿細(xì)胞惡性腫瘤，其特點(diǎn)是骨髓中漿細(xì)胞克隆性增殖，并分泌單克隆免疫球蛋白或輕鏈。由于異常漿細(xì)胞浸潤(rùn)骨骼、骨髓和全身多個(gè)器官組織，引起病理性的骨骼破壞，患者的血清中出現(xiàn)異常的單克隆免疫球蛋白，從而抑制了機(jī)體的正常的多克隆免疫球蛋白，患者的尿內(nèi)出現(xiàn)蛋白，患者最后表現(xiàn)出導(dǎo)致貧血、腎功能損害及病理性骨折等。mm是全世界發(fā)病率排名第二位的血液腫瘤，當(dāng)前我國50歲以上的腫瘤病人中mm患者大約占據(jù)3％左右，隨著我國人口的老齡化，mm發(fā)病率以每年1％的速度上升。目前認(rèn)為mm發(fā)生是一個(gè)逐步進(jìn)展的過程，很多患者在早期發(fā)生意義不明的單克隆球蛋白癥，然后進(jìn)展為mm，部分患者最終發(fā)展為髓外骨髓瘤(漿細(xì)胞白血病)，整個(gè)過程中患者骨髓漿細(xì)胞伴有多種基因的突變。

目前多發(fā)性骨髓瘤的診斷主要依靠骨髓克隆性漿細(xì)胞比例和(或)活組織病理學(xué)檢查作為mm診斷基礎(chǔ)。國際骨髓瘤工作組(imwg)于2014年修訂了意義未明的單克隆免疫球蛋白血癥(mgus)、mm診斷標(biāo)準(zhǔn)。mm診斷標(biāo)準(zhǔn)包括骨髓中克隆性漿細(xì)胞比例≥10％和/或活組織病理學(xué)檢查證實(shí)為漿細(xì)胞瘤；同時(shí)伴有以下一種或多種情況：高鈣血癥、腎功能不全、貧血和溶骨性骨損害。單克隆免疫球蛋白(m蛋白)是臨床常用的mm診斷標(biāo)志物，但修訂后的診斷標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)調(diào)m蛋白不是診斷mm的必備條件，但可用來區(qū)別分泌型或非分泌型mm。此外，mri、低劑量全身ct、fdg/pet及pet/ct等現(xiàn)代影像學(xué)技術(shù)被納入檢查輔助方法。

目前多發(fā)性骨髓瘤診斷的方法復(fù)雜、檢查項(xiàng)目多，缺少一種可靠、方便的臨床診斷方法。近年來，本課題組基于基因芯片表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性骨髓瘤患者中，mk2基因的表達(dá)顯著增高，mk2基因的表達(dá)水平與與多發(fā)性骨髓瘤患者病理進(jìn)程及耐藥性密切相關(guān)。表明mk2是一種高危的骨髓瘤基因，可為多發(fā)性骨髓瘤的臨床診斷提供可靠的判斷。

mk2(mitogen-activatedproteinkinase-activatedproteinkinase2，mapkapk2)是于1992年發(fā)現(xiàn)并被純化的第一個(gè)mapk激活蛋白激酶，主要被p38蛋白激酶直接磷酸化激活，是p38蛋白激酶的重要底物，在介導(dǎo)胞外信號(hào)引起的細(xì)胞增殖、分化、衰老、凋亡及炎癥等反應(yīng)中起著重要作用。mk2為致癌基因，可通過磷酸化途徑直接活化多種腫瘤相關(guān)因子如細(xì)胞分裂周期蛋白25b/c和熱休克蛋白27等；其亦可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制上調(diào)多個(gè)癌基因和促炎因子的表達(dá)，而促進(jìn)腫瘤包括肺癌的發(fā)生發(fā)展；mk2過表達(dá)可活化lim激酶而激活vegf誘導(dǎo)的血管生成過程，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：本發(fā)明的目的在于提供一種分子標(biāo)志物mk2基因及其在制備診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

技術(shù)方案：分子標(biāo)志物mk2基因，序列如seqidno.1所示。

分子標(biāo)志物mk2蛋白，序列如seqidno.2所示。

分子標(biāo)志物mk2基因在制備診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

上述產(chǎn)品包括：通過rt-pcr、實(shí)時(shí)定量pcr、免疫組化、原位雜交、芯片或高通量測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)mk2基因表達(dá)水平以診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品。

上述用實(shí)時(shí)定量pcr診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增mk2基因的引物；所述用免疫組化診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品包括：與mk2蛋白特異性結(jié)合的抗體；所述用原位雜交診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品包括：與mk2基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片，其中蛋白芯片包括與mk2蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與mk2基因的核酸序列雜交的探針。

上述用實(shí)時(shí)定量pcr診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增mk2基因的引物，序列如：seqidno.3和seqidno.4所示。

一種用于診斷多發(fā)性骨髓瘤的工具，該工具能夠檢測(cè)樣本中mk2基因的表達(dá)。

上述工具包括芯片、試劑盒、試紙或高通量測(cè)序平臺(tái)。

上述芯片包括基因芯片或蛋白質(zhì)芯片，所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)mk2基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì)mk2基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的mk2蛋白的特異性抗體；所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫組化試劑盒；所述基因檢測(cè)試劑盒包括用于檢測(cè)mk2基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫組化試劑盒包括mk2蛋白的特異性抗體；所述試紙包括用于檢測(cè)mk2基因轉(zhuǎn)錄水平的試紙；所述高通量測(cè)序平臺(tái)包括用于檢測(cè)mk2基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑。

上述檢測(cè)mk2基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑包括針對(duì)mk2基因的引物和/或探針。

有益效果：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了mk2基因表達(dá)與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種診斷多發(fā)性骨髓瘤的分子標(biāo)志物mk2，使用該分子標(biāo)志物可以在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生的早期即可作為判斷，或者判斷受試者是否存在患有多發(fā)性骨髓瘤的風(fēng)險(xiǎn),提供了患者的生存率。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的生物標(biāo)記物mk2基因，相比傳統(tǒng)的檢測(cè)手段，基因診斷不僅穩(wěn)定、方便，且靈敏、特異，從而及時(shí)控制多發(fā)性骨髓瘤的進(jìn)程，降低死亡率。

附圖說明

圖1顯示利用基因芯片(geneexpressionprofiling,gep)檢測(cè)mk2基因在多發(fā)性骨髓瘤患者和正常人中的表達(dá)差異圖。分析22例正常骨髓(np)、44例意義未明的單克隆丙種球蛋白疾病(monoclonalgammopathyofundeterminedsignificance，mgus，骨髓瘤前體疾病)以及351例初診mm患者樣本，mk2表達(dá)水平在mm患者樣本中顯著升高。

圖2顯示利用qpcr檢測(cè)mk2基因在多發(fā)性骨髓瘤患者和正常人中的表達(dá)差異圖。

圖3顯示利用免疫組化(ihc)染色方法分析mk2在正常骨髓和mm患者骨髓樣本中表達(dá)情況圖，結(jié)果顯示mk2在mm患者樣本中表達(dá)顯著升高。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

本發(fā)明提供了檢測(cè)mk2基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷多發(fā)性骨髓瘤的工具中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，上面所提到的檢測(cè)mk2基因表達(dá)的產(chǎn)品包括：通過實(shí)時(shí)定量pcr、免疫檢測(cè)、原位雜交、芯片或高通量測(cè)序平臺(tái)等檢測(cè)mk2基因表達(dá)水平以診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品。

進(jìn)一步，所述用實(shí)時(shí)定量pcr診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增mk2基因的引物；所述用免疫檢測(cè)診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品包括：與mk2蛋白特異性結(jié)合的抗體；所述用原位雜交診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品包括：與mk2基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與mk2蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與mk2基因的核酸序列雜交的探針。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述用實(shí)時(shí)定量pcr診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增mk2基因的引物的序列如：seqidno.3和seqidno.4所示。

優(yōu)選地，所述診斷工具包括芯片、試劑盒、試紙或高通量測(cè)序平臺(tái)。其中，高通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷工具，檢測(cè)mk2基因表達(dá)的產(chǎn)品可以應(yīng)用于該平臺(tái)實(shí)現(xiàn)對(duì)mk2基因的表達(dá)情況的檢測(cè)。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對(duì)比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知mk2基因的異常與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)也屬于mk2基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明還提供了一種多發(fā)性骨髓瘤的工具，所述產(chǎn)品包括芯片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)mk2基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì)mk2基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的mk2蛋白的特異性抗體；所述基因芯片可用于檢測(cè)包括mk2基因在內(nèi)的多個(gè)基因(例如，與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)的多個(gè)基因)的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)芯片可用于檢測(cè)包括mk2蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)(例如與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì))的表達(dá)水平。通過將多個(gè)與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)的標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)，可大大提高多發(fā)性骨髓瘤診斷的準(zhǔn)確率。

其中，所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒；所述基因檢測(cè)試劑盒包括用于檢測(cè)mk2基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括mk2蛋白的特異性抗體。進(jìn)一步，所述試劑包括使用實(shí)時(shí)定量pcr、免疫檢測(cè)、原位雜交或芯片方法檢測(cè)mk2基因表達(dá)水平過程中所需的試劑。優(yōu)選地，所述試劑包括針對(duì)mk2基因的引物和/或探針。根據(jù)基因的核苷酸序列信息容易設(shè)計(jì)出可以用于檢測(cè)mk2基因表達(dá)水平的引物和探針。

所述高通量測(cè)序平臺(tái)包括檢測(cè)mk2基因表達(dá)水平的試劑。

所述試紙包括試紙載體和固定在試紙載體上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能夠檢測(cè)mk2基因的轉(zhuǎn)錄水平。

與mk2基因的核酸序列雜交的探針可以是dna、rna、dna-rna嵌合體、pna或其他衍生物。所述探針的長(zhǎng)度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長(zhǎng)度都可以。所述探針的長(zhǎng)度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長(zhǎng)度。同樣，所述探針的長(zhǎng)度可長(zhǎng)至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針長(zhǎng)度對(duì)雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最長(zhǎng)一般不超過30個(gè)堿基對(duì)，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度以15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探針自身互補(bǔ)序列最好少于4堿基對(duì)，以免影響雜交效率。

進(jìn)一步，所述mk2蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述mk2蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾(例如：嵌合抗體，scfv、fab、f(ab’)2、fv等)。只要所述片段能夠保留與mk2蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì)水平的抗體的制備時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來制備所述抗體。

本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述針對(duì)mk2基因的引物序列如下：正向引物序列如seqidno.3所示，反向引物序列如seqidno.4所示。

用于診斷多發(fā)性骨髓瘤的mk2基因及其表達(dá)產(chǎn)物的來源包括但不限于骨髓、血液、組織液、尿液、唾液等可以獲得基因組dna的體液。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，用于診斷多發(fā)性骨髓瘤的mk2基因及其表達(dá)產(chǎn)物的來源是骨髓。

本發(fā)明的上下文中，“mk2基因”包括mk2基因以及mk2基因的任何功能等同物的多核苷酸。mk2基因包括與目前國際公共核酸序列g(shù)enebank中mk2基因(nc_000001.11)dna序列具有70％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的dna序列；

優(yōu)選地，mk2基因的編碼序列包括以下任意一種：

(1)序列表中seqidno.1所示的dna序列；

(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的dna序列雜交且編碼相同蛋白質(zhì)的dna序列；

(3)與(1)或(2)限定的dna序列具有70％、優(yōu)選地，90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的dna分子。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述mk2基因的編碼序列是seqidno.1所示的dna序列。

在本發(fā)明的上下文中，mk2基因表達(dá)產(chǎn)物包括mk2蛋白以及mk2蛋白的部分肽。所述mk2蛋白的部分肽含有與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)的功能域。

“mk2蛋白”包括mk2蛋白以及mk2蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括mk2蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與mk2的dna雜交的dna所編碼的蛋白質(zhì)。

優(yōu)選地，mk2蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白質(zhì)：

(1)由序列表中seqidno.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(2)將seqidno.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由seqidno.2所示的氨基酸序列衍生物的蛋白質(zhì)。取代、缺失或者添加的氨基酸的個(gè)數(shù)通常為1-50個(gè)，較佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)。

(3)與seqidno.2所示的氨基酸序列至少具有80％同源性(又稱為序列統(tǒng)一性)，更優(yōu)選地，與seqidno.2所示的氨基酸序列至少約90％至95％的同源性，常為96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述mk2蛋白是具有seqidno.2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。

通常，已知的是，一個(gè)蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可改變單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€(gè)別添加、缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。

通過添加一個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是mk2蛋白的融合蛋白。對(duì)于與mk2蛋白融合的肽或者蛋白質(zhì)沒有限制，只要所得的融合蛋白保留mk2蛋白的生物活性即可。

本發(fā)明的mk2蛋白也包括對(duì)seqidno.2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只要經(jīng)過修飾的蛋白質(zhì)仍然能夠保留mk2蛋白的生物學(xué)活性即可。在此類修飾蛋白質(zhì)中突變的氨基酸數(shù)目通常是10個(gè)或者更少，例如6個(gè)或者更少，例如3個(gè)或者更少。

在本發(fā)明的上下文中，“多發(fā)性骨髓瘤”既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有多發(fā)性骨髓瘤、也包括受試者是否存在患有多發(fā)性骨髓瘤的風(fēng)險(xiǎn)。

實(shí)施例1篩選多發(fā)性骨髓瘤患者和正常人中差異表達(dá)的基因

1、研究對(duì)象：

收集多發(fā)性骨髓瘤患者8例，正常人8例

多發(fā)性骨髓瘤患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：所有多發(fā)性骨髓瘤的診斷根據(jù)who診斷多發(fā)性骨髓瘤標(biāo)準(zhǔn)，所有初治多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本獲得病人的知情同意。

多發(fā)性骨髓瘤患者的排除標(biāo)準(zhǔn)：轉(zhuǎn)移癌，反應(yīng)性漿細(xì)胞增多癥和未定性的單克隆免疫球蛋白病。

2、骨髓中總rna的提取

(1)骨髓單個(gè)核細(xì)胞的分離：向收集到的骨髓標(biāo)本中加入3倍體積的紅細(xì)胞裂解液，用滴管反復(fù)吹打混勻后于冰上放置10～15min，使骨髓標(biāo)本中的紅細(xì)胞充分裂解；1200rpm/min離心5min，棄上清，pbs洗滌細(xì)胞1次。棄上清，加入1mlpbs吹打混勻后轉(zhuǎn)移至1.5mlep管中，1200rpm/min離心5min，棄上清。每個(gè)樣本加1mltrizol，吹打混勻。

(2)每1mltrizol加入氯仿200μl，充分混勻劇烈震蕩15秒，室溫靜置10min等待分層。

(3)于4℃12000rpm/min離心15min。離心后可見管中混合物液面分為3層，最上層為無色水相，含有rna；中間層為白色絮狀，含有蛋白層與dna；最下層為紅色的酚-氯仿有機(jī)相。

取上層水相約400μl至另一ep管中，注意避免吸入中間的蛋白層，每管加入等體積異丙醇，輕輕上下顛倒混勻，室溫靜置10min，于4℃12000rpm/min離心10min，可見管底白色沉淀。

棄上清，加入-20℃預(yù)冷的75％depc酒精1ml，懸起沉淀，4℃7500rpm/min離心5min。

棄上清，室溫放置10-20min風(fēng)干沉淀，依據(jù)沉淀量的多少酌情加入depc水溶解沉淀。-80℃冰箱保存。

3、rna樣品的質(zhì)量分析

紫外分光光度計(jì)檢測(cè)rna樣品，od260/od280為1.8-2.0。

4、基因芯片雜交及掃描

采用affymetrixu133plus2.0microarrays檢測(cè)rna水平。多發(fā)性骨髓瘤患者組的數(shù)據(jù)可在nih基因表達(dá)綜合(geo)下gse2658檢索號(hào)查得，正常組和未定性的單克隆免疫球蛋白病的基因芯片數(shù)據(jù)在gse5900下。

5、芯片數(shù)據(jù)處理與分析

基因芯片的數(shù)據(jù)分析基于gco1.1軟件(affymetrix)，包含對(duì)與疾病相關(guān)相關(guān)的生存的單變量的對(duì)數(shù)等級(jí)檢測(cè)。對(duì)于兩組比值的自然對(duì)數(shù)絕對(duì)值大于2.0或小于0.5的基因作為差異表達(dá)基因。

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異比較采用單因素方差分析法，p＜0.05有顯著意義。

7、結(jié)果

結(jié)果顯示(如圖1所示，分析22例正常骨髓，44例意義未明的單克隆丙種球蛋白疾病(monoclonalgammopathyofundeterminedsignificance，mgus，mm前體疾病)，351例mm初診病人漿細(xì)胞基因芯片數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)mk2基因的表達(dá)水平在mm患者中要明顯高于正常以及mgus樣本)，與正常人相比，多發(fā)性骨髓瘤患者mk2基因的mrna水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。

實(shí)施例2qpcr實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證多發(fā)性骨髓瘤患者和正常人中差異表達(dá)的基因

1、研究對(duì)象

篩選標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)施例1，多發(fā)性骨髓瘤患者46例，正常人66例。

2、骨髓中總rna的提取

步驟同實(shí)施例1。

3、逆轉(zhuǎn)錄

根據(jù)takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行rna逆轉(zhuǎn)錄。采用10μl反應(yīng)體系，分別加入5×primescriptrtmastermix2μl，總rna0.5μg，加一定量rnasefreewater至10μl。37℃反應(yīng)15min，85℃反應(yīng)5s。產(chǎn)物cdna置-20℃冰箱保存。

4、qpcr

采用10μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，加樣過程避光。配制以下反應(yīng)體系：2×sybgreenmastermix5μl，正向引物0.5μl，反向引物(5pm)0.5μl，反向引物(5pm)0.5μl，模板cdna1μl，ddh2o3μl。擴(kuò)增mk2基因的正向引物序列為5’-tggggcgttaactgcatctgg-3’(seqidno.3)，反向引物序列為5’-tgggcctgctgttcacagtt-3’(seqidno.4)；擴(kuò)增gapdh基因的正向引物序列為5’-gcaccgtcaaggctgagaac-3’(seqidno.5)，反向引物序列為5’-tggtgaagacgccagtgga-3’(seqidno.6)，各項(xiàng)操作均于冰上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃1min，95℃15s，60℃15s，72℃30s；共40個(gè)循環(huán)。以sybrgreen作為熒光標(biāo)記物，在lightcycler熒光實(shí)時(shí)定量pcr儀上進(jìn)行反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，△△ct法進(jìn)行相對(duì)定量。

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩者之間差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p＜0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，與正常人相比，多發(fā)性骨髓瘤患者的mk2基因的mrna水平顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，結(jié)果同基因芯片實(shí)驗(yàn)。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>南京中醫(yī)藥大學(xué)

<120>分子標(biāo)志物mk2基因及其應(yīng)用

<130>

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>49266

<212>dna

<213>人源

<400>1

gggcgccgggccggtgggagccagcggcgcgcggtgggacccacggagccccgcgacccg60

ccgagcctggagccgggccgggtcggggaagccggctccagcccggagcgaacttcgcag120

cccgtcggggggcggcggggagggggcccggagccggaggagggggcggccgcgggcacc180

cccgcctgtgccccggcgtccccgggcaccatgctgtccaactcccagggccagagcccg240

ccggtgccgttccccgccccggccccgccgccgcagccccccacccctgccctgccgcac300

cccccggcgcagccgccgccgccgcccccgcagcagttcccgcagttccacgtcaagtcc360

ggcctgcagatcaagaagaacgccatcatcgatgactacaaggtcaccagccaggtcctg420

gggctgggcatcaacggcaaagttttgcagatcttcaacaagaggacccaggagaaattc480

gccctcaaagtaggtctggggcccggggaggggaggcggggccggtcccgggccctggag540

ctccacggcgtcgggtgcccgtcccggcctgggtcgcggcgcggggcggaggggtggccg600

cggcggggcggggcggggcggccgggccggcggtgccgagtgcggcgcgggcggcgggtc660

ccagcgccctcgcctccctgaccgcttccggccgctcccgggcgggagccctgggacccg720

ctcctggggactcaggggaccctgccattttggggtttgagcgggatccagccgagtcag780

aacggttggcttcgggacttctgctaatttcactccatctcaaggaagtgattttggggt840

tggtggttccccgtcctctcctccctcctttttctctctctgcgggcacaaaaggcccat900

tactcattgagccggttggtcggttggtttggagaagtcggatcgcagaggtttatttag960

cctcgctccttatttgggagccggaatgtgtgatttcacttccccgagcctcgcgagggc1020

agccgggccgccttggggcgcgccgggcaggaggtgtgcggcgggagggtcctgggtgtc1080

ccccggctgcgggggcgggattatttggatcccggagctggccccctcagctggccccct1140

cccacgcccgcgcggggcggctccggggagaggccggcggtgtccgcggcccggctgatc1200

attgtgaacagagtctgtaacccgcggccgggcccgtgctgattccgcctcctagagagg1260

gccacttgctgtcctggactcgcgccgtgatgggcagtctgaggaaacattatccttgag1320

ccgggggagcccatcccttttctttctttaaggggtgtggtggtggggagaataaggatt1380

caagtgagaatatcgacttcagaagttaaacacaatggactgggaggtctcatgagatgg1440

gtgggtccgcagtgaagtgtgagccggtcttgcagggtcaccaacaaggttttcctctca1500

caggggtttcaggtcaaaccaatctctaaaggtgacgcctcaggtctgtttcccctgggg1560

tgtctcaatgattggaggaggagaaaaatacttcctgtgttatatttttctcttcccctt1620

cagcccccacagcgagctgtatttcagttgtcaagtacaaaactcagaaatgtggtatgg1680

gtggaactattggaatatacgatcagatgttttaaaagaaacaccagtacttcggggttg1740

tacggggcaagcatgttccatttctagattttaaggcctctagaattgttttcctgctgc1800

tctcatactcaaccctgttacagtgctttgctttctactgtaagttattgctctgggatc1860

tcggttgttgtttagtgttgactgttggagaggggataagtatcttcaacacttcaacat1920

ttgtgtcttagacttctctttccctactcataactgaagggaaaggaggaggaggagttg1980

tttggattgagcatggctctgaccttggggactggagttgggtgaatacagtttgaccac2040

agttaacctgtatcattgaggaagtgacagacggtctttacaggagtgtttgctgtcccc2100

tctgagacaccatctgccttcacccattagtagtttggggacactggctgttcattctct2160

tggatatttggaatattatgtaaagacttcagaacaaaagctcccaacttctgctctgta2220

ttctgtttaatagacacacgcacaaaatcatcctataaaatgcttttgagtggcaattca2280

gatttctcttgtaactaacgagagagaggtttacatatttttctactttgaatagttttg2340

gaaggaaaaatccagcagcgtgttaaataacactcatagtttatccctctcaggttagaa2400

gtgggcgaagagtgaagtcagtctgttttgacaggcagcctgctcccagatcttttaagt2460

tgactcaactgttaaattgtggatttcccacacacgtctttgtgttaaaacttaataatg2520

gaggaagaaaggagagacaaggcatttggagactgacagcagtgttaacagcacttccat2580

atccaaatattggctgagacataattacagctgtggggggaatctggttcaaagaacgct2640

gttccagagacacacaccaaagagatttctagatcttgaattttgattaacctcaggtgc2700

tgagtagtgaaatggttttcaaaaccagaagtctagtgattataaagcaggagaggaaga2760

tggagtggggcaagagggattacccccttgggaaggtgcctgagaaaaggggaggagacc2820

tctattctacagtgtgccgaggccaatgctgggggctagggcagagctggagggcaggag2880

cccagcctctgctggggttcagaagtctgctatgttgcagccctgagagttgatgggagc2940

tggcagctgcttagatgctctcctctctgcctatagtcggtgacctcttagccctgttaa3000

gtgaaatcagcatttgaaaaagagtcccagctcaccctgctgcttctctccctccacctc3060

agagagctcccatttaaatgcttttggtgggtgctttgacctcacctcaccatctctcct3120

ggctgcttttgctaagttctgagtcatgcttccagtcagagttgcaagggacttgaaagg3180

tcattttgtccagcccccttattttgcagaagagaaaaccaaggcccagagtgagggagt3240

gacttgttcaaggtaccatagccattcacttggcagaggcaggattggaacccaggttgc3300

ctgactcccagtctcaggcttcttcccacttacttcctaactgagccacgggctcaggca3360

catggccacctgctgctccagggtgcttccagcctgaggagctgttctgtcacctcaggc3420

cctgactgacaagaggggaggtcagcgaagggggctggatgggtatttgctgctcctgag3480

aacagtccccaaagttggaggggaacttcaacagtagcttcatgcatttttttaaccact3540

ccctcccccttttaagagagtatttgataggcaccttacttactattttttgtacaagaa3600

catgggaattctattatttttatttttattttttttgagacagagtgttgctctgtcgcc3660

caggttagagtgcagtagcacgatcttggctcactgcaagctctgcttcccaggtccacg3720

ccattctgcctcagcctcctgagtagctgggactacaggcgcccgtcaccatgcccggct3780

aattttttgtatttttagtagagatggggtttcactgtgttattcaggatggtcttgatc3840

tcctgacctcgtgatctgcctgcctcagcctgcctaagtgctgggattacaggtgtgagc3900

taccgcgcccggcctgtattacttctttgataaggacacctagtctcaacccacttgtgt3960

attaattagttgtattccccgggagggttcctcagctgcttgccgcttcactgtgtcatg4020

gtgacccttaggtgttagctcaacaaatttaattaaagactgtatcgttgttctctgctg4080

tgcaactctgattaggtgaagcatgttactgctttataaaatatagaatgttgtcgtaac4140

ttatctctgtgtatctttccattgcgtggattagagaaaacaaggtcctgtagtttcttt4200

tcctttcctttctccagcattcctctctccctaggtcatggaagtgccactgcgatgtgg4260

cttcctttgttctggtgaaggggagatgattggagcctctcatgattattctggatgctg4320

ttggagggaaatgccagagctcccacatccccacagtacaggcaccatctcctttccaac4380

acacctcatactgtgtacctgtggagggcaagacagttagtgtggctaggtgagaggcag4440

tgtcccaaactggagtttgctggagttgtcacaaggttaggaaaatttcattgaccaagc4500

cagcctcttttatatgcaatatggttacaggtaggtaacagtttgctgaatatctatcat4560

aagcttagttgcatggaggatacacatgtaaaaaatggcctgtaaaattttgagtcaaga4620

aacttatttagagaaggtgaaattaacacatgtaggctagggctgcactgtccaatctgg4680

tagccactaccctcacatagctaattaaattaaaattaattaacatgaatggattaaact4740

aaattaaatttgaaaaatcagttgctagccacacttcaagtgttcagtaaacatgtggct4800

aatggctatcgaattgaacaatgcagaagaacattttcatccttgcagaacgttctccta4860

gactttgttggtctgggagctaaatcgtgtggctgggaatagaggagctttgaaagaggg4920

gaatctgtggtgactccaggagctaagggaggctccagctggggtcagtgggacatggct4980

gtgcctctgaggagtgagcaagtctgtgagaggtgtggtgacattggcctggctagaact5040

gaggggaggaacaggaggtcagagtggtcaggggttggtggctccaaattgaagctaact5100

catcttgtgtcaaagcaggctttaaagtgtttgaggggcatgaaggtgtcaaaaaaggtt5160

aggaatcattgaagatgggcttacagaattatgagggaagggtcaggtttgtggtttcag5220

agatcctgtccctcctggccgtagccctgaccccagccctgacccctggctcctgcagca5280

gggcccttggcatccactgaggcaagattgaagctgggtcagctcactgtccttttttac5340

ttgtgaattctgggctttgactgagcttggagacaatctccagctaagatacgggatcag5400

tggctgacaggaggggagagacaagcagtccctgggccttagggccaaatattggtgggt5460

gtctaggaaacaaaagaacccctttgtgggaggaggaaggtattgggacctgtgatgttt5520

ctgctacttgggacctgagaggttgggccatccataattgatgatttttcttatgaagca5580

ggtacaggggattgggaggagggcctggaagagcccagcctcagaactgctggaggcaaa5640

cttaatccttgggctaggggaggggccaaagctcctgttagccagagcccaggagtgtgc5700

tgagtgggtgccaggaggaatgtcagccaagatggggaagagcagggcacagtcgtctgc5760

atctgagccattgcccagttcccaagcagccttgccatgctctgagctggggttcttcct5820

ggtggcgtgatgtctgtggtgcaggattcactctattctcctacctttcctctacttcag5880

gccctgccaagtgtcatgtgaggtctcttttccccctcttccctgcactgtatctttcca5940

gatggttctgtgtcctggagggaggtggatgggcagagaagagttgttctttgcagggac6000

tgcagcttttcttggtaatggtttgaggcccagtggcaaagcaacccacacttcatagta6060

acttagaacccacactccctggtcatctttcttgactccttgcacatcactgaggaagaa6120

gctggcctagtgcagaaatgttcagtggcatgtccaaggtcttacatggtgtcagcatcc6180

gagccacatcttgagacctggttccctgggacctgctcttggtctgggcccctttggttt6240

ttggttgctagaagactgtagacctggtggagcaaaactgagctccactaacgcatcagc6300

taggatctttccacatgggttaccttgtaaatgggggcattggtgaagagaaggggccat6360

gtcactggacagtgtaataacgtatggcagttatagaacccaaatcagattgctgtgtac6420

cttttctagtttttaggaaaatactggtattttgtattttaagatatatatatatatata6480

tatatacacacatacacagatatagatatgtagagatgagcttgttaccatgggttatgt6540

gctagataagaaagcaaaaataagtgcatacataaatagaaagcttccagtgtttgtatg6600

ctgctaacaagttacatgaccttgaataggtcagctaaactttccaggcctcattgcaca6660

gagggtcggctcgagcagctcctgagcaccggcagggtgaggcagtagaaggcggtgctg6720

caggccagaggtggagggcaggcaggatagcttgctgacttgctccgggtctgaccatca6780

gcagtatctgggtcagcacagatgccctttcgtaagcttagtgcctggctccagggcagc6840

ctgtgtccagttaatgaataatcatcactgaccagctgctccttctcttgtgtgaagact6900

tagaaagtgttctatgctggtgactcggcagagaggatagactacgtaatttagcagggt6960

gtgcatcttctctttccttaaaatcagaagaatcatagtgtagtggtggtgcaaagtaga7020

gatgaggaactctattccctgtttgagattcctttctcaagttatggggcatttgagggc7080

cactgtgatttctggtgcaggctgttccctgtgcacagggatctggttgaggagctaagc7140

gaaggctgaagtccagccactgtctccttgcttggctttgtctttgtgtgtggctgggtt7200

ctttcaaaggagtgccttctaattcaccaaaggtatggttatggattaggggttgttctt7260

aggttagagttggggactgattcacagagctgatgaggaaattaggatttacattcaggt7320

gaccctcagcccctcagaccaggctgagtaagaagagatatcaggaatccaaggaagcag7380

gaggaaaaggggttgcctggtgatgtctgttctctttcctcctcttcctgcccatgcaag7440

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caggtttggtgggaggaggaagaaagccacagtagaaggagacataaagttgggctgggc7560

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cagaatgagctgggacaaggccccaaggtcagcccatatttgtatctggtgttctcctcc7680

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ttcctgccacaccgctgacctgtttctctcactttctgctgatattctccctgcttgccc8340

ctttctcttccagcctgagcttggtaggtgatttggggctaactcactcttctgagtgct8400

gggagacgtgctatggtttttatgtctccaggtgtctagatttgtgtgtatgaaagctcc8460

gtgaagctgtcctgcttatttcccagtagggaaagggttagacaaaaaggagagtgacca8520

agctcatcagagtggatcagaccttctactgtgctcgcctccagccctggcttcctccag8580

ttttacctccaagcaggcctctttgccagagttacctggttatggtaacagagttaccat8640

agttatatgctaggacagccccacatgggcagtctgccccaggccttcaacccgactgcc8700

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cctccgcagtgtgaggctttgggctaccacattcaaaagtgtgacctcatcttgtcagcg8820

tccaagaataactgggccctggctctcaggatctccttcctgagtcaggccatggcacct8880

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cttgactgcagtattgatgtgtgtccatggaggtgtggcctcttcctctactccccaggg9000

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agctgatagatactgggcagagtctgacattggcattctgttcttcagcgtggcgttagt9120

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tgatggcaatgacaaccaagacataggacttgaggaacccactgccttcagctagagtta9300

catactctgaccatgtgtcgatggcctccttctcccacctctcccctggggccacatttc9360

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atagttgctaagtgtttatttttaactctgacagaaggagcccctgtcctcagaatagcc9480

ataccctctgtctttccctatcccgactgccttccttggcttctgtgattcctagaagaa9540

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ggagagccctggacactaaaggccgtgtgtctggaacttggagaattctaggaatgcagg9720

tgacctgatgaggaggctgcatgtgccctgcagctcagagcagcctggctgcacagctga9780

gttggacagcccagcaaggggtcatcccataccttctacatccttacaggcacccagatc9840

tctggcagatggggaggccacagggagaaaatgagcatatgtagtaacctgccctggaaa9900

cacttgcgcttgcagacacgccaagtgctgtcattccctctgactgccaggctcacgagc9960

atcatgtcctttccagcagagcccacctgcgactcttagtgacttcataccctttgtgtt10020

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tgccccctctcctgggtctcagactttcctgactttatgcatttgatttggctacctggg10140

ctcggatactttaaaagaaaataaaattaggtttgaggtgtaaccagagagagaaggaat10200

agagagtagtagggggtgggatgggtggttgaaacatgtggctaactctgagaaccctca10260

gctatggaaggaaggtcttgcccccatgattcttcggcgtgcagtgggggattagtttgc10320

ccagagcccagctctgatcatgtagcttcccagcttaagcccttcagtgggtctctctgc10380

ctgcagaatacatgagatatccacatctttcccagatctggccctgatctgttttttttt10440

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ctctctctctctctttttttttttaacaggaaggtaatttattaacggaaaatatttgag10800

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ggagtgacgtcctcaatctgtccgatcttcatacctgagcgggcaagggccctgagggcc10920

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tttgccagaaagatcagtgacatggacaaaagtgtcattgaaggatgcaaagatatggca11160

gacaccaaatacattctctccttcagccacctgaggtctgaggctgatgacctgttcttc11220

cttcttttccttcccctttcaaggtgccatttctgcatgttgtttccagactccgcacag11280

gaacgcaaggcacctctttagatatcggattggactgtaaatcccctgaaaacctacatc11340

ttcattatttttgtgtcctcttattttcatgtagtgaccgtatgtcctcattaaaaaact11400

caggccaggcatggtggctcacgcctgtaatctcagtgctttggaaggacaagtgggagg11460

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aaaaaattaaaaaggttagccagctgtggtggcacatacccatagtttcagctactcagg11580

aggctgaggtgggaggatcacttgagcccaggaagtcacggttacagtgagctatgatca11640

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actgagtaatagtggatgccaccgatattaaatgtgatgtactagaggtaatcctcagag11820

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caccttctatttctgcttacagagttctcattcttacaaggaccctgaccacagtttctc12060

attgatgcctctcctccttctccctgttccaaggcccctcctattcctgttcagtcatgg12120

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