一種組織工程表皮模型的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種組織工程表皮模型的構(gòu)建方法。本發(fā)明按照下述步驟進(jìn)行：A.選用熱塑性無(wú)紡布，通過(guò)熱壓方法將其制備成圓盤(pán)狀支架；B.以桑蠶絲為原料，通過(guò)脫膠、溶解、透析和濃縮制備絲素蛋白溶液；C.用制備的絲素蛋白溶液對(duì)圓盤(pán)狀無(wú)紡布支架進(jìn)行浸潤(rùn)，絲素溶液濃度為2~10%，然后進(jìn)行真空干燥和無(wú)水乙醇后處理；D.接種人表皮細(xì)胞株Hacat，Hacat細(xì)胞的接種密度為104~105/ml，氣液面培養(yǎng)，待增殖形成片層結(jié)構(gòu)即構(gòu)建成組織工程表皮模型。本發(fā)明解決現(xiàn)有組織工程表皮模型在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中支架易發(fā)生收縮的缺點(diǎn)，通過(guò)將無(wú)紡布熱壓，使無(wú)紡布邊緣熔融粘結(jié)，避免了構(gòu)建的組織工程皮膚模型在檢測(cè)中的側(cè)面滲漏問(wèn)題。
【專利說(shuō)明】一種組織工程表皮模型的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程中的組織工程領(lǐng)域，更具體的說(shuō)，是涉及一種組織工程表皮模型的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]國(guó)內(nèi)外替代動(dòng)物做皮膚刺激實(shí)驗(yàn)的方法為采用組織工程皮膚模型，當(dāng)前歐盟推薦的皮膚刺激性替代實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪敲绹?guó)出產(chǎn)的EpiDermTM和法國(guó)生產(chǎn)的EpiSkin模型。模型大多采用膠原凝膠作為組織工程皮膚的支架，其不足主要表現(xiàn)在將細(xì)胞接種到凝膠表面后，細(xì)胞/膠原凝膠復(fù)合物在培養(yǎng)過(guò)程中易收縮，細(xì)胞密度發(fā)生較大變化，所構(gòu)建的組織工程表皮面積也發(fā)生變化，這些不足導(dǎo)致了應(yīng)用此類組織工程表皮作檢測(cè)時(shí)存在較大的誤差。此外，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)形成皮膚樣結(jié)構(gòu)后，模型部分收縮，使其邊緣和測(cè)試容器間產(chǎn)生縫隙，當(dāng)進(jìn)行化學(xué)品測(cè)試時(shí)，化學(xué)品溶液易發(fā)生側(cè)面滲漏，也使實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生較大誤差。所以本發(fā)明通過(guò)支架材料的改進(jìn)解決上述兩個(gè)問(wèn)題:支架收縮和化學(xué)品溶液側(cè)面滲漏問(wèn)題。
[0003]絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然高分子纖維蛋白，含量占蠶絲的70%-80%，由乙氨酸、丙氨酸、絲氨酸等18種氨基酸 所組成。絲素蛋白具有良好的生物相容性，對(duì)機(jī)體無(wú)毒性，無(wú)致敏和刺激作用，又可部分生物降解，其降解產(chǎn)物本身不僅對(duì)組織無(wú)毒副作用，還對(duì)皮膚等有營(yíng)養(yǎng)與修復(fù)的作用；具有良好的柔韌性和抗拉伸強(qiáng)度、透氣透濕性、緩釋性等，而且經(jīng)過(guò)不同處理可以得到不同的形態(tài)，如纖維、溶液、粉、膜、凝膠和海綿網(wǎng)狀等。絲素蛋白因其優(yōu)良的性能在組織工程上的應(yīng)用越來(lái)越受到人們的關(guān)注。
[0004]絲素蛋白生物相容性良好，很多實(shí)驗(yàn)研究表明絲素蛋白可以用來(lái)培養(yǎng)多種細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、表皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞等，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。眾多實(shí)驗(yàn)證明絲素在體外支持干細(xì)胞的粘附、增殖和分化，體內(nèi)促進(jìn)組織的修復(fù)。因此，絲素蛋白有望在組織工程諸多器官的體外構(gòu)建中用做細(xì)胞支架材料，如組織工程化皮膚、軟骨、肌腱、血管等。Min等采用靜電紡技術(shù)制成的絲素納米纖維多孔支架，平均孔徑為80nm,在此材料上培養(yǎng)人體角質(zhì)細(xì)胞(Human keratinocytes)和成纖維細(xì)胞(Fibroblasts)效果良好。電鏡照片顯示，培養(yǎng)3 d后角質(zhì)細(xì)胞在絲素納米纖維材料表面黏附生長(zhǎng)，并沿孔擴(kuò)散到內(nèi)層，且細(xì)胞之間以及細(xì)胞與周圍纖維之間作用良好；7天后，細(xì)胞沿纖維方向生長(zhǎng)并形成三維網(wǎng)絡(luò)狀細(xì)胞層結(jié)構(gòu)。絲素蛋白對(duì)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，由絲素蛋白制成的絲素膜是一種良好的創(chuàng)面覆蓋物。呂國(guó)忠等觀察到成纖維細(xì)胞能夠在絲素蛋白納米纖維中不斷伸展、黏附、擴(kuò)增，并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，14天后成纖維細(xì)胞與支架及細(xì)胞所分泌的基質(zhì)融為一體，整個(gè)支架表面均被成纖維細(xì)胞及基質(zhì)成分所覆蓋，形成活性支架。
[0005]以上充分說(shuō)明了絲素蛋白具有良好的細(xì)胞相容性，但單純的絲素蛋白存在一定的缺陷，例如純絲素材料在含水量極低時(shí)容易破碎，在低濕環(huán)境應(yīng)用時(shí)強(qiáng)度不夠，結(jié)晶區(qū)偏少也會(huì)導(dǎo)致絲素材料在溶液中的溶失率較高等；采用靜電紡制備納米絲素膜，環(huán)境要求苛刻、耗時(shí)長(zhǎng)，如果用于規(guī)?；a(chǎn)還存在一定困難，以上所述使絲素在某些應(yīng)用中受到限制，因此通過(guò)復(fù)合材料性能互補(bǔ)的原理有望制備綜合性能良好的組織工程皮膚支架。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決現(xiàn)有皮膚模型在培養(yǎng)過(guò)程中易發(fā)生收縮和邊緣易發(fā)生檢測(cè)液滲漏等缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種組織工程表皮模型的構(gòu)建方法。
[0007]本發(fā)明一種組織工程表皮模型的構(gòu)建方法，按照下述步驟進(jìn)行:
A.選用熱塑性無(wú)紡布，通過(guò)熱壓方法將其制備成圓盤(pán)狀支架；
B.以桑蠶絲為原料，通過(guò)脫膠、溶解、透析和濃縮制備絲素蛋白溶液；
C.用制備的絲素蛋白溶液對(duì)圓盤(pán)狀無(wú)紡布支架進(jìn)行浸潤(rùn)，絲素溶液濃度為2-10%，然后進(jìn)行真空干燥和無(wú)水乙醇后處理；
D.接種人表皮細(xì)胞株Hacat，Hacat細(xì)胞的接種密度為10，105/ml，氣液面培養(yǎng)，待增殖形成片層結(jié)構(gòu)即構(gòu)建成組織工程表皮模型。
[0008]選用的無(wú)紡布的原料為聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺中的一種或幾種。將無(wú)紡布熱壓成圓盤(pán)狀支架的溫度為130-200°C，圓盤(pán)直徑為5mm-30mm，圓盤(pán)邊緣高度為
0.5mm -3mm η
[0009]絲素脫膠采用以下任一方法進(jìn)行:浸泡于Na2CO3的水溶液中，溫度為60-100°C;或浸泡于中性阜的水溶液中，溫度為90-100°C ;或浸泡于去離子水中在溫度為110-130°C,壓力為0.05-0.18MPa條件下脫膠。
[0010]絲素溶解的方法采用下述任一方`:溶解于CaCl2、乙醇、水的三元溶液中，CaCl2、乙醇、水的摩爾比為1:2:8，溫度為50-100°C，溶解時(shí)間為2-5h ;或溶解于CaCl2的水溶液中，CaCl2的質(zhì)量百分比濃度為30-50%，溶解溫度90-100°C，溶解時(shí)間5_20min ;溶解于9.3mol/L的LiBr溶液中，溶解溫度50_70°C，溶解時(shí)間30_60min。
[0011]絲素濃縮采用以下任一方法進(jìn)行:透析袋透析法；或加熱揮發(fā)法；或中空纖維超濾法。
[0012]本發(fā)明解決現(xiàn)有組織工程表皮模型在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中支架易發(fā)生收縮的缺點(diǎn)，本發(fā)明將無(wú)紡布熱壓成圓盤(pán)狀支架，再用絲素溶液進(jìn)行修飾，將無(wú)紡布尺寸穩(wěn)定性和絲素良好生物相容性很好地結(jié)合起來(lái)；通過(guò)將無(wú)紡布熱壓，使無(wú)紡布邊緣熔融粘結(jié)，避免了構(gòu)建的組織工程皮膚模型在檢測(cè)中的側(cè)面滲漏問(wèn)題。將人表皮細(xì)胞株Hcat在支架上進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，結(jié)果表明細(xì)胞在支架上能很好的粘附、增殖，形成片層結(jié)構(gòu)，構(gòu)建的組織工程化表皮模型是一種理想的模型，可用于化學(xué)品檢測(cè)以及皮膚光老化研究等方面。
[0013]本發(fā)明提出采用絲素蛋白修飾無(wú)紡布作為組織工程皮膚的支架材料:無(wú)紡布的孔徑可根據(jù)需要定制，材料便于剪裁；有較好的力學(xué)性能，能確保與細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞/支架復(fù)合物不發(fā)生變形；絲素對(duì)無(wú)紡布的修飾易于實(shí)現(xiàn)，既保證了整體支架材料的力學(xué)強(qiáng)度，又充分利用了絲素蛋白的良好細(xì)胞相容性的特點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1是圓盤(pán)狀無(wú)紡布熱壓示意圖，
圖2是沒(méi)接種細(xì)胞的空白支架的電鏡圖，
圖3是接種人表皮細(xì)胞株Hacat的支架的電鏡圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0016]本發(fā)明中無(wú)紡布的原料是聚酯、聚丙烯、聚乙烯、聚酰胺中的一種或幾種。
[0017]本發(fā)明中無(wú)紡布圓盤(pán)支架的熱壓成型溫度為130-200°C，圖1是圓盤(pán)狀無(wú)紡布熱壓示意圖。
[0018]本發(fā)明中絲素蛋白是以桑蠶絲為原料，經(jīng)過(guò)脫膠、溶解、透析、濃縮制備而成，脫膠的方法為通過(guò)將桑蠶絲浸入Na2CO3水溶液中進(jìn)行，Na2CO3水溶液的濃度為0.1-1%之間，溫度為60-100°C，溶解在乙醇、水、CaCl2的三元溶液中，溶解溫度為50-100°C，溶解時(shí)間為
2-5h，透析在流水沖洗下在透析袋中進(jìn)行，濃縮采用在PEG水溶液中進(jìn)行。
[0019]本發(fā)明用于修飾無(wú)紡布的絲素溶液濃度為2-10%。
[0020]本發(fā)明人表皮細(xì)胞株Hacat的接種密度為IO4-105/ml。
[0021]將Hacat細(xì)胞在所述的支架上進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明所構(gòu)建的組織工程化表皮在培養(yǎng)過(guò)程中不發(fā)生收縮、檢測(cè)液在邊緣不發(fā)生滲漏，是一種理想的組織工程化表皮模型。
[0022]實(shí)施例一
聚丙烯熔噴無(wú)紡布，140°C熱壓成圓盤(pán)狀。
[0023]市售桑蠶絲，浸入60°C Na2CO3水溶液中進(jìn)行脫膠，Na2CO3水溶液的濃度為0.2%，每次30min，共3次，水洗后70°C干燥。溶解于6(TC的CaC12、乙醇、水的三元溶液中(摩爾比1:2:8)，溶解時(shí)間為2h，裝入透析袋，在流水沖洗下透析。得到濃度為3%的絲素蛋白溶液。將圓盤(pán)狀無(wú)紡布浸泡在絲素溶液中，取出后真空干燥，無(wú)水乙醇后處理，以104/ml接種Hacat細(xì)胞，氣液面培養(yǎng)，構(gòu)建組織工程表皮模型。圖2是沒(méi)接種細(xì)胞的空白支架的電鏡圖，圖3是接種人表皮細(xì)胞株Hacat的支架的電鏡圖，結(jié)果表明細(xì)胞在支架上能很好的粘附、增殖，形成片層結(jié)構(gòu)，構(gòu)建的組織工程化表皮模型是一種理想的模型，可用于化學(xué)品檢測(cè)以及皮膚光老化研究等方面。
[0024]實(shí)施例二
聚乙烯、聚丙烯雙組份熔噴無(wú)紡布，130 V熱壓成圓盤(pán)狀。
[0025]市售桑蠶絲,浸入90_100°C的中性阜水溶液中進(jìn)行脫膠,水洗后70°C干燥。溶解于95°C的CaCl2A溶液中，溶解時(shí)間為lOmin，裝入透析袋，在流水沖洗下透析。得到濃度為6%的絲素蛋白溶液。將圓盤(pán)狀無(wú)紡布浸泡在絲素溶液中，取出后真空干燥，無(wú)水乙醇后處理，以104/ml接種Hacat細(xì)胞，氣液面培養(yǎng)，構(gòu)建組織工程表皮模型。
[0026]實(shí)施例三
聚酰胺紡粘無(wú)紡布，200°C熱壓成圓盤(pán)狀。
[0027]市售桑蠶絲，浸入去離子水中高溫高壓進(jìn)行脫膠，水洗后70°C干燥。溶解于70°C的CaCl2、乙醇、水的三元溶液中(摩爾比1:2:8 )，溶解時(shí)間為4h，裝入透析袋，在流水沖洗下透析。得到濃度為9%的絲素蛋白溶液。將圓盤(pán)狀無(wú)紡布浸泡在絲素溶液中，取出后真空干燥，無(wú)水乙醇后處理，以105/ml接種Hacat細(xì)胞，氣液面培養(yǎng)，構(gòu)建組織工程表皮模型。
[0028]實(shí)施例四
聚酯、聚丙烯復(fù)合無(wú)紡布，140°C熱壓成圓盤(pán)狀。
[0029]市售桑蠶絲，浸入90°C Na2CO3水溶液中進(jìn)行脫膠，每次30min，共3次，水洗后70°C干燥。溶解于60°C的LiBr溶液中，溶解時(shí)間為4h，加熱揮發(fā)法濃縮。得到濃度為6%的絲素蛋白溶液。將圓盤(pán)狀無(wú)紡布浸泡在絲素溶液中，取出后真空干燥，無(wú)水乙醇后處理，以1O5/ml接種Hacat細(xì)胞，氣液面培養(yǎng)，構(gòu)建組織工程表皮模型。
[0030]實(shí)施例五
聚酯、聚丙烯復(fù)合無(wú)紡布，140°C熱壓成圓盤(pán)狀。
[0031]市售桑蠶絲,浸入100°C Na2CO3水溶液中進(jìn)行脫膠,每次30min,共3次,水洗后70°C干燥。溶解于70°C的乙醇、水、CaCl2的三元溶液中，溶解時(shí)間為5h，中空纖維超濾法濃縮。得到濃度為9%的絲素蛋白溶液。將圓盤(pán)狀無(wú)紡布浸泡在絲素溶液中，取出后真空干燥，無(wú)水乙醇后處理，以105/ml接種Hacat細(xì)胞，氣液面培養(yǎng)，構(gòu)建組織工程表皮模型。
[0032]盡管結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了上述描述，但是本發(fā)明并不局限于上述的【具體實(shí)施方式】，上述的【具體實(shí)施方式】?jī)H僅是示意性的，而不是限制性的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的啟示下，在不脫離本發(fā)明的宗旨下做出的許多變形，均屬于本發(fā)明的保護(hù)之列。
【權(quán)利要求】
1.一種組織工程表皮模型的構(gòu)建方法，其特征是，按照下述步驟進(jìn)行: 選用熱塑性無(wú)紡布，通過(guò)熱壓方法將其制備成圓盤(pán)狀支架； 以桑蠶絲為原料，通過(guò)脫膠、溶解、透析和濃縮制備絲素蛋白溶液； 用制備的絲素蛋白溶液對(duì)圓盤(pán)狀無(wú)紡布支架進(jìn)行浸潤(rùn)，絲素溶液濃度為2-10%，然后進(jìn)行真空干燥和無(wú)水乙醇后處理； 接種人表皮細(xì)胞株Hacat，Hacat細(xì)胞的接種密度為10，105/ml，氣液面培養(yǎng)，待增殖形成片層結(jié)構(gòu)即構(gòu)建成組織工程表皮模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程表皮模型的構(gòu)建方法，其特征在于，選用的無(wú)紡布的原料為聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺中的一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程表皮模型的構(gòu)建方法，其特征在于，將無(wú)紡布熱壓成圓盤(pán)狀支架的溫度為130-200°C，圓盤(pán)直徑為5mm-30mm，圓盤(pán)邊緣高度為0.5mm-3mm ο
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程表皮模型的構(gòu)建方法，其特征在于，絲素脫膠采用以下任一方法進(jìn)行:浸泡于Na2CO3的水溶液中,溫度為60-100°C;或浸泡于中性阜的水溶液中，溫度為90-100°C;或浸泡于去離子水中在溫度為110-130°C，壓力為0.05-0.18MPa條件下脫膠。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的組織工程表皮模型的構(gòu)建方法，其特征在于，絲素溶解的方法采用下述任一方法:溶解于CaCl2、乙醇、水的三元溶液中，CaCl2、乙醇、水的摩爾比為1:2:8，溫度為50-100°C，溶解時(shí)間為2-5h ;或溶解于CaCl2的水溶液中，CaCl2的質(zhì)量百分比濃度為30-50%，溶解溫度90-100°C，溶解時(shí)間5-20min ;溶解于9.3mol/L的LiBr溶液中，溶解溫度50-70°C，溶解時(shí)間30-60min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程表皮模型的構(gòu)建方法，其特征在于，絲素濃縮采用以下任一方法進(jìn)行:透析袋透析法；或加熱揮發(fā)法；或中空纖維超濾法。
【文檔編號(hào)】A61L27/60GK103446623SQ201310425798
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】李瑞欣, 張西正, 盧濤, 徐成, 侍才洪, 郭勇, 李 昊 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生裝備研究所, 中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院