專利名稱：成骨細(xì)胞擴(kuò)增生物反應(yīng)器系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的系統(tǒng)，具體是一種成骨細(xì)胞擴(kuò)增生物反應(yīng)器系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
骨組織工程用于骨缺損等的修復(fù)重建，較傳統(tǒng)的方法有顯著的優(yōu)點(diǎn)(1)不受供體來源的限制；(2)避免了異體組織移植中免疫排斥反應(yīng)；(3)人工生物材料的形狀、大小可根據(jù)不同組織和實(shí)際需要而設(shè)計(jì)和塑形，不受供體形狀的限制；其最終目的在于提供一種來源廣泛、應(yīng)用簡便、療效確定的理想的生物活性骨組織。成骨細(xì)胞是形成組織工程化骨組織的基本要素之一，成骨細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)是組織工程學(xué)在骨缺損研究中的一個重要方面。自20世紀(jì)60年代，Van Wezel等嘗試采用微載體法懸浮培養(yǎng)動物貼壁細(xì)胞獲得成功以后，利用微載體在生物反應(yīng)器中擴(kuò)增動植物細(xì)胞就成為最常用、有效的方法。Freed等人在攪拌生物反應(yīng)器中培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，Katinger等首次應(yīng)用氣升式生物反應(yīng)器進(jìn)行動物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)，此外還有中空纖維管反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器、固定床反應(yīng)器、堆積床反應(yīng)器等，但是這些反應(yīng)器在培養(yǎng)的過程中目的細(xì)胞將不可避免地受到較大的剪切力影響，同時其營養(yǎng)物質(zhì)傳遞過程和模擬人體體內(nèi)環(huán)境等方面都不盡如人意。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，Gregory N.Bancroft等人在《TissueEngineering》2003，9(3)549-554上發(fā)表的“Design of a Flow PerfusionBioreactor System for Bone Tissue-Engineering Applications”(設(shè)計(jì)一種流動灌注式生物反應(yīng)器系統(tǒng)用于骨組織工程，《組織工程》)一文中，提出了體外擴(kuò)增成骨細(xì)胞的灌注生物反應(yīng)器系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要由儲液罐、蠕動泵、支架(scaffold)、灌注室和培養(yǎng)箱構(gòu)成，當(dāng)成骨細(xì)胞接種到支架上并貼壁后，開始由蠕動泵從儲液罐中不斷泵入培養(yǎng)基到灌注室中，使細(xì)胞在支架上擴(kuò)增。該裝置不能靈活調(diào)節(jié)灌注的方式(循環(huán)或單向)，不利于節(jié)約培養(yǎng)基，無法以最少量的培養(yǎng)基供給獲得最多的細(xì)胞量。此外，此裝置采用的是培養(yǎng)基從上往下的灌注法，而非采用逆向方式，不利于培養(yǎng)基的充分混合均勻，也不易在灌注最初充分排空氣泡，而且此裝置還不易于培養(yǎng)基取樣?？偠灾?，該系統(tǒng)在設(shè)計(jì)上存在局限性，裝置設(shè)計(jì)不經(jīng)濟(jì)，培養(yǎng)基流入方式設(shè)計(jì)欠合理，且無法在培養(yǎng)細(xì)胞的同時隨時取出培養(yǎng)基分析其成分，預(yù)測細(xì)胞的生長狀態(tài)。此系統(tǒng)對于擴(kuò)增成骨細(xì)胞來說并不簡便、高效和易行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種簡易、高效的成骨細(xì)胞擴(kuò)增生物反應(yīng)器系統(tǒng)，使其既能采用循環(huán)灌注方式，也能采用單向灌注方式，有利于培養(yǎng)基的充分利用；采用的培養(yǎng)基逆向流入方式使培養(yǎng)基混合更為均勻，且不易產(chǎn)生氣泡；同時便捷的取樣設(shè)計(jì)使對細(xì)胞生長狀態(tài)的監(jiān)控更為簡易。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括細(xì)胞培養(yǎng)箱、儲液罐、第一微孔濾膜過濾器、蠕動泵、第一四通管、密封蓋、灌注室、支架、第二四通管、第三四通管、第一止流夾、第二止流夾、第三止流夾、廢液罐、第二微孔濾膜過濾器，連接方式為儲液罐通過硅膠管與第一四通管相連，蠕動泵在連接儲液罐與第一四通管的硅膠管中間，灌注室通過硅膠管與第一四通管和第二四通管相連，密封蓋蓋在灌注室之上，支架置于灌注室中，儲液罐通過硅膠管與第三四通管相連，第一止流夾在連接儲液罐與第三四通管的硅膠管上，第三四通管通過硅膠管與廢液罐相連，第三止流夾在連接第三四通管與廢液罐的硅膠管上，第三四通管還連有一段硅膠管，此硅膠管上設(shè)有第二止流夾，儲液罐與第一微孔濾膜過濾器通過硅膠管相連，廢液罐與第二微孔濾膜過濾器通過硅膠管相連，以上部件均置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。
所述的儲液罐頂上設(shè)有通氣口、入液口、出液口。
所述的儲液罐，其出液口通過對CO2和O2高通透性的硅膠管與第一四通管相連，其入液口通過對CO2和O2高通透性的硅膠管與第三四通管相連。
所述的儲液罐，其通氣口與第一微孔濾膜過濾器通過硅膠管相連。
所述的廢液罐頂上設(shè)有通氣口和入液口。
所述的廢液罐，其入液口通過對CO2和O2高通透性的硅膠管與第三四通管相連。
所述的廢液罐，其通氣口與第二微孔濾膜過濾器通過硅膠管相連。
所述的第一微孔濾膜過濾器和第二微孔濾膜過濾器，為0.2μm微孔濾膜過濾器。
所述的灌注室，其入口和出口分別通過對CO2和O2高通透性的硅膠管與第一四通管和第二四通管相連。
第一微孔濾膜過濾器和第二微孔濾膜過濾器在確保儲液罐和廢液罐內(nèi)氣體壓力保持恒定的同時不會帶來外源污染；對CO2和O2高通透性的硅膠管協(xié)同第一微孔濾膜過濾器、第二微孔濾膜過濾器使得培養(yǎng)基能與外界進(jìn)行充分的氣體交換，確保培養(yǎng)基中各氣體成分的比例不會波動太大，給細(xì)胞提供一個適宜的5％CO2和95％空氣的生長環(huán)境；第四三通管連接有硅膠管，使我們能在需要的時候隨時取出培養(yǎng)基進(jìn)行分析；第四三通管分別與儲液罐的入液口和廢液罐的入液口相連，在培養(yǎng)基能維持細(xì)胞生長的情況下采用循環(huán)灌注方式，要全部換液時則采用單向灌注方式，并更換儲液罐就能實(shí)現(xiàn)；培養(yǎng)基流入灌注室中時采用逆向方式，這是一種更溫和的流入方式，且有利于營養(yǎng)成分的擴(kuò)散，并能防止氣泡的生成。
本發(fā)明工作時，在無菌環(huán)境下把接種有成骨細(xì)胞的支架放置入灌注室，擰緊密封蓋，關(guān)閉第二止流夾和第三止流夾，開啟第一止流夾，然后開啟蠕動泵以適宜的、極緩慢的速度將儲液罐中的培養(yǎng)基從灌注室的入口泵入灌注室，從灌注室的出口流出后經(jīng)對CO2和O2高通透性的硅膠管返回儲液罐；定期檢測培養(yǎng)基成分時，可暫時關(guān)閉第一止流夾和第三止流夾，開啟第二止流夾，收集流出的培養(yǎng)基，進(jìn)行生化分析；當(dāng)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基成分不適合細(xì)胞生長時，可關(guān)閉第一止流夾和第二止流夾，開啟第三止流夾，使培養(yǎng)基全部流入廢液罐中，同時快速更換載有新鮮培養(yǎng)基的儲液罐，當(dāng)舊培養(yǎng)基排完后關(guān)閉第二止流夾和第三止流夾，開啟第一止流夾，重新進(jìn)行循環(huán)式灌注，直至細(xì)胞擴(kuò)增完畢。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是為成骨細(xì)胞的貼壁生長提供了一種與體內(nèi)環(huán)境相似的三維生長環(huán)境，使其能穩(wěn)定高效的擴(kuò)增，此裝置簡單且易于構(gòu)件。此裝置采用對CO2和O2高通透性的硅膠管使得培養(yǎng)基中氣體能與細(xì)胞培養(yǎng)箱中的氣體進(jìn)行實(shí)時交換，保持恒定的氣體環(huán)境。此裝置中培養(yǎng)基流入灌注室時采用逆向方式，這是一種更溫和的流入方式，且有利于營養(yǎng)成分的擴(kuò)散，并防止了氣泡的生成。使用多個四通管，使整個反應(yīng)器中管路的構(gòu)件更簡便易行，能隨時取樣，隨時改變培養(yǎng)基的灌注方式，以適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)的需要。這些設(shè)計(jì)都為成骨細(xì)胞的擴(kuò)增提供了最為有利的條件。


圖1為本發(fā)明結(jié)構(gòu)示意圖具體實(shí)施方式
如圖1所示，本發(fā)明包括細(xì)胞培養(yǎng)箱1、儲液罐2、第一微孔濾膜過濾器3、蠕動泵7、第一四通管8、密封蓋9、灌注室12、支架13、第二四通管14、第三四通管15、第一止流夾16、第二止流夾17、第三止流夾18、廢液罐19、第二微孔濾膜過濾器22。
儲液罐2通過硅膠管與第一四通管8相連，蠕動泵7在連接儲液罐2與第一四通管8的硅膠管中間，灌注室12通過硅膠管與第一四通管8和第二四通管14相連，密封蓋9蓋在灌注室12之上，支架13置于灌注室12中，儲液罐2通過硅膠管與第三四通管15相連，第一止流夾16在連接儲液罐2與第三四通管15的硅膠管上，第三四通管15通過硅膠管與廢液罐19相連，第三止流夾18在連接第三四通管15與廢液罐19的硅膠管上，第三四通管15還連有一段硅膠管，此硅膠管上設(shè)有第二止流夾17，儲液罐2與第一微孔濾膜過濾器3通過硅膠管相連，廢液罐19與第二微孔濾膜過濾器22通過硅膠管相連，以上部件均置于細(xì)胞培養(yǎng)箱1中。
所述的儲液罐2頂上設(shè)有通氣口4、入液口6、出液口5。
所述的儲液罐2，其出液口5通過對CO2和O2高通透性的硅膠管與第一四通管8相連，其入液口6通過對CO2和O2高通透性的硅膠管與第三四通管15相連。
所述的儲液罐2，其通氣口4與第一微孔濾膜過濾器3通過硅膠管相連。
所述的廢液罐19頂上設(shè)有通氣口21和入液口20。
所述的廢液罐19，其入液口20通過對CO2和O2高通透性的硅膠管與第三四通管15相連。
所述的廢液罐19，其通氣口21與第二微孔濾膜過濾器22通過硅膠管相連。
所述的第一微孔濾膜過濾器3和第二微孔濾膜過濾器22，為0.2μm微孔濾膜過濾器。
所述的灌注室12，其入口10和出口11分別通過對CO2和O2高通透性的硅膠管與第一四通管8和第二四通管14相連。
本發(fā)明固定安裝好后，在無菌環(huán)境下把接種有成骨細(xì)胞的支架13放置入灌注室12，擰緊密封蓋9，關(guān)閉第二止流夾17和第三止流夾18，開啟第一止流夾16，然后開啟蠕動泵7以適宜的、極緩慢的速度將儲液罐2中的培養(yǎng)基從灌注室12的入口10泵入灌注室12，從灌注室12的出口11流出后經(jīng)對CO2和O2高通透性的硅膠管返回儲液罐2；定期檢測培養(yǎng)基成分時，可暫時關(guān)閉第一止流夾16和第三止流夾18，開啟第二止流夾17，收集流出的培養(yǎng)基，進(jìn)行生化分析；當(dāng)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基成分不適合細(xì)胞生長時，可關(guān)閉第一止流夾16和第二止流夾17，開啟第三止流夾18，使培養(yǎng)基全部流入廢液罐19中，同時快速更換載有新鮮培養(yǎng)基的儲液罐2，當(dāng)舊培養(yǎng)基排完后關(guān)閉第二止流夾17和第三止流夾18，開啟第一止流夾16，重新進(jìn)行循環(huán)式灌注，直至細(xì)胞擴(kuò)增完畢。
權(quán)利要求
1.一種成骨細(xì)胞擴(kuò)增生物反應(yīng)器系統(tǒng)，包括細(xì)胞培養(yǎng)箱(1)、儲液罐(2)、第一微孔濾膜過濾器(3)、蠕動泵(7)、密封蓋(9)、灌注室(12)、支架(13)和第二微孔濾膜過濾器(22)，其特征在于，還包括第一四通管(8)、第二四通管(14)、第三四通管(15)、第一止流夾(16)、第二止流夾(17)、第三止流夾(18)和廢液罐(19)，儲液罐(2)通過硅膠管與第一四通管(8)相連，蠕動泵(7)在連接儲液罐(2)與第一四通管(8)的硅膠管中間，灌注室(12)通過硅膠管與第一四通管(8)和第二四通管(14)相連，密封蓋(9)蓋在灌注室(12)之上，支架(13)置于灌注室(12)中，儲液罐(2)通過硅膠管與第三四通管(15)相連，第一止流夾(16)在連接儲液罐(2)與第三四通管(15)的硅膠管上，第三四通管(15)通過硅膠管與廢液罐(19)相連，第三止流夾(18)在連接第三四通管(15)與廢液罐(19)的硅膠管上，第三四通管(15)還連有一段硅膠管，此硅膠管上設(shè)有第二止流夾(17)，儲液罐(2)與第一微孔濾膜過濾器(3)通過硅膠管相連，廢液罐(19)與第二微孔濾膜過濾器(22)通過硅膠管相連，以上部件均置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(1)中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成骨細(xì)胞擴(kuò)增生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征是，所述的儲液罐(2)頂上設(shè)有通氣口(4)、入液口(6)、出液口(5)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的成骨細(xì)胞擴(kuò)增生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征是，所述的儲液罐(2)，其出液口(5)通過對CO2和O2高通透性的硅膠管與第一四通管(8)相連，其入液口(6)通過對CO2和O2高通透性的硅膠管與第三四通管(15)相連。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的成骨細(xì)胞擴(kuò)增生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征是，所述的儲液罐(2)，其通氣口(4)與第一微孔濾膜過濾器(3)通過硅膠管相連。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成骨細(xì)胞擴(kuò)增生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征是，所述的廢液罐(19)頂上設(shè)有通氣口(21)和入液口(20)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或者5所述的成骨細(xì)胞擴(kuò)增生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征是，所述的廢液罐(19)，其入液口(20)通過對CO2和O2高通透性的硅膠管與第三四通管(15)相連。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或者5所述的成骨細(xì)胞擴(kuò)增生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征是，所述的廢液罐(19)，其通氣口(21)與第二微孔濾膜過濾器(22)通過硅膠管相連。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成骨細(xì)胞擴(kuò)增生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征是，所述的第一微孔濾膜過濾器(3)和第二微孔濾膜過濾器(22)，為0.2μm微孔濾膜過濾器。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成骨細(xì)胞擴(kuò)增生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征是，所述的灌注室(12)，其入口(10)和出口(11)分別通過對CO2和O2高通透性的硅膠管與第一四通管(8)和第二四通管(14)相連。
全文摘要
一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的成骨細(xì)胞擴(kuò)增生物反應(yīng)器系統(tǒng)，儲液罐通過硅膠管與第一四通管相連，蠕動泵在連接儲液罐與第一四通管的硅膠管中間，灌注室通過硅膠管與第一四通管和第二四通管相連，密封蓋蓋在灌注室之上，支架置于灌注室中，儲液罐通過硅膠管與第三四通管相連，第一止流夾在連接儲液罐與第三四通管的硅膠管上，第三四通管通過硅膠管與廢液罐相連，第三止流夾在連接第三四通管與廢液罐的硅膠管上，第三四通管還連有一段硅膠管，此硅膠管上設(shè)有第二止流夾，儲液罐與第一微孔濾膜過濾器通過硅膠管相連，廢液罐與第二微孔濾膜過濾器通過硅膠管相連，以上部件均置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。本發(fā)明簡便易行，能隨時取樣，隨時改變培養(yǎng)基的灌注方式。
文檔編號C12M3/00GK1743450SQ20051002965
公開日2006年3月8日 申請日期2005年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月15日
發(fā)明者董良, 齊瀚實(shí), 陳彥田, 沈陽, 孫海英 申請人:上海交通大學(xué)