專利名稱：Is256基因在制備鑒別病原菌性質的分子標志物中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術和臨床檢驗領域，涉及一種用于鑒別病原菌性質的分子標志物，具體涉及IS256基因用于鑒別表皮葡萄球菌侵襲性和正常性菌株的新的分子標志物用途。
背景技術：
近年來，隨著導管等高分子材料留置物在醫(yī)院中的廣泛使用，表皮葡萄球菌已成為與醫(yī)療器械相關的醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌。但同時，表皮葡萄球菌也是人體皮膚和粘膜表面的正常菌。因此，在臨床檢驗中，正確地鑒別所獲得的標本是引起感染的病原菌還是在臨床標本收集過程中污染的正常菌株，對于采取有效的治療措施具有重要的意義。
很多實驗表明生物膜的形成是表皮葡萄球菌致病的主要因素(Christensen，G.D.，W.A.Simpson，A.L.Bisno，and E.H.Beachey.1982.Infect Immun37318-26；Deighton，M.A.，R.Borland，and J.A.Capstick.1996.Epidemiol Infect 117267-80；Huebner，J.，and D.A.Goldmann.1999.AnnuRev Med 50223-36；von Eiff，C.，G.Peters，and C.Heilmann.2002.Lancet Infect Dis 2677-85.)。因此，人們希望用是否形成生物膜作為區(qū)分侵襲性菌株和正常菌株的標志。Ziebuhr等發(fā)現(xiàn)87％的臨床菌株在組織培養(yǎng)板上形成了生物膜，而只有11％的皮膚來源菌株可形成生物膜(Ziebuhr，W.，C.Heilmann，F(xiàn).Gotz，P.Meyer，K.Wilms，E.Straube，and J.Hacker.1997.Infect Immun 65890-6.)。但由于生物膜的形成會受到許多條件的影響，生物膜的測定方法尚需標準化(Ziebuhr，W.，C.Heilmann，F(xiàn).Gotz，P.Meyer，K.Wilms，E.Straube，and J.Hacker.1997.Infect Immun 65890-6；Deighton，M.，and R.Borland.1993.Regulation of slime production in Staphylococcusepidermidis by iron limitation.Infect Immun 614473-9.)。因此，以生物膜為表型標志并不是一個準確、穩(wěn)定的方法。許多研究探討了以與生物膜形成相關的基因作為鑒別表皮葡萄球菌侵襲性菌株的分子標志的可能性，包括有ica、atlE、fbe、app、agr、sar和mec等基因(Frebourg，N.B.，S.Lefebvre，S.Baert，and J.F.Lemeland.2000.J Clin Microbiol 38877-80.；Galdbart，J.O.，J.Allignet，H.S.Tung，C.Ryden，and N.El Solh.2000.J Infect Dis 182351-5.；Vandecasteele，S.J.，W.E.Peetermans，R.M.R，B.J.Rijnders，and J.Van Eldere.2003.Clin Microbiol Infect9114-9.)。其中，以ica基因研究得最為深入。ica操縱子編碼的基因調控生物膜形成必不可少的多糖細胞間粘附素(polysaccharide intercellularadhesion，PIA)的合成(Ziebuhr，W.，C.Heilmann，F(xiàn).Gotz，P.Meyer，K.Wilms，E.Straube，and J.Hacker.1997.Infect Immun 65890-6.)。但ica基因在侵襲性菌株中的分布存在很大的差異，由43％到88％，在正常菌株中則從0至38％(1，2，10，11，15，18)，以ica基因作為分子標志并不理想。因此，有必要尋找新的鑒別表皮葡萄球菌侵襲性菌株的分子標志。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于鑒別病原菌性質的分子標志物，具體涉及IS256基因用于鑒別表皮葡萄球菌侵襲性和正常性菌株的新的分子標志物用途。
本發(fā)明通過比較臨床致病菌株RP62A和正常菌株ATCC12228的全基因組，從中發(fā)現(xiàn)細菌插入序列IS256可以作為一個新的區(qū)分侵襲性和正常性表皮葡萄球菌的分子標志物。
本發(fā)明從全基因組水平挑選出特異地存在于致病菌株中的基因，研究分析它們在不同來源菌株中的分布，進而找出與致病菌株密切相關的基因，研究它們作為鑒別表皮葡萄球菌侵襲性菌株分子標志的敏感性和特異性。結果為細菌插入序列IS256可以作為區(qū)分表皮葡萄球菌侵襲性和正常性菌株的分子標志，同時，它與icaA基因共同使用可以明顯降低侵襲性菌株的假陽性率。
本發(fā)明通過下述方法和步驟進行，1、基因組比對將表皮葡萄球菌菌株ATCC12228的全基因組序列(Zhang，Y.Q.，S.X.Ren，等.2003.Mol Microbiol 491577-93.)與TIGR的RP62A的全基因組序列(http://www.tigr.org)進行比較。通過blast N軟件進行基因組比對，并用ACT軟件進行分析(http://www.sanger.ac.uk)，得到特異地存在于RP62A基因組上的DNA片段，并用blast X軟件在NCBI nr數(shù)據(jù)庫中搜索相對應的基因。
2、菌株采集收集了117株表皮葡萄球菌菌株，分為三個組。第一組為侵襲性菌株，共40株，分別來源于上海華山醫(yī)院病人的導管、血液以及尿液標本；第二組為正常菌株，共55株，分離自復旦大學學生的皮膚表面，這些學生至少半年內(nèi)沒有到過醫(yī)院；第三組來源于醫(yī)務人員，共22株，采集自華山醫(yī)院醫(yī)務人員的皮膚表面。所有菌株都經(jīng)Api-Staph(BioMérieux，里昂，法國)檢驗為表皮葡萄球菌。
3、提取表皮葡萄球菌基因組DNA提取方法參考Flamm等的方法(Flamm，R.K.，等.1984.Infect Immun 44157-61.)離心收集培養(yǎng)過夜的菌液，收集的細胞重懸于100μl 0.01M的磷酸鈉緩沖液中，其中含有20％的蔗糖及2.5mg/ml的溶菌酶。在37℃孵育45分鐘后，加入500μl的溶解緩沖液(含10mM Tris-HClpH8.0，1mM EDTA，1％SDS)和5μl 20mg/ml的蛋白酶K溶液，繼續(xù)孵育30分鐘。用酚和氯仿處理后，無水乙醇沉淀DNA。
4、PCR擴增反應依據(jù)RP62A的基因組序列，分別設計六對引物用于擴增IS256，IS257，bhp，kdp，icaA和16S rRNA基因。其中16S rRNA基因用作內(nèi)對照。引物的核酸序列和PCR反應條件見表一。PCR反應用PCR MasterMix(天為時代公司，北京)在GeneAmp-9700 PCR反應儀(Applied Biosystems，美國)上完成，并用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。同時隨機挑選PCR產(chǎn)物進行測序驗證。
5、鑒別重復片段序列PCR(Repetitive element sequence-based PCR，rep-PCR)用于rep-PCR的引物RW3A(5’-TCGCTCAAAACAACGACACC-3’)由Del Vecchio等人設計(Del Vecchio，等.1995.J Clin Microbiol 332141-4.)。Rep-PCR反應用PCR MasterMix在GeneAmp-9700 PCR反應儀上完成。PCR反應條件如下94℃預熱3min，然后進行35個循環(huán)的反應(94℃下變性1min，54℃下退火復性1min，72℃下延伸2min)，最后在72℃下繼續(xù)延伸5min。擴增產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析。
結果表明，IS256可以作為分子標志有效地鑒別表皮葡萄球菌侵襲性菌株，而IS256和icaA基因的聯(lián)合使用可以明顯降低檢測侵襲性菌株的假陽性率。


圖1是不同基因片段的PCR擴增結果。以表皮葡萄球菌RP62A基因組DNA作為模板。
圖2是不同表皮葡萄球菌菌株的代表性rep-PCR指紋圖譜。
具體實施例方式
實施例11)基因組比對為了找出特異地存在于表皮葡萄球菌侵襲性菌株上的基因，本發(fā)明將PR62A和ATCC12228的全基因組序列進行了比較。結果顯示，除了與生物膜形成密切相關的ica操縱子外，還有一些基因、操縱子和插入序列特異地存在于RP62A的基因組中。主要有編碼耐甲氧西林的蛋白基因(mecA)，耐氨基糖苷類的蛋白基因，抗?jié)B透壓蛋白基因(kdp)，bap樣蛋白基因(bhp)及葡萄球菌插入序列IS256，IS257。
2)表皮葡萄球菌菌株的Rep-PCR分型為了排除收集菌株過程中出現(xiàn)的污染，或是所選標本來自同一菌株爆發(fā)流行的可能性，本發(fā)明采用rep-PCR鑒定了所有菌株的基因型。結果表明，這些菌株的rep-PCR圖譜的條帶數(shù)目和大小都各不相同，說明是不同的菌株，排除了污染及爆發(fā)流行的可能。(rep-PCR的代表性指紋圖譜見圖二)3)初步篩查結果為了鑒別由全基因組比對得到的4個特異性基因是否可以作為表皮葡萄球菌侵襲性菌株的分子標志，本發(fā)明用PCR的方法檢測了這些基因在7株侵襲性菌株及5株正常菌株的分布，結果顯示bhp、kdp、IS257和IS256基因在侵襲性菌株中的分布分別為2/7、0/7、7/7及6/7，而在正常菌株中的分布分別為2/5、0/5、4/5及1/5。表明bhp、kdp和IS257基因在兩種菌株中的分布沒有明顯差異，而IS256基因在侵襲性菌株中的分布明顯高于正常菌株。
4)IS256在菌株中的分布本發(fā)明檢測了IS256在117株表皮葡萄球菌菌株中的分布。結果為，IS256在侵襲性菌株中的陽性率為85％(34/40)，在正常菌中的陽性率為16％(9/55)，而其在醫(yī)務人員來源的菌株中的陽性率則居于前兩者之間，為41％(9/22)(見表二)?？ǚ綑z驗的結果表明IS256的分布在三組之間都具有顯著的統(tǒng)計學差異(見表三)。結果驗證IS256是可用作鑒別表皮葡萄球菌侵襲性菌株和正常性菌株的分子標志，
5)icaA在菌株中的分布本發(fā)明同時檢測了icaA在菌株中的分布情況。結果為，icaA在侵襲性菌株中的陽性率為60％(24/40)，在正常菌株中的陽性率為13％(7/55)，而在醫(yī)務人員來源的菌株中的陽性率則居于前兩者之間，為27％(6/22)(見表二)?？ǚ綑z驗的結果表明icaA的陽性率在正常菌株組及醫(yī)務人員來源組之間不具有統(tǒng)計學差異，但它們都顯著低于侵襲性菌株組(見表三)。
6)IS256和icaA作為分子標志的比較本發(fā)明比較了IS256和icaA作為表皮葡萄球菌侵襲性菌株分子標志的敏感性和特異性。
所述敏感性是指侵襲性菌株被鑒定為陽性的比例，特異性是指正常菌株被鑒定為陰性的比例。
侵襲性菌株組和正常菌株組比較顯示，IS256的敏感性和特異性分別為85％(34/40)和84％(46/55)，而ica的敏感性和特異性則分別為60％(24/40)和87％(48/55)(見表二)。表明以IS256作為表皮葡萄球菌侵襲性菌株的分子標志，其特異性與icaA基本相同，但敏感性卻明顯提高。而且，在正常菌株組中沒有發(fā)現(xiàn)任何菌株同時存在IS256和icaA基因。
以上結果表明IS256可以作為分子標志有效地鑒別表皮葡萄球菌侵襲性菌株，而IS256和icaA基因的聯(lián)合使用可以明顯降低檢測侵襲性菌株的假陽性率。
表1.PCR反應的引物及擴增條件


表2.IS256和icaA基因的PCR擴增結果

表3.IS256和icaA基因在侵襲性，醫(yī)務人員及正常性三組菌株中存在情況的比較

RR(relative risk，即相對風險)是指發(fā)現(xiàn)相應基因在特定組別中較其他組別的相對風險。95％CI(95％ confidence interval，即95％可信區(qū)間)是指相對風險值RR的95％可信區(qū)間.P-value，P值給出了相應基因在兩組來源中存在性之間的統(tǒng)計學差異。
權利要求
1.IS256基因在制備鑒別病原菌性質的分子標志物中的用途。
2.根據(jù)權利要求1所述的用途，其中所述的病原菌是表皮葡萄球菌。
3.根據(jù)權利要求1所述的用途，其中所述的鑒別病原菌性質是鑒別侵襲性表皮葡萄球菌和正常性表皮葡萄球菌。
4.根據(jù)權利要求1所述的用途，其中所述的IS256基因和icaA基因聯(lián)合使用可降低檢測侵襲性菌株的假陽性率。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術和臨床檢驗領域，涉及一種用于鑒別病原菌性質的分子標志物，具體涉及IS256基因用于鑒別表皮葡萄球菌侵襲性和正常性菌株的新的分子標志物用途。本實驗通過比較臨床致病菌株RP62A和正常菌株ATCC12228的全基因組序列，找出特異地存在于致病菌株中的基因IS256，實驗結果顯示細菌插入序列IS256可以作為鑒別表皮葡萄球菌侵襲性菌株的分子標志，而且它和icaA基因的聯(lián)合使用可以明顯降低檢測侵襲性菌株的假陽性率。本發(fā)明可用于臨床檢驗，正確地鑒別所獲得的標本的性質，對于采取有效的治療措施具有重要的意義。
文檔編號C12Q1/04GK1936018SQ20051002999
公開日2007年3月28日 申請日期2005年9月23日 優(yōu)先權日2005年9月23日
發(fā)明者高謙, 聞玉梅, 顧家峰, 李華林, 李敏 申請人:復旦大學