專利名稱:一種分離人脂肪組織中內(nèi)皮祖細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及組織工程學(xué)中獲得種子細胞的方法。
背景技術(shù):
目前組織工程血管構(gòu)建所需的內(nèi)皮種子細胞主要來源于大血管或微血管的成熟內(nèi)皮細胞,以下原因限制了其應(yīng)用一,供體血管來源有限;二,所得細胞為終末分化細胞,擴增能力有限,不能滿足組織工程對種子細胞數(shù)量的要求。
早在1997年Asahara T等發(fā)現(xiàn)出生后循環(huán)外周血中存在能分化為血管內(nèi)皮細胞的前體細胞,考慮其與胚胎發(fā)育中血管母細胞的延續(xù)關(guān)系,將其稱為血管內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cell,EPC)。EPC是一類能循環(huán)、增殖并分化為血管內(nèi)皮細胞,但尚未表達成熟血管內(nèi)皮細胞表型,也未形成血管的前體細胞。由于其在血管新生中的重要地位,EPC一直是研究熱點,大量的研究主要集中在從臍帶血、骨髓以及外周血中分離EPC。然而外周血中EPC獲取量極少,臍帶血存在倫理問題,而骨髓穿刺比較痛苦且細胞獲取量也較少,這些缺點都限制了其應(yīng)用。2001年Zuk PA等報道抽脂手術(shù)得到的皮下脂肪組織中存在多向分化的干細胞以來,從脂肪中獲取內(nèi)皮祖細胞的研究成為熱點目前,體外分離EPC的方法有多種,免疫磁珠(magnetic activated cellsortor,MACS)分選法是最常用的一種。而免疫磁珠分選法早期一般用CD34+磁珠,近年來更多的應(yīng)用CD133+磁珠,其最大特點是可以收集到較高純度的EPC,但研究也發(fā)現(xiàn)分離得到的CD34+細胞數(shù)量非常少,單獨培養(yǎng)時往往不能增殖,只能與CD34-細胞共同培養(yǎng)時才有增殖活性,而且免疫磁珠分選法操作復(fù)雜、費用較高。
密度梯度離心結(jié)合纖維粘連蛋白(FN)黏附法也是分離EPC的一種常用方法,早就用在從骨髓或外周血中分離EPC。但用FN從脂肪組織中分選EPC,國內(nèi)外尚無此報道。
因此本領(lǐng)域迫切需要一種操作簡便、成本低廉、有效、原材料來源廣泛的分選EPC的方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在利用纖維粘連蛋白(FN)從人脂肪組織中分選內(nèi)皮祖細胞(EPC)。
在本發(fā)明的一個方面,是提供一種內(nèi)皮祖細胞的分離方法,它是從脂肪組織中分選,步驟包括(1)將脂肪組織用膠原酶消化,從而解離脂肪組織中的細胞;(2)對步驟(1)中解離的細胞在800-1500g離心3-10分鐘,去除上層的脂肪獲得,獲得下層細胞;(3)將步驟(2)中獲得的下層細胞,以1×104-5×104個/cm2接種于纖維粘連蛋白(FN)包被的培養(yǎng)皿,在含1%-3%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)3-8小時;(4)去除步驟(3)中培養(yǎng)物中游離的細胞,從而獲得通過纖維粘連蛋白固定于培養(yǎng)皿的固定細胞,即為內(nèi)皮祖細胞。
其中優(yōu)選0.005-0.02%II型膠原酶消化20-60分鐘;所述的脂肪組織是人脂肪組織。
上述的分離方法,還包括步驟(5)將獲得的內(nèi)皮祖細胞進行傳代,傳代如下進行0.05%胰酶消化,待細胞收縮變圓,終止消化;細胞收集離心;細胞計數(shù)按密度為2×104個/cm2接種。
在另一優(yōu)選例中,在步驟(3)或(5)中低血清培養(yǎng),即含10-30ml胎牛血清/升培養(yǎng)液。它包括DMEM、M199或F12培養(yǎng)液。
上述的分離方法,還包括步驟檢測分離獲得的內(nèi)皮祖細胞上標志物CD34+。
在本發(fā)明的另一方面,是用上述的分離方法得到的內(nèi)皮祖細胞。
在本發(fā)明的另一方面,是用上述的分離方法得到的內(nèi)皮祖細胞可用于分化產(chǎn)生內(nèi)皮細胞;用上述的分離方法得到的內(nèi)皮祖細胞在組織工程中可作為內(nèi)皮種子細胞;上述的分離方法得到的內(nèi)皮祖細胞可用于制備內(nèi)皮移植物。
在本發(fā)明的另一方面,是纖維粘連蛋白(FN)在從脂肪組織中獲得內(nèi)皮祖細胞的應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的內(nèi)皮祖細胞分選方法操作簡便、成本低廉、原材料來源廣泛。
圖1細胞形態(tài)顯微鏡觀察圖2細胞免疫熒光檢測圖3流式細胞儀(FACS)檢測圖4a.誘導(dǎo)祖細胞光鏡觀察(×200)b.誘導(dǎo)祖細胞熒光顯微鏡觀察圖5第2代細胞接種在甲基纖維素的半固體培養(yǎng)基內(nèi)顯微鏡觀察具體實施方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究發(fā)現(xiàn)在脂肪組織中存在一定含量的內(nèi)皮祖細胞(EPC),運用纖維粘連蛋白(FN)可以從脂肪組織中有效分選EPC。由該方法所得的內(nèi)皮祖細胞陽性率高,具有分化能力。
Fibronectin(FN)是細胞外基質(zhì)中的一種糖蛋白,參與細胞黏附、細胞運動、傷口愈合等細胞功能性活動,本發(fā)明的一個方面在利用FN從人脂肪組織中分選EPC,應(yīng)用低血清培養(yǎng),其步驟包括(1)將脂肪組織用膠原酶消化,從而解離脂肪組織中的細胞;(2)對步驟(1)中解離的細胞在800-1500g離心3-10分鐘,去除上層的脂肪獲得,獲得下層細胞;(3)將步驟(2)中獲得的下層細胞,以1×104-5×104個/cm2接種于纖維粘連蛋白(FN)包被的培養(yǎng)皿,在含1%-3%胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)3-8小時;(4)去除步驟(3)中培養(yǎng)物中游離的細胞,從而獲得通過纖維粘連蛋白固定于培養(yǎng)皿的固定細胞,即為內(nèi)皮祖細胞。
本發(fā)明所述的膠原酶是II型膠原酶,其中優(yōu)選0.005-0.02%II型膠原酶消化20-60分鐘;本發(fā)明所述的低血清培養(yǎng)液是含10-30ml胎牛血清/升培養(yǎng)液,它包括DMEM、M199或F12培養(yǎng)液。本發(fā)明是從人脂肪組織中分選、培養(yǎng)內(nèi)皮祖細胞EPC。
CD34是內(nèi)皮祖細胞主要的分子標志,本發(fā)明得到的細胞傳至第二代CD34+陽性率高達72.39±13.45%,而不表達CD45(造血干/祖細胞的標志)及PECAM-1(成熟內(nèi)皮細胞的標志),如圖3所示。本發(fā)明涉及的分離方法為組織工程血管構(gòu)建找到了新的種子細胞來源。
本發(fā)明的另一個方面是用上述方法所獲得的內(nèi)皮祖細胞EPC,所述的EPCCD34+陽性率高;能分化為成熟內(nèi)皮細胞;可以作為組織工程中的種子細胞。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于1.分離方法的原材料來源廣泛,不存在道德倫理問題;2.分離方法操作簡便、成本低廉;3.所獲得的EPC具有理想的分化能力。
下面結(jié)合具體實施例,進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人脂肪組織中分離內(nèi)皮祖細胞的方法(1)將人脂肪組織用0.01%II型膠原酶消化30分鐘;(2)1200g離心5分鐘;(3)以5×104個/cm2接種于纖維粘連蛋白(FN)包被的培養(yǎng)皿,用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),6小時換液;(4)待細胞融合至80-90%時,進行傳代,傳代密度為2×104個/cm2,體外擴增至第二代后,進行誘導(dǎo)。
實施例2細胞誘導(dǎo)用實施例1所述的方法獲得的第二代細胞分誘導(dǎo)組與非誘導(dǎo)組,非誘導(dǎo)組用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng);誘導(dǎo)組用含2%胎牛血清和VEGF,bFGF等生長因子的EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)。
實施例3檢測1.細胞形態(tài)觀察結(jié)果見圖1,誘導(dǎo)12天后細胞呈典型內(nèi)皮細胞“鋪路石”樣結(jié)構(gòu)。原代細胞為梭形細胞(圖1a);第二代細胞非誘導(dǎo)組仍為梭形(圖1b),而誘導(dǎo)組細胞呈典型的“鋪路石”樣排列(圖1c)。
正常內(nèi)皮細胞是“鋪路石”樣形態(tài)。我們把收到的“梭形”細胞,在合適的培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮樣形態(tài)。從形態(tài)上講,“梭形”細胞轉(zhuǎn)化為正常內(nèi)皮細胞樣形態(tài),結(jié)果表明分離得到“梭形”細胞是內(nèi)皮細胞的前體細胞(即其祖細胞)。
2.細胞免疫熒光檢測分別培養(yǎng)和誘導(dǎo)12天后,用乙醇∶乙酸(99∶1)固定細胞15min;其中準備檢測VWF的爬片加0.25%Triton X-100作用10min,以增加細胞膜的通透性,其它爬片加PBS 10min;0.5%BSA 37℃封閉30min;0.5%BSA 1∶200稀釋鼠抗人CD34、VEGFR-2、VWF和PECAM-1單抗(美國Santa Cruz公司產(chǎn)品)37℃孵育60min;加0.5%BSA 1∶50稀釋FITC標記羊抗鼠二抗37℃孵育30min;PBS漂洗;碘化丙啶(PI)(1∶1000,美國Sigma公司)37℃孵育10min;PBS漂洗后封片,熒光顯微鏡觀察。
結(jié)果見圖2,第二代細胞非誘導(dǎo)組CD34有表達(圖2a),而VEGFR-2、VWF和PECAM-1未見明顯的陽性表達細胞;誘導(dǎo)組VWF和PECAM-1為陽性(圖2b、2c),而CD34、VEGFR-2未見陽性表達。CD34是未分化細胞的標志,VWF和PECAM-1又名CD31,是成熟內(nèi)皮細胞主要標志之一。
結(jié)果表明分離得到的非誘導(dǎo)細胞細胞表達CD34,(內(nèi)皮祖細胞的標志之一),是內(nèi)皮祖細胞(EPC)。在合適的培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化為VWF陽性、PECAM-1陽性(成熟內(nèi)皮細胞)。從另一角度說明“梭形”細胞能轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細胞。是對形態(tài)學(xué)的補充,表明“梭形”細胞是內(nèi)皮細胞的前體細胞(即其祖細胞)。
3.流式細胞儀檢測檢測細胞為第二代誘導(dǎo)組與非誘導(dǎo)組細胞。0.05%胰酶消化收集細胞;PBS洗兩遍;分裝入Eppendorf管,分別加熒光標記的鼠抗人CD34、CD45(DAKO公司),CD133(R&D SYSTEMS公司),VEGFR-2、PECAM-1(Sigma公司)抗體,一管加入熒光標記的非特異IgG作為同型對照,37℃孵育30min;PBS洗三遍;4%多聚甲醛固定,流式細胞儀檢測。
結(jié)果見表1和圖3,第2代非誘導(dǎo)組細胞有70%以上表達未分化細胞的標志CD34,誘導(dǎo)后祖細胞標志CD34消失,卻有67.41±13.35%細胞表達成熟內(nèi)皮細胞標志CD31。
表1其中的數(shù)值是陽性率(%)
**誘導(dǎo)組與非誘導(dǎo)組差異具有顯著性(P<0.01)◇誘導(dǎo)組較之非誘導(dǎo)組,差異沒有顯著性(P>0.01)結(jié)果表明本實驗誘導(dǎo)體系具有很高的誘導(dǎo)效率。梭形細胞表達CD34,而不表達CD45(目的是為了排除所得到的細胞是造血干細胞,因為造血干細胞CD34、CD45同時為陽性)。PECAM-1同圖2的免疫熒光一樣證明了在合適的培養(yǎng)條件下EPC轉(zhuǎn)化為成熟內(nèi)皮,陽性率高達67.41±13.35%。
圖3為統(tǒng)計分析,表明EPC同成熟內(nèi)皮細胞不一樣。盡管EPC是其前體細胞。表現(xiàn)在EPC表達CD34而不表達CD31,而成熟內(nèi)皮細胞卻相反。
4.內(nèi)皮細胞功能檢測用培養(yǎng)液稀釋DiI-ac-LDL(Biomedical Technologies Inc.公司)至10μg/ml,細胞換液;37℃培養(yǎng)箱孵育4h;PBS洗3次;熒光顯微鏡觀察。
結(jié)果見圖4,誘導(dǎo)祖細胞熒光顯微鏡觀察可見攝取DiI-ac-LDL后發(fā)出紅色熒光(×200);非誘導(dǎo)組未見陽性結(jié)果,(圖4)。
形態(tài)學(xué)改變和細胞免疫熒光證明了誘導(dǎo)后的細胞具有成熟內(nèi)皮細胞的表型,但不能說明這些細胞是否具有內(nèi)皮細胞的功能,攝取低密度脂蛋白(LDL)是內(nèi)皮細胞的功能之一,結(jié)果表明EPC轉(zhuǎn)化為成熟內(nèi)皮細胞后具有內(nèi)皮細胞的功能。
5.三維培養(yǎng)配制含0.09%甲基纖維素的半固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)的細胞以1×104個/mL接種在此培養(yǎng)基中,3天后倒置偏光顯微鏡觀察。
統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(X±S)表示,應(yīng)用配對t檢驗分析。
結(jié)果見圖5,第二代細胞接種在甲基纖維素的半固體培養(yǎng)基內(nèi)3天后形成“樹枝樣”分叉結(jié)構(gòu)(圖5)。
細胞平面培養(yǎng)難以說明內(nèi)皮細胞形成血管樣結(jié)構(gòu)的情況,設(shè)置三維培養(yǎng)模型,使細胞在立體情況下生長,模擬體內(nèi)血管生成,甲基纖維素培養(yǎng)基是一種半固體培養(yǎng)基,EPC能夠在其內(nèi)成“樹枝樣”生長,結(jié)果觀察到誘導(dǎo)組細胞在型,使細胞在立體情況下生長,模擬體內(nèi)血管生成,甲基纖維素培養(yǎng)基是一種半固體培養(yǎng)基,EPC能夠在其內(nèi)成“樹枝樣”生長,結(jié)果觀察到誘導(dǎo)組細胞在三維培養(yǎng)時形成“樹枝樣”分叉結(jié)構(gòu)。表明EPC轉(zhuǎn)化為成熟內(nèi)皮細胞后具有內(nèi)皮細胞的功能。
權(quán)利要求
1.一種內(nèi)皮祖細胞的分離方法,其特征在于,從脂肪組織中分選,步驟包括(1)將脂肪組織用膠原酶消化,從而解離脂肪組織中的細胞;(2)對步驟(1)中解離的細胞在800-1500g離心3-10分鐘,去除上層的脂肪獲得下層細胞;(3)將步驟(2)中獲得的下層細胞,以1×104-5×104個/cm2接種于纖維粘連蛋白(FN)包被的培養(yǎng)皿,在含1%-3%胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)3-8小時;(4)去除步驟(3)中培養(yǎng)物中游離的細胞,從而獲得通過纖維粘連蛋白固定于培養(yǎng)皿的固定細胞,即為內(nèi)皮祖細胞。
2.如權(quán)利要求1所述的分離方法,其特征在于,所述的脂肪組織是人脂肪組織。
3.如權(quán)利要求1所述的分離方法,其特征在于,還包括步驟(5)將獲得的內(nèi)皮祖細胞進行傳代,傳代如下進行0.05%胰酶消化,待細胞收縮變圓,終止消化;細胞收集離心;細胞計數(shù)按密度為2×104個/cm2接種。
4.如權(quán)利要求1或2所述的分離方法,其特征在于,用II型膠原酶消化。
5.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,還包括步驟檢測分離獲得的內(nèi)皮祖細胞上標志物CD34+。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法得到的內(nèi)皮祖細胞。
7.如權(quán)利要求6所述的內(nèi)皮祖細胞的用途,其特征在于,用于分化產(chǎn)生內(nèi)皮細胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法得到的內(nèi)皮祖細胞在組織工程中作為內(nèi)皮種子細胞的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法得到的內(nèi)皮祖細胞在制備內(nèi)皮移植物中的應(yīng)用。
10.纖維粘連蛋白(FN)在從脂肪組織中獲得內(nèi)皮祖細胞的應(yīng)用。
全文摘要
一種分離人脂肪組織中內(nèi)皮祖細胞的方法,涉及組織工程學(xué)中獲得種子細胞的方法。形態(tài)學(xué)改變和細胞免疫熒光證明了誘導(dǎo)后的細胞具有成熟內(nèi)皮細胞的表型,而且具有攝取低密度脂蛋白(LDL)的功能。流式細胞儀檢測結(jié)果表明本誘導(dǎo)體系具有很高的誘導(dǎo)效率。誘導(dǎo)組細胞在三維培養(yǎng)時形成“樹枝樣”分叉結(jié)構(gòu)。
文檔編號C12N5/08GK1932010SQ200510029628
公開日2007年3月21日 申請日期2005年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月14日
發(fā)明者崔磊, 曹誼林, 劉偉, 劉波 申請人:上海國睿生命科技有限公司