專利名稱：白色念珠菌基因CaTHI13，編碼蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及白色念珠菌基因CaTHI13，編碼蛋白及其用途。
背景技術(shù)：
白色念珠菌(Candida albicans)通常是人體皮膚、口腔、胃腸道和陰道的正常菌群，這些真菌正常情況下與人類共生，是無害的，但是當(dāng)某些危險因素作用于人體，如器官移植免疫抑制劑的使用，腫瘤的放療、化療，廣譜抗菌藥物的大量使用以及AIDS病毒感染時，可以引起廣泛的淺部和深部系統(tǒng)感染，感染部位包括口腔，女性陰道等，引起鵝口瘡，陰道炎等，也可以侵入表皮和內(nèi)皮細(xì)胞進入血液而到達(dá)內(nèi)臟器官，如腎臟，腦部等，導(dǎo)致敗血癥，嚴(yán)重可以導(dǎo)致死亡。
白色念珠菌在不同的生長條件下，有不同的生長形態(tài)，分為菌體形態(tài)(yeast form)，假菌絲(pseudohyphae)和菌絲(hyphal)，其中酵母--菌絲轉(zhuǎn)換有助于白色念珠菌侵入機體組織及逃逸細(xì)胞吞噬，這是顯示其毒力的兩個重要進程(參考文獻(xiàn)Berman J.2002 Nat RevGenet 3918-930)，因此菌絲形成能力與毒力密切相關(guān)。有報道受菌絲形成缺陷型白色念珠菌感染的小鼠，其存活期明顯長于正常白色念珠菌感染的小鼠，而不能產(chǎn)生菌絲形態(tài)的白色念珠菌對小鼠無毒力(參考文獻(xiàn)Lo，H.-J.1997 Cell 90939-949)。許多培養(yǎng)條件可以引起白色念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換，包括血清，溫度，pH值，氮源利用以及氧壓等等。
調(diào)節(jié)白色念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換的細(xì)胞內(nèi)分子機制主要有MAPK途徑(mitoge-actlvaied protein kinase pathway)和cAMP/PKA途徑(cAMP-dependentprotein kinase A pathway)。同時還發(fā)現(xiàn)Cph2介導(dǎo)的，Efgl介導(dǎo)的以及pH應(yīng)答的信號途徑也都和白色念珠菌的形態(tài)發(fā)生相關(guān)。在白色念珠菌中還存在抑制效應(yīng)的信號途徑，主要是Tupl介導(dǎo)的信號途徑，依靠抑制因子Rfgl，Nrgl等來發(fā)揮作用(參考文獻(xiàn)Liu，H.2001 Curr.Opin.Microbiol.4728-735)。另外，由白色念珠菌自身所產(chǎn)生的法定閾值感應(yīng)分子Farnesol也可抑制其菌絲的產(chǎn)生(參考文獻(xiàn)J.M.Hornby 2001 Appl.Environ.Microbiol.672982-2992)。
綜上所述，鑒于白色念珠菌引起的疾病越來越多，而白色念珠菌的菌絲形成能力與毒力又密切相關(guān)，因此本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)與白色念珠菌菌絲生長相關(guān)的基因及其編碼蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是開發(fā)與白色念珠菌菌絲生長相關(guān)的基因及其編碼蛋白。本發(fā)明的另一目的是提供上述基因及其編碼蛋白的用途。
本發(fā)明從白色念珠菌的cDNA文庫中克隆到白色念珠菌基因CaTHI13，該基因編碼的產(chǎn)物CaTHI13蛋白是重要的菌絲生長激活因子和毒性因子，參與白色念珠菌的菌絲生長和致病過程。
本發(fā)明提供一種與白色念珠菌菌絲生長相關(guān)的CaTHI13多肽，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2所示氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(1-15個，較佳地1-10個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的由(a)衍生的多肽。
在另一優(yōu)選例中，所述的多肽具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，它是包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼本發(fā)明上述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸的序列選自下組(a)具有SEQ ID NO1中的1-1353位的核苷酸序列；
(b)具有SEQ ID NO1中的224-1240位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，它含有本發(fā)明上述的多核苷酸，以及一種宿主細(xì)胞，它含有上述的載體。
在本發(fā)明第四方面，提供了一種能與本發(fā)明所述的白色念珠菌CaTHI13蛋白特異性結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明的第五方面，提供了制備CaTHI13蛋白的方法，該方法包含(a)在表達(dá)條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出CaTHI13蛋白。
在本發(fā)明的第六方面，提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的15-1353個核苷酸。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在CaTHI13蛋白的方法，它包括將樣品與CaTHI13蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在CaTHI13蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進CaTHI13多肽活性的激動劑，或者篩選抑制CaTHI13多肽活性的拮抗劑。本發(fā)明的CaTHI13蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，從白色念珠菌(Candidaalblcans)cDNA文庫中篩選得到一個1.3kb的新基因CaTHI13，其開放閱讀框含1017個核苷酸，編碼一個339個氨基酸的蛋白質(zhì)。
實驗表明，(1)CaTHI13基因的敲除導(dǎo)致白色念珠菌菌絲生長缺陷，在白色念珠菌中高表達(dá)CaTHI13基因能在一定程度上激活菌絲生長。(2)通過小鼠系統(tǒng)感染試驗發(fā)現(xiàn)CaTHI13基因敲除株毒力明顯降低。與感染野生型菌的小鼠相比，感染CaTHI13基因缺失菌的小鼠存活時間明顯延長，腎臟內(nèi)侵入的菌量明顯降低，其腎臟的損害也較輕。
因此，CaTHI13蛋白是白色念珠菌中重要的菌絲生長激活因子和毒性因子，參與白色念珠菌的致病過程。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明中，術(shù)語“CaTHI13蛋白”、“CaTHI13多肽”或“白色念珠菌CaTHI13多肽”可互換使用，都指具有白色念珠菌CaTHI13氨基酸序列(SEQ ID NO1和2中所示的氨基酸序列)的蛋白或多肽，以及將SEQ ID NO1和2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的衍生的多肽。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的白色念珠菌CaTHI13蛋白或多肽”是指白色念珠菌CaTHI13多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化白色念珠菌CaTHI13蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
在本發(fā)明中，術(shù)語“白色念珠菌CaTHI13多肽”指具有白色念珠菌CaTHI13蛋白活性的SEQ ID NO2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與白色念珠菌CaTHI13蛋白相同功能的、SEQ ID NO2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括白色念珠菌CaTHI13蛋白的活性片段和活性衍生物。
在本發(fā)明中，“白色念珠菌CaTHI13蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體″在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2序列的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼圖1的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件″是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼白色念珠菌CaTHI13蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明的白色念珠菌CaTHI13核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的DNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的DNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 19852301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或白色念珠菌CaTHI13蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的CaTHI13多肽。一般來說有以下步驟(1)用本發(fā)明的編碼白色念珠菌CaTHI13多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞(3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，白色念珠菌CaTHI13多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體″指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含白色念珠茵CaTHI13編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；入噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動物細(xì)胞等。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(BPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的白色念珠菌CaTHI13蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)用于篩選促進或?qū)拱咨钪榫鶦aTHI13蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組白色念珠菌CaTHI13蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激白色念珠菌CaTHI13蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對白色念珠菌CaTHI13 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于白色念珠菌CaTHI13基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與白色念珠菌CaTHI13基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。例如，純化的白色念珠菌CaTHI13基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)白色念珠菌CaTHI13蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。
抗白色念珠菌CaTHI13蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的白色念珠菌CaTHI13蛋白。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與白色念珠菌CaTHI13蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測白色念珠菌CaTHI13蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的。
一種檢測檢測樣品中是否存在白色念珠菌CaTHI13蛋白的方法是利用白色念珠菌CaTHI13蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與白色念珠菌CaTHI13蛋白特異性抗體接觸觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在白色念珠菌CaTHI13蛋白。


圖1顯示了白色念珠菌CaTHI13與其他蛋白的同源性比較。
圖2顯示了白色念珠菌CaTHI13基因敲除對白色念珠菌菌絲形成的影響，其中A.各菌株于Spider固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)7天；B.各菌株于Lee’S固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)7天。
圖3顯示了白色念珠菌CaTHI13基因敲除對小鼠存活率的影響。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步描述。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1Southern分析白色念珠菌基因組DNA抽提采用小量酵母菌基因組DNA快速抽提純化試劑盒(華舜生物工程有限公司)，方法按照說明書進行。基因組DNA用PstI(購自Promega公司)完全酶切，電泳完成后的瓊脂糖膠分別用變性液和中和液浸泡45min。在真空核酸轉(zhuǎn)印儀(購自Bio-rad公司)上放置一張預(yù)先用蒸餾水濕潤的Whatman3MM濾紙，按膠塊大小的長、寬各多0.5cm剪取尼龍膜一張，置于20×SSC中浸泡1h，剪去膜一角，覆蓋于濾紙上，上面覆蓋一張帶開口塑料薄膜，用玻棒趕出所有氣泡，以框架壓緊密封四周，將膠塊切去一角，并在20×SSC浸泡15min×2次，覆蓋于薄膜開口上面，打開真空泵抽吸真空。倒入20×SSC使液面略低于平臺表面，使上述DNA真空轉(zhuǎn)移，持續(xù)進行2小時左右。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，揭去凝膠上方的凝膠。將膜在2×SSC中浸泡5分鐘，以去除膜上殘留的凝膠。將凝膠置紫外燈下，觀察膠塊上有無殘留的RNA。膜置80℃，真空干烤1～2h?？靖珊蟮哪び盟芰洗芊猓?℃冰箱保存?zhèn)溆?。探針?biāo)記與雜交實驗采用DIG High Prime DNA Labeling and DetectionStarter Kit I(購自Roche司)，方法按照說明書進行。
實施例2CaTHI13基因的克隆將按照SMART技術(shù)構(gòu)建的白色念珠菌cDNA文庫中的克隆經(jīng)測序及Unigene歸并后，制成cDNA芯片，用于雜交實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一組在白色念珠菌不同耐藥相關(guān)芯片雜交實驗中都呈現(xiàn)差異表達(dá)的基因，在cDNA文庫中找到這些基因所對應(yīng)的克隆并進行全長測序。測序結(jié)果顯示，c125號克隆第1至108位序列與載體的多克隆位點及其側(cè)翼序列完全一致，第109至1467位為插入載體中的cDNA片段，長度是1358bp。將該序列與白色念珠菌數(shù)據(jù)庫CandidaDB(http://genolist.pasteur.fr/CandidaDB/)進行基因組序列blastn比較顯示，如圖1所示，p125所含序列與數(shù)據(jù)庫中的白色念珠菌染色體R的Ctg19-2511中第74395-75747位序列一致性達(dá)98％。將測序結(jié)果與白色念珠菌數(shù)據(jù)庫CandidaDB(http://genol ist.pasteur.fr/CandidaDB/)進行編碼序列blastn比較顯示，p125所含序列與數(shù)據(jù)庫中登錄號為CA5560的序列一致性達(dá)99％。根據(jù)序列同源性，CA5560編碼嘧啶前體合成酶，已被命名為THI13，因此我們將p125中所含的基因定名為CaTHI13基因，對應(yīng)推導(dǎo)的蛋白質(zhì)命名為CaTHI13(或CaThi13)多肽。所測序列在第332位有起始密碼子ATG，在第1353位有終止密碼子TAA，故THI13基因的ORF長1017bp，編碼339個氨基酸，為一全長基因，即SEQ ID NO1所示。該基因定位于CaO19.7324，分子量3.83，等電點5.73。
實施例3CaTHI13基因的敲除將含有THI13全長基因的質(zhì)粒p125K以BamHI酶切后，與來自質(zhì)粒p5921的4.04kb的hisG-URA3-hisG序列的大片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選得到質(zhì)粒p125K，經(jīng)PvuII酶切線性化后轉(zhuǎn)化尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型白色念珠菌CAI4。通過同源重組的方法，可以在染色體上的CaTHI13基因中插入HisG-URA3-HisG片段，從而破壞染色體上的CaSYII基因。篩選標(biāo)志URA3和一份HisG序列可以在含5一氟乳清酸(5-fluoro-orotic acid，5-FOA)平板上通過兩個同向IHsG同源序列在同一條染色體上的重組而環(huán)出，丟失了URA3篩選標(biāo)志的重組子可以在5-FOA平板上通過正向篩選得到，從而可以進行下一輪的轉(zhuǎn)化進而破壞另一條染色體上的CaTHI13基因，重組子基因型用PCR和Southern雜交檢測鑒定。
實施例4CaTHI13基因回復(fù)菌株的構(gòu)建CaTHI13全長基因用的Pyrobest酶(購自TaKaRa公司)從野生型白色念珠菌基因組DNA中PCR擴增得到，用PstI(購自Promega公司)37℃酶切2小時。白色念珠菌高表達(dá)載體pCaEXP(Care R.S.et al.1999Mol.Microbio.34(4)792-798)用Pstl酶切并用堿性磷酸酯酶(CIP，購自TaKaRa公司)37℃處理后，和PCR酶切片段用T4 DNA連接酶(購自Promega公司)16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單克隆，抽取質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序鑒定得到CaTHI13高表達(dá)質(zhì)粒。將該質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)化CaTHI13基因敲除菌，得到CaTHI13基因回復(fù)菌株。
實施例5小鼠尾靜脈注射白色念珠菌菌株進行系統(tǒng)感染實驗在YPD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)菌株過夜，使其達(dá)到指數(shù)生長期末期。以1％接種到新鮮的YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時，用0.9％生理鹽水洗3次，計數(shù)并以0.9％生理鹽水配制成濃度為1×106cells/ml的真菌溶液。尾靜脈注射該溶液造成小鼠系統(tǒng)性真菌感染，每天2次，觀察小鼠死亡情況。將感染白色念珠菌3天后的小鼠頸椎脫臼法處死，取其腎臟，在生理鹽水中以勻漿器研磨成顆粒，鋪于沙堡葡萄糖瓊脂平板，30℃培養(yǎng)2天，觀察平板上長出的克隆數(shù)。將小鼠腎臟用福爾馬林固定后，包埋于石蠟，切片，HE染色后顯微鏡下觀察。
實施例3、4、5的結(jié)果顯示(1)白色念珠菌CaTHI13基因敲除對菌絲形成的影響白色念珠菌菌絲形成能力對其侵入和感染是必需的。CaTHI13基因的敲除可以條件性降低白色念珠菌菌絲形成能力。如圖2所示，在Spider固體瓊脂平板上，經(jīng)過37℃7天培養(yǎng)，野生型菌株和回復(fù)菌株都強烈地形成菌絲，而缺失株長出光滑的克隆，無菌絲產(chǎn)生。這種菌絲生長抑制現(xiàn)象在固體Lee’s瓊脂平板上同樣明顯。經(jīng)過7天37℃培養(yǎng)，野生型菌株和回復(fù)菌株都能形成菌絲，而CaTHI13基因缺失株菌絲形成能力被阻斷，形成光滑的菌落，并沒有看到菌絲的形成。但在Spider和Lee’s液體培養(yǎng)基，含有10％小牛血清的YPD及RPMI-1640液體培養(yǎng)基中，野生型菌株，CaTHI13基因缺失株和回復(fù)株能形成正常的菌絲。這表明CaTHI13是與白色念珠菌菌絲形成相關(guān)的基因之一，可以條件性地調(diào)控菌絲形成。
(2)CaTHI13基因的缺失對白色念珠菌毒力的影響
CaTHI13基因的敲除導(dǎo)致白色念珠菌菌絲生長缺陷，使得白色念珠菌在某些菌絲誘導(dǎo)條件下也無法形成菌絲，通過小鼠尾靜脈注射白色念珠菌菌株進行系統(tǒng)感染實驗來檢測CaTHI13基因的敲除是否導(dǎo)致了菌株毒力下降。結(jié)果如圖3所示野生型菌株和回復(fù)菌株感染小鼠均在8天內(nèi)全部死亡，CaTHI13基因缺失株感染的小鼠除第7天死亡1只外，其余至第14天為止全部存活。將感染白色念珠菌3天后的小鼠處死，取其腎臟，研磨后鋪于SD平板培養(yǎng)2天，可以看到小鼠腎臟內(nèi)侵入的菌量隨不同而出現(xiàn)明顯差異，感染野生型菌株和回復(fù)菌株的小鼠腎臟內(nèi)侵入的菌量最多，感染THI13基因缺失菌的小鼠腎臟內(nèi)侵入的菌量最少。腎臟病理檢查結(jié)果顯示，全部受檢動物均有腎膿腫及腎小管上皮變性(腎病)損害，但損害程度有所不同。感野生型菌株和回復(fù)菌株小鼠腎臟損害最嚴(yán)重，呈典型腎內(nèi)霉菌性膿腫，中央有菌絲。感染CaTHI13基因缺失株的小鼠腎臟損害程度相對較輕，表明CaTHI13是白色念珠菌中重要的毒性因子，參與白色念珠菌的致病過程。
實施例6白色念珠菌CaTHI13蛋白的多克隆抗體制備將白色念珠菌CaTHI13基因的編碼序列克隆于原核表達(dá)載體pGEX4T-1的多克隆位點，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，以GST Sepharose 4B純化試劑盒(Pharmacia公司)及凝血酶裂解得到CaTHI13多肽，以此多肽免疫新西蘭兔，獲得CaTHI13蛋白的多克隆抗體。
實施例7白色念珠菌和釀酒酵母的轉(zhuǎn)化將白色念珠菌培養(yǎng)于5ml YPAD培養(yǎng)基中30℃振搖過夜，使菌濃度達(dá)1～2×108cells/ml。取該菌液用新鮮溫暖的YPAD稀釋到1～2×106cells/ml，30℃振搖培養(yǎng)約3～5小時，直到2×107cells/ml。離心收集菌體；25ml無菌水重懸，再次離心收集菌體，或10ml無菌水重懸兩次，離心收集菌體。用1ml 100mM的TE/LiAc重懸，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管，離心除去LiAc液體，再用400μl的100mM的LiAc重懸。隨后取100ul細(xì)胞懸液與50ug鮭精DNA及5ug線性質(zhì)粒DNA混合。含PEG4000(40％)的LATE緩沖液與反應(yīng)液混合，30℃孵育12-15小時。細(xì)胞(沉淀)42℃熱休克1小時，以YPD培養(yǎng)基洗滌，再重懸于200ulYPD培養(yǎng)基，鋪于選擇性平板上。
SEQUENCE LISTING<110>中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)<120>白色念珠菌基因CaTHI13，編碼蛋白及其用途<130>說明書，權(quán)利要求書<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1353<212>DNA<213>白色念珠菌(Candida albicans)<220>
<221>CDS<222>(224)..(1240)<223>
<400>1gccaaaagag gaggatattt gaatatgcta ttatgaaccc cattgatttt gactacaatt 60ggatttgtcg ggtattgaaa cccaaacata ttataatttg ctatgcgttt aaatcaaccg120tttactggta gatcctatac tataaataca gccaacaatc cccaattgtt cagataaagt180aacactcaat atcatttgat caatcaatca agaggattac aaa atg tct act aac 235Met Ser Thr Asn1
aaa atc aca ttt tta ttg aat tgg gaa gct gct cca tat cat att cca 283Lys Ile Thr Phe Leu Leu Asn Trp Glu Ala Ala Pro Tyr His Ile Pro5 10 15 20gtg tat ttg gct aac atc aaa ggt tat ttc aaa gat gag aat ctt gat 331Val Tyr Leu Ala Asn Ile Lys Gly Tyr Phe Lys Asp Glu Asn Leu Asp25 30 35att gct atc ttg gag ccc tcc aat cca tct gat gtt act gaa ttg gtg 379Ile Ala Ile Leu Glu Pro Ser Asn Pro Ser Asp Val Thr Glu Leu Val40 45 50gga tcc ggt aaa gtt gac atg ggt ttg aag gca atg gtt cac aca ttg 427Gly Ser Gly Lys Val Asp Met Gly Leu Lys Ala Met Val His Thr Leu55 60 65gcc gcc aaa gct aga gga ctc cca gta aca tca att gga tct tta tta 475Ala Ala Lys Ala Arg Gly Leu Pro Val Thr Ser Ile Gly Ser Leu Leu70 75 80gac gaa cca ttc acc ggt ata tgt tat ttg gag gga tct ggt atc act 523Asp Glu Pro Phe Thr Gly Ile Cys Tyr Leu Glu Gly Ser Gly Ile Thr85 90 95 100tct gat ttc caa tcc ttg aaa ggt aaa aga att ggt tat gtt ggt gag 571Ser Asp Phe Gln Ser Leu Lys Gly Lys Arg Ile Gly Tyr Val Gly Glu105 110 115ttt ggt aaa att caa gtt gat gaa ttg act aaa cat tat ggt atg aca 619Phe Gly Lys Ile Gln Val Asp Glu Leu Thr Lys His Tyr Gly Met Thr120 125 130cct gat gat tat gtt gcc gtt cga tgt ggt atg aat gtg gca aag tat 667Pro Asp Asp Tyr Val Ala Val Arg Cys Gly Met Asn Val Ala Lys Tyr135 140 145att tta gaa gga act atc gat tgt ggt att gga att gaa tgt att caa 715Ile Leu Glu Gly Thr Ile Asp Cys Gly Ile Gly Ile Glu Cys Ile Gln150 155 160caa gtg gaa tta gaa gaa gct ttg aaa gaa caa ggg aaa gat tca aac 763
Gln Val Glu Leu Glu Glu Ala Leu Lys Glu Gln Gly Lys Asp Ser Asn165 170 175 180gac gct aag atg tta aga atc gat aaa ttg gca gaa ttg ggt tgt tgc 811Asp Ala Lys Met Leu Arg Ile Asp Lys Leu Ala Glu Leu Gly Cys Cys185 190 195tgc ttt tgt aca atc tta tac att gcc aac gat aaa ttc att gct gaa 859Cys Phe Cys Thr Ile Leu Tyr Ile Ala Asn Asp Lys Phe Ile Ala Glu200 205 210aac tca caa gca gtt aaa aag ttt ttg aaa gca att aag aga gcc act 907Asn Ser Gln Ala Val Lys Lys Phe Leu Lys Ala Ile Lys Arg Ala Thr215 220 225gat tat atg ttg gcc cac cca cgt gag gct tgg gct gaa tat ggt aat 955Asp Tyr Met Leu Ala His Pro Arg Glu Ala Trp Ala Glu Tyr Gly Asn230 235 240ttc aaa cca act atg caa aca gac ttg aac acc aag aag ttc caa aga 1003Phe Lys Pro Thr Met Gln Thr Asp Leu Asn Thr Lys Lys Phe Gln Arg245 250 255 260tgt tac gcc tac ttt tct gag tcc ttg tac aac gtt cat cgt gat tgg 1051Cys Tyr Ala Tyr Phe Ser Glu Ser Leu Tyr Asn Val His Arg Asp Trp265 270 275aga aag gtt aac aat tat ggt aag aga ttg gat att tta cct gaa aat 1099Arg Lys Val Asn Asn Tyr Gly Lys Arg Leu Asp Ile Leu Pro Glu Asn280 285 290tac gtt cca aat tac acg aat gaa tat ctt tca tgg cca gaa cct aaa 1147Tyr Val Pro Asn Tyr Thr Asn Glu Tyr Leu Ser Trp Pro Glu Pro Lys295 300 305gaa gtt gat gat cct gaa aaa gca caa gat ttg atg ctt aaa cac caa 1195Glu Val Asp Asp Pro Glu Lys Ala Gln Asp Leu Met Leu Lys His Gln310 315 320gaa gaa tgt aaa aca tgt ggt ggt tat aaa aga ttg gtt ctt gcc 1240Glu Glu Cys Lys Thr Cys Gly Gly Tyr Lys Arg Leu Val Leu Ala
325 330 335taaggaattt ctttctttct tttttttttt catctacata gcaatgtgta tttcgttgtt 1300tgatttatac gatattatta gaaaattagt aagaaacaaa gatatgtatt ttc 1353<210>2<211>339<212>PRT<213>白色念珠菌(Candida albicans)<400>2Met Ser Thr Asn Lys Ile Thr Phe Leu Leu Asn Trp Glu Ala Ala Pro1 5 10 15Tyr His Ile Pro Val Tyr Leu Ala Asn Ile Lys Gly Tyr Phe Lys Asp20 25 30Glu Asn Leu Asp Ile Ala Ile Leu Glu Pro Ser Asn Pro Ser Asp Val35 40 45Thr Glu Leu Val Gly Ser Gly Lys Val Asp Met Gly Leu Lys Ala Met50 55 60Val His Thr Leu Ala Ala Lys Ala Arg Gly Leu Pro Val Thr Ser Ile65 70 75 80Gly Ser Leu Leu Asp Glu Pro Phe Thr Gly Ile Cys Tyr Leu Glu Gly85 90 95Ser Gly Ile Thr Ser Asp Phe Gln Ser Leu Lys Gly Lys Arg Ile Gly100 105 110Tyr Val Gly Glu Phe Gly Lys Ile Gln Val Asp Glu Leu Thr Lys His115 120 125
Tyr Gly Met Thr Pro Asp Asp Tyr Val Ala Val Arg Cys Gly Met Asn130 135 140Val Ala Lys Tyr Ile Leu Glu Gly Thr Ile Asp Cys Gly Ile Gly Ile145 150 155 160Glu Cys Ile Gln Gln Val Glu Leu Glu Glu Ala Leu Lys Glu Gln Gly165 170 175Lys Asp Ser Asn Asp Ala Lys Met Leu Arg Ile Asp Lys Leu Ala Glu180 185 190Leu Gly Cys Cys Cys Phe Cys Thr Ile Leu Tyr Ile Ala Asn Asp Lys195 200 205Phe Ile Ala Glu Asn Ser Gln Ala Val Lys Lys Phe Leu Lys Ala Ile210 215 220Lys Arg Ala Thr Asp Tyr Met Leu Ala His Pro Arg Glu Ala Trp Ala225 230 235 240Glu Tyr Gly Asn Phe Lys Pro Thr Met Gln Thr Asp Leu Asn Thr Lys245 250 255Lys Phe Gln Arg Cys Tyr Ala Tyr Phe Ser Glu Ser Leu Tyr Asn Val260 265 270His Arg Asp Trp Arg Lys Val Asn Asn Tyr Gly Lys Arg Leu Asp Ile275 280 285Leu Pro Glu Asn Tyr Val Pro Asn Tyr Thr Asn Glu Tyr Leu Ser Trp290 295 300Pro Glu Pro Lys Glu Val Asp Asp Pro Glu Lys Ala Gln Asp Leu Met305 310 315 320Leu Lys His Gln Glu Glu Cys Lys Thr Cys Gly Gly Tyr Lys Arg Leu325 330 335Val Leu Ala
權(quán)利要求
1.一種與白色念珠菌菌絲生長相關(guān)的CaTHI13多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2所示氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的由(a)衍生的多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它選自下組(a)編碼如權(quán)利要求1或2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組(a)具有SEQ ID NO1中的1-1353位的核苷酸序列；(b)具有SEQ ID NO1中的224-1240位的核苷酸序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.一種制備如權(quán)利要求1所述的CaTHI13多肽的方法，其特征在于該方法包含(a)在適合表達(dá)蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出CaTHI13蛋白。
9.一種能與權(quán)利要求1所述的白色念珠菌CaTHI13多肽特異性結(jié)合的抗體。
10.權(quán)利要求9所述的抗體在制備檢測與治療白色念珠菌引起的疾病中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及白色念珠菌基因CaTHI13，編碼蛋白及其用途。白色念珠菌會引起許多疾病，已有文獻(xiàn)報道白色念珠菌的菌絲形成能力與毒力又密切相關(guān)，因此本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)與白色念珠菌菌絲生長相關(guān)的基因及其編碼蛋白。本發(fā)明的目的是開發(fā)與白色念珠菌菌絲生長相關(guān)的基因、編碼蛋白及其用途。本發(fā)明從白色念珠菌的cDNA文庫中克隆到白色念珠菌基因CaTHI13(SEQ ID NO1)，該基因編碼的產(chǎn)物CaTHI13蛋白(SEQ ID NO2)是重要的菌絲生長激活因子和毒性因子，參與白色念珠菌的菌絲生長和致病過程。本發(fā)明還提供了上述基因和蛋白的用途。
文檔編號C12P21/02GK1769296SQ20051002978
公開日2006年5月10日 申請日期2005年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月20日
發(fā)明者曹穎瑛, 徐錚, 曹永兵, 高平揮, 朱臻宇, 姜遠(yuǎn)英 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)