一種層層自組裝的小口徑組織工程血管及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)，具體是關(guān)于一種納米顆粒修飾的層層自組裝生物人工血管及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近幾年，心血管疾病的發(fā)病率以及死亡率逐年升高，每年有大量的病人需要進(jìn)行旁路移植手術(shù)，因此臨床上對(duì)于直徑小于6mm的組織工程血管需求量很高。但是小口徑組織工程血管常常由于血栓形成以及內(nèi)膜增生而導(dǎo)致移植手術(shù)失敗。大量的研宄表明內(nèi)皮細(xì)胞具有抗血栓、抑制血小板的聚集和平滑肌細(xì)胞病理性增殖的功能，因此組織工程血管的早期快速內(nèi)皮化是維持小口徑組織工程血管移植后通暢的一個(gè)十分重要的因素。內(nèi)皮祖細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在缺血或者血管受損的情況下，可以從骨髓動(dòng)員并歸巢到相應(yīng)部位，促進(jìn)血管內(nèi)皮的修復(fù)以及血管生成。因此，在組織工程血管的構(gòu)建中選擇合適的分子促進(jìn)干細(xì)胞的動(dòng)員，并能選擇性的捕獲血液中的內(nèi)皮祖細(xì)胞是提高組織工程血管通暢率的一個(gè)重要研宄靶點(diǎn)。
[0003]科學(xué)家通過在組織工程血管的內(nèi)表面涂層抗體或者蛋白特異性捕獲血液循環(huán)中的內(nèi)皮祖細(xì)胞，在早期取得了較好的通暢效果。然而在移植后期出現(xiàn)了不同程度的內(nèi)膜增生，甚至堵塞。宄其原因，主要是因?yàn)榻M織工程血管內(nèi)表面涂層的藥物緩釋時(shí)間較短，不能長時(shí)程的發(fā)揮功能。在移植后期藥物釋放完畢后，組織工程血管的局部微環(huán)境不適合歸巢的內(nèi)皮祖細(xì)胞的生存，但是可以刺激平滑肌的病理性增生。組織工程血管移植后都面臨著高剪切力和高沖刷力的力學(xué)刺激，同時(shí)能快速的將物質(zhì)推送到全身各個(gè)部位。因此對(duì)控釋材料的安全性和穩(wěn)定性具有特別高的要求。腺苷是一種內(nèi)源性核苷，具有細(xì)胞保護(hù)和促進(jìn)血管生成的作用。我們的研宄發(fā)現(xiàn)腺苷可以促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員歸巢、促內(nèi)皮祖細(xì)胞旁分泌和抑制平滑肌的病理性增殖等。然而目前還沒有一種既安全又能穩(wěn)定控制腺苷的釋放，還能適合血液循環(huán)系統(tǒng)這個(gè)特殊環(huán)境應(yīng)用的控釋體系。
[0004]環(huán)糊精的研宄經(jīng)歷了一百多年的時(shí)間，現(xiàn)已廣泛的用于醫(yī)藥和生物技術(shù)等行業(yè)。β -環(huán)糊精分子具有略呈錐形的中空?qǐng)A筒立體環(huán)狀結(jié)構(gòu)，外側(cè)由羥基構(gòu)成，具有親水性，而空腔內(nèi)由于受到C-H鍵的屏蔽作用形成了疏水區(qū)，可以包裹各種化合物，具有很好的藥物控釋和生物可降解性等特點(diǎn)。殼聚糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，可以通過氨基和羥基與腺苷或受體活化藥物結(jié)合，目前也已經(jīng)作為一種材料應(yīng)用于藥物制劑。研宄表明環(huán)糊精和殼聚糖能夠形成一個(gè)穩(wěn)定的結(jié)合物，相對(duì)于單獨(dú)的環(huán)糊精或者殼聚糖能更長時(shí)程的控制藥物釋放。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明主要是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能長時(shí)程控制藥物釋放，在早期在體動(dòng)員和捕獲內(nèi)皮祖細(xì)胞的組織工程血管，促進(jìn)血管快速內(nèi)皮化，移植后期抑制內(nèi)膜增生和血管狹窄，主要用于血管的取代治療和冠狀動(dòng)脈搭橋。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的而采用的技術(shù)方案，即構(gòu)建一種能長時(shí)程控釋又能促進(jìn)早期快速內(nèi)皮化的組織工程血管，其采用如下方法構(gòu)建:
(I)控制藥物釋放的納米緩釋顆粒的制備:篩選具有內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員捕獲功能和微環(huán)境優(yōu)化功能的藥物，如腺苷及其Al，A2b, A2a, A3四個(gè)受體的激動(dòng)劑等，篩選以及修飾合適的化合物，檢測其對(duì)人體的安全性和不良反應(yīng)。具體為??每80-100mg的β -環(huán)糊精與20-30mg的腺苷或腺苷A2a受體激動(dòng)劑或腺苷Al受體激動(dòng)劑或腺苷A2b受體激動(dòng)劑或腺苷A3受體激動(dòng)劑溶于20-30ml的去離子水中，獲得溶液I ;每60_80mg的殼聚糖溶于1%的冰醋酸溶液，獲得溶液II ;按照溶液II與溶液I 3-5:1的比例混合，離心分離，獲得納米緩釋顆粒。
[0006](2)組織工程血管基質(zhì)的構(gòu)建:用異種或同種血管或皮膚組織提取膠原，然后去除膠原中的抗原，獲得生物相容性良好的膠原；保留膠原的天然網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
[0007](3)血管的編織:將所述膠原和彈性材料按重量百分比60?80%:20?40%用電紡絲紡織方法編織血管支架；或?qū)⑺瞿z原、殼聚糖、粘連蛋白及彈性材料按重量百分比50?70%:12?18%:1?5%:15?35%用電紡絲紡織方法編織血管支架；或采用人工合成材料編織血管支架。
[0008](4)層層自組裝方式構(gòu)建組織工程血管:將所述納米緩釋顆粒與所述血管支架孵育24-48小時(shí)，充分洗滌后，繼續(xù)用納米緩釋顆粒孵育24-48小時(shí)，PBS洗三次；然后用腺苷或腺苷A2a受體激動(dòng)劑直接孵育24小時(shí)，PBS洗三次；再用EDC或者SPDP交聯(lián)24小時(shí)；獲得層層自組裝的工程血管。
[0009]本發(fā)明獲取的人源性生物膠原已去除抗原性，可控降解，可原位成型。具有良好的生物相容性，較好的力學(xué)性能。膠原是血管細(xì)胞外基質(zhì)主要成分，同時(shí)膠原的三維空間結(jié)構(gòu)具有較好的強(qiáng)度，是組成血管的重要成分。用于構(gòu)建生物人工血管的膠原，在保持三螺旋結(jié)構(gòu)的同時(shí)去除其抗原點(diǎn)一尾肽。這種材料為天然生物材料，來源廣泛，無毒性，降解產(chǎn)物可被機(jī)體吸收，不對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害，制作簡便，易于塑形，并在功能適應(yīng)性、組織相容性、理化性能、生物降解性、造價(jià)等方面優(yōu)于人工合成材料。
[0010]生物血管支架本身具有良好的細(xì)胞誘導(dǎo)性，進(jìn)一步復(fù)合表面修飾物質(zhì)后，為種子細(xì)胞粘附、增殖、分化、迀移及發(fā)揮抗凝血等功能提供較好的微環(huán)境。本發(fā)明中血管腔表面修飾有以下優(yōu)點(diǎn):實(shí)驗(yàn)表明一方面在移植早期表征的分子可以釋放入血，進(jìn)入骨髓促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員，同時(shí)表征在血管表面的分子可以通過受體-配體結(jié)合的方式捕獲循環(huán)中增多的內(nèi)皮祖細(xì)胞；另一方面血管表征的納米材料可以長時(shí)程的控釋分子的釋放，促進(jìn)局部微環(huán)境的優(yōu)化，達(dá)到長時(shí)程通暢的功能。這種方法在早期促進(jìn)快速內(nèi)皮化的同時(shí)，同時(shí)還能優(yōu)化局部的微環(huán)境。尚未有這些設(shè)想或?qū)嶒?yàn)結(jié)果的報(bào)道。
【具體實(shí)施方式】
[0011 ] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步說明。
[0012]1、納米緩釋顆粒的制備:80-100mg的β -環(huán)糊精與20_30mg的腺苷等藥物溶于20-30ml的去離子水中，室溫?cái)嚢?4-48h。60_80mg的殼聚糖溶于1%的冰醋酸溶液，攪拌均勻后，攪拌均勻后，緩慢加入1_3%ΤΡΡ溶液l_2ml，繼續(xù)室溫?cái)嚢?_8個(gè)小時(shí)。按照殼聚糖溶液與β -環(huán)糊精與腺苷溶液3-5:1的比例混合，繼續(xù)攪拌2-4小時(shí)后，20000g/min，4度下離心分離，蒸餾水洗三遍后，冷凍干燥。掃描電鏡檢測納米緩釋顆粒的形態(tài)，紅外波譜掃描檢測其包裹情況，結(jié)果可見納米顆粒包含其中一個(gè)波峰與樣品掃描波峰一致，說明納米顆粒包含了相關(guān)樣品，而對(duì)照組不含相應(yīng)波峰。
[0013]2、組織工程血管基質(zhì)的構(gòu)建:在無菌條件下，取動(dòng)物頸總動(dòng)脈，用生理鹽水將血液沖洗干凈。在37°0，5%0)2條件下用0.15%的胰酶消化40-180分鐘。用RNA酶，DNA酶、脂肪酶去除核酸和脂肪，得到去除細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)而保留血管膠原纖維和彈力纖維的血管基質(zhì)材料。將8-12 mg/ml的膠原溶液孵育已經(jīng)制備好的血管基質(zhì)材料24小時(shí)，之后用5-20 mM京尼平或EDC對(duì)孵育了膠原的血管基質(zhì)材料進(jìn)行交聯(lián)，時(shí)間為24-48小時(shí)，然后用PBS清洗3-5次。用電紡絲紡織方法將獲得的膠原和彈性材料復(fù)合，按重量