本發(fā)明涉及冠心病診斷領域，更具體地，本發(fā)明涉及以檢測skil異常為手段的冠心病診斷方法。
背景技術：
：隨著經濟和社會的發(fā)展，心血管疾病尤其是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病；coronaryarterydisease；cad)的發(fā)病率正在逐年上升。對于發(fā)達國家，還有大多數(shù)的發(fā)展中國家來講，cad已經成為成年人發(fā)病和死亡的主要原因。近年來，對于cad的流行趨勢以及越來越嚴峻的不良預后的現(xiàn)狀，各國衛(wèi)生組織均給予了高度的關注。在中國，由于改革開放，物質生活條件的提高，人均壽命逐漸延長，相應的，心血管疾病尤其是冠心病的發(fā)病率逐年升高，有人預計，到本世紀的20年代，冠心病有可能會成為威脅人類健康的首位疾病。近年來對冠心病的診斷方法和治療措施有了重大的突破，尤其是近年來抗血小板藥物、抗凝藥物、溶栓藥物的更新?lián)Q代，以及經皮冠狀動脈介入治療(pci)措施的日益普及，使大多數(shù)的冠心病患者的臨床結局發(fā)生了巨大改善。但是，目前冠心病的病因學研究以及對其發(fā)病機制的研究尚待提高和突破。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一在于提供一種通過檢測skil基因或蛋白表達差異來診斷冠心病的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術方案：本發(fā)明提供了檢測skil基因或skil蛋白的產品在制備冠心病診斷工具中的用途。進一步，所述檢測skil基因或skil蛋白的產品包括檢測skil基因或skil蛋白的表達水平的產品。所述產品包括能夠結合skil基因的核酸或者能夠結合skil蛋白的物質(例如抗體)。所述核酸能夠檢測skil基因的表達水平；所述物質能夠檢測skil蛋白的表達水平。本發(fā)明的檢測skil基因的產品可基于使用核酸分子的已知方法來發(fā)揮其功能：如pcr、如southern雜交、northern雜交、點雜交、熒光原位雜交(fish)、dna微陣列、aso法、高通量測序平臺等。使用該產品可以定性地、定量地、或半定量地實施分析。包含在上述產品中的核酸可以通過化學合成來獲得，或通過從生物材料制備含有期望核酸的基因，然后使用設計用于擴增期望核酸的引物擴增它來獲得。進一步，所述pcr方法為已知方法，例如，arms(amplificationrefractorymutationsystem，擴增不應突變系統(tǒng))法、rt-pcr(逆轉錄酶-pcr)法、嵌套pcr法等等。擴增的核酸可以通過使用點印跡雜交法、表面等離子共振法(spr法)、pcr-rflp法、原位rt-pcr法、pcr-sso(序列特異性寡核苷酸)法、pcr-ssp法、ampflp(可擴增片段長度多態(tài)性)法、mvr-pcr法、和pcr-sscp(單鏈構象多態(tài)性)法來檢測。上面所述的核酸包括擴增skil基因的引物，產品中包括的引物可以通過通過化學合成來制備，通過使用本領域技術人員知道的方法參考已知信息來適當?shù)卦O計，并通過化學合成來制備。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述核酸為qpcr實驗中使用的擴增引物，所述引物的序列如seqidno.1(正向序列)和seqidno.2(反向序列)所示。上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可以通過化學合成來制備，通過使用本領域技術人員知道的方法參考已知信息來恰當設計，并通過化學合成來制備，或者可以通過從生物材料制備含有期望核酸序列的基因，并使用設計用于擴增期望核酸序列的引物擴增它來制備。本發(fā)明的檢測skil蛋白的產品可基于使用抗體的已知方法來發(fā)揮其功能：例如，可以包括elisa、放射免疫測定法、免疫組織化學法、western印跡等。本發(fā)明的檢測skil蛋白的產品包括特異性結合skil蛋白的抗體或其片段?？梢允褂萌魏谓Y構、尺寸、免疫球蛋白類別、起源等的抗體或其片段，只要它結合靶蛋白質即可。本發(fā)明的檢測產品中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的。抗體片段指保留抗體對抗原的結合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽?？贵w片段可以包括f(ab′)2、fab′、fab、單鏈fv(scfv)、二硫化物鍵合的fv(dsfv)或其聚合物、二聚化v區(qū)(雙抗體)、或含有cdr的肽。本發(fā)明的檢測skil蛋白的產品可以包括編碼抗體或編碼抗體片段的氨基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細胞?？贵w可以通過本領域技術人員公知的方法來獲得。例如，制備保留整個或部分靶蛋白質的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動物細胞表達載體作為抗原。使用抗原免疫動物后，從經過免疫的動物獲得免疫細胞并融合骨髓瘤細胞以獲得雜交瘤。然后從雜交瘤培養(yǎng)物收集抗體。最后可以通過使用被用作抗原的skil蛋白或其部分對獲得的抗體實施抗原特異性純化來獲得針對skil蛋白的單克隆抗體?？梢匀缦轮苽涠嗫寺】贵w：用與上文相同的抗原免疫動物，從經過免疫的動物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然后使用上述抗原對血清實施抗原特異性純化?？梢酝ㄟ^用酶處理獲得的抗體或通過使用獲得的抗體的序列信息來獲得抗體片段。標記物與抗體或其片段的結合可以通過本領域普遍知道的方法來實施。例如，可以如下熒光標記蛋白質或肽：用磷酸鹽緩沖液清洗蛋白質或肽，添加用dmso、緩沖劑、等準備的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分鐘。另外，標記可使用商品化的標記試劑盒，諸如生物素標記試劑盒，如生物素標記試劑盒-nh2、生物素標記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；堿性磷酸酶標記試劑盒諸如堿性磷酸酶標記試劑盒-nh2、堿性磷酸酶標記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；過氧化物酶標記試劑盒諸如過氧化物酶標記試劑盒-nh2、過氧化物酶標記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；藻膽蛋白標記試劑盒諸如藻膽蛋白標記試劑盒-nh2、藻膽蛋白標記試劑盒-sh、b-藻紅蛋白標記試劑盒-nh2，b-藻紅蛋白標記試劑盒-sh、r-藻紅蛋白標記試劑盒-nh2、r-藻紅蛋白標記試劑盒sh(dojindolaboratories)；熒光標記試劑盒諸如熒光素標記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)555標記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)647標記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；及dylight547和dylight647(technochemicalcorp.)、zenon(tm)、alexafluor(tm)抗體標記試劑盒、qdot(tm)抗體標記試劑盒(invitrogencorporation)和ez-標記物蛋白質標記試劑盒(funakoshicorporation)。為了正確標記，可以使用適宜的儀器來檢測經過標記的抗體或其片段。進一步，所述檢測skil基因或skil蛋白的產品可以是檢測skil基因或skil蛋白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測序平臺。利用前面所述的檢測產品檢測受試者樣本中的skil基因或skil蛋白的表達水平，與正常人相比，受試者樣本中的skil基因或skil蛋白的表達水平升高，則診斷該受試者為冠心病患者。作為依照本發(fā)明的檢測產品的樣本，可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣本不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經過處理的材料。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述樣本來自受試者的血液。本發(fā)明還提供了一種診斷冠心病的工具，所述工具能夠檢測受試者樣本中skil基因或skil蛋白的表達水平。所述工具包括能夠結合skil基因的核酸或者能夠結合skil蛋白的物質(例如抗體)。所述核酸能夠檢測skil基因的表達水平；所述物質能夠檢測skil蛋白的表達水平。進一步，所述核酸和所述物質的性質同前面所述。進一步，所述診斷冠心病的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷冠心病的工具，隨著高通量測序技術的發(fā)展，對一個人的基因表達譜的構建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關。因此，在高通量測序中獲知skil基因的異常與冠心病相關也屬于skil基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內。本發(fā)明的檢測產品、診斷工具中使用的抗skil抗體或其片段所識別的氨基酸的數(shù)目沒有特別限制，只要抗體能夠結合skil即可。當抗體作為治療藥物時，優(yōu)選的是它能夠識別盡可能多的氨基酸，只要它能抑制skil功能?？贵w或其片段識別的氨基酸的數(shù)目是至少一個，更優(yōu)選至少三個?？贵w的免疫球蛋白類別不受限制，可以是igg、igm、iga、ige、igd或igy。本發(fā)明的檢測產品、診斷工具中使用的抗skil抗體的其他性質同前面所述。進一步，所述受試者樣本可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣本不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經過處理的材料。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述樣本來自受試者的血液。本發(fā)明還提供了一種診斷冠心病的方法，所述方法包括如下步驟：(1)獲取冠心病受試者的樣品；(2)檢測受試者樣品中skil基因或蛋白的表達水平；(3)將測得的skil基因或蛋白的表達水平與受試者的患病與否關聯(lián)起來。(4)與對照相比，skil基因或蛋白的表達水平升高，則該受試者被診斷為冠心病。在本發(fā)明的上下文中，“診斷冠心病”既包括判斷受試者是否已經患有冠心病、也包括判斷受試者是否存在患有冠心病的風險。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)了一種診斷冠心病的分子標志物，使用該分子標志物可以在冠心病發(fā)生的早期即可作為判斷，提供了患者的生存率。附圖說明圖1顯示利用qpcr檢測skil基因在冠心病患者與正常人中的表達情況；圖2顯示利用westernblot檢測skil蛋白在冠心病患者與正常人中的表達情況。具體的實施方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1skil基因的差異表達1、研究對象：收集冠心病患者6例，正常人6例。冠心病組的納入標準：按照世界衛(wèi)生組織制定的缺血性心臟病的診斷標準，選擇經冠狀動脈造影證實有一支或多支血管狹窄程度≥50％的冠心病患者。對照組的入選標準為：1)在流行病學調查時篩選年齡、性別、民族均與cad組相匹配，經過問卷調查、體格檢查、心臟超聲檢查及心電圖檢查及相關實驗室檢查沒有冠心病的臨床表現(xiàn)及主要危險因素的體檢者；2)住院行健康體檢并行冠狀動脈造影檢查排除冠心病并年齡、性別、民族與cad組匹配者；符合以上任何一條者入選為對照組。兩組在納入研究前簽署知情同意書。剔除標準：cad組-臨床資料不全者及同時合并以下疾病之一者予以剔除。(如：先天性心臟病者、主動脈夾層、多臟器功能衰竭、風濕性心臟病以及具有精神障礙不能配合者)。對照組：有精神障礙者或經多普勒檢查證實有頸動脈斑塊或狹窄者，予以剔除。2、血液中總rna的提取使用百泰克血液rna提取試劑盒進行血液總rna的提取(1)取全血250μl(或0.25g)至rnase-free過濾柱中，13000rpm離心2分鐘，收集下液，加入0.75ml裂解液rls。(2)將勻漿樣品劇烈震蕩混勻，在15-30℃條件下孵育5分鐘以使核蛋白體完全分解。(3)可選步驟：4℃的條件下12,000rpm離心10分鐘，小心取上清轉入一個新的無rna酶的離心管中。(4)每1mlrls加0.2ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，劇烈振蕩15秒并將其在室溫下孵育3分鐘。(5)于4℃12,000rpm離心10分鐘，樣品會分成三層：下層有機相，中間層和上層無色的水相，rna存在于水相中。水相層的容量大約為所加rls體積的60％，把水相轉移到新管中，進行下一步操作。(6)加入1倍體積70％乙醇，顛倒混勻(此時可能會出現(xiàn)沉淀)，得到的溶液和可能沉淀一起轉入吸附柱ra中(吸附柱套在收集管內)。(7)10,000rpm離心45秒，棄掉廢液，將吸附柱重新套回收集管。(8)加500μl去蛋白液re，12,000rpm離心45秒，棄掉廢液。(9)加入700μl漂洗液rw，12,000rpm離心60秒，棄掉廢液。(10)加入500μl漂洗液rw，12,000rpm離心60秒，棄掉廢液。(11)將吸附柱ra放回空收集管中，12,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液,以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。(12)取出吸附柱ra，放入一個無rna酶的離心管中，根據預期rna產量在吸附膜的中間部位加50-80μl無rna酶的水，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘，收集洗脫液。3、rna樣品的質量分析(nanodrop1000分光光度計)nanodrop1000分光光度計檢測rna樣品，rna-seq測序的樣品要求：od260/od280為1.8-2.2。4、rna樣品的完整性分析(agilenttechnologies2100bioanalyzer)agilenttechnologies2100bioanalyzer檢測rna樣品，觀察28srrna和18srrna主帶明顯、無降解、rna完整性指數(shù)合格、濃度達到要求的符合rna-seq測序cdna文庫構建的要求，可以用于文庫構建及測序。5、高通量轉錄組測序(1)rna-seq讀段定位首先將低質量的讀段去除得到清潔讀段，然后利用tophatv1.3.1將清潔片段與ucsch.sapiens參考基因組(hg19)進行匹配，h.sapiensucschg19版的預先構建的索引從tophat主頁下載，并作為參考基因組，利用tophat與基因組匹配時，允許每個讀段(默認到20)有多個匹配位點，最多2次錯配。tophat根據外顯子區(qū)域和gt-ag剪切信號建立可能的剪切位點庫，根據這些剪切位點庫將沒有定位到基因組的讀段定位到基因組上。我們使用tophat方法的系統(tǒng)默認參數(shù)。(2)轉錄豐度評估匹配上的讀段文件通過cufflinksv1.0.3處理，cufflinksv1.0.3將rna-seq片段數(shù)目進行標準化計算轉錄本的相對豐度。fpkm值指的是每一百萬測序片段中匹配到特定基因1kb長的外顯子區(qū)域的片段數(shù)目。通過貝葉斯推理方法計算fpkm估計值的置信區(qū)間。cufflinks使用的參考的gtf注釋文件從ensembl數(shù)據庫下載(homo_sapiens.grch37.63.gtf)。(3)差異表達基因的檢測將下載的ensemblgtf文件和通過tophat匹配的原始文件傳輸?shù)絚uffdiff，cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算gtf文件中列出的轉錄本的表達豐度，檢測差異表達。在cuffidff輸出中只有q值＜0.01，測試顯示成功的比較才被認為是差異表達。6、結果rna-seq結果顯示，與正常人相比，冠心病人血液中存在596個差異表達基因。實施例2qpcr實驗驗證冠心病患者和正常人中差異表達的基因1、研究對象：篩選標準同實施例1，冠心病患者和正常人各45例。2、血液中總rna的提取步驟同實施例1。3、逆轉錄用逆轉錄緩沖液對lμg總rna進行逆轉錄合成cdna。采用25μl反應體系，每個樣品取1μg總rna作為模板rna，在pcr管中分別加入以下組分：depc水，5×逆轉錄緩沖液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligodt,200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暫離心。4、qpcr(1)引物設計根據genbank中skil基因和gapdh基因的編碼序列設計qpcr擴增引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。具體引物序列如下：skil基因：正向引物為5’-ttcatctccgcttcttgt-3’(seqidno.1)；反向引物為5’-tgttcttcagtgagttcct-3’(seqidno.2)，gapdh基因：正向引物為5’-gaaggtgaaggtcggagt-3’(seqidno.3)；反向引物為5’-catgggtggaatcatattggaa-3’(seqidno.4)。(2)按照表1配制pcr反應體系：其中，sybrgreen聚合酶鏈式反應體系購自invitrogen公司。表1pcr反應體系試劑體積正向引物1μl反向引物1μlsybrgreen聚合酶鏈式反應體系12.5μl模板2μl去離子水補足25μl(3)pcr反應條件：95℃5min，(95℃15s，60℃40s)*42個循環(huán)。以sybrgreen作為熒光標記物，在lightcycler熒光定量pcr儀上進行pcr反應，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進行相對定量。5、統(tǒng)計學方法結果數(shù)據都是以平均值±標準差的方式來表示，采用spss13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當p<0.05時具有統(tǒng)計學意義。6、結果結果如圖1所示，與正常人相比，冠心病患者血液中skil基因的mrna水平顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。實施例3skil蛋白差異表達檢測1、研究對象同實施例2。2、單核細胞分離無菌采集靜脈血10ml，注入盛肝素的無菌小瓶中，加蓋后立即輕輕搖勻。用無菌吸管加入等體積的hbss(nacl8.0g，na2hpo40.132g，kh2po40.06g，kcl0.4g，酚紅1ml，nahco30.35g，d-葡萄糖1.0g，溶于1000ml雙蒸水)，以降低紅細胞的凝聚。吸取8ml淋巴細胞分層液置50ml離心管中，將稀釋血液沿管壁緩慢加入，保持界面清楚，勿使兩者相混，在20℃2000r/min離心30min，小心吸取分層液與血漿交接部位混濁的灰白色層，即淋巴細胞層，加入另一支離心管中，用5倍體積的hbss洗滌2次，依次以2000r/min、1500r/min在室溫下離心10min，以便去除大部分混雜的血小板，用10ml雙蒸水與細胞團塊混合1min，使殘余紅細胞裂解，然后迅速加入等量1.8％nacl溶液，2000r/min離心，去上清，經細胞計數(shù)后用hbss溶液調整細胞至1×106個/ml備用。3、單核細胞總蛋白質提取將上述實驗所得細胞懸液(濃度為1×106個/ml)室溫1000r/min離心10min，棄上清后加入100μl裂解緩沖液，4℃震蕩1h，用超聲波儀破碎細胞，每次10s，共10次，于4℃12000r/min離心1h；取上清用brandford法定量蛋白，分裝成2.5μg/μl，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?、westernblot檢測將提取的蛋白進行sds-page電泳，之后進行轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色。5、統(tǒng)計學處理將蛋白條帶的灰度值使用imagej軟件進行分析，以β-actin為內參，將目的白條帶的灰度值進行歸一化處理。結果數(shù)據都是以平均值±標準差的方式來表示，采用spss13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當p<0.05時具有統(tǒng)計學意義。6、結果結果如圖2所示，與正常人相比，冠心病患者血液中skil蛋白含量高，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內。sequencelisting<110>程琦<120>skil作為診斷冠心病的分子標志物<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<400>1ttcatctccgcttcttgt18<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<400>2tgttcttcagtgagttcct19<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3gaaggtgaaggtcggagt18<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列<400>4catgggtggaatcatattggaa22當前第1頁12