本發(fā)明屬于法醫(yī)遺傳學(xué)領(lǐng)域,涉及檢測(cè)人類基因組中具有良好法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值的snp遺傳標(biāo)記,具體涉及一種基于高通量并行測(cè)序技術(shù)的273個(gè)snp位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用和檢測(cè)方法。
背景技術(shù):
基于毛細(xì)管電泳技術(shù)(capillaryelectrophoresis,ce)的pcr-str復(fù)合熒光擴(kuò)增檢測(cè)是目前采用的主要技術(shù)手段。其中,str基因座由于多態(tài)性高、檢測(cè)技術(shù)均一等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是法醫(yī)dna鑒定中通用性最高的遺傳標(biāo)記。目前,法醫(yī)學(xué)dna數(shù)據(jù)庫(kù)大部分均圍繞str基因座展開(kāi)。但是,隨著str基因座在法醫(yī)dna分析中的廣泛應(yīng)用,其缺陷也日益受到學(xué)界關(guān)注。如str基因座的高突變率不利于親權(quán)鑒定的結(jié)果解釋;pcr擴(kuò)增子較長(zhǎng)不易實(shí)現(xiàn)對(duì)降解檢材的dna分型;str基因座的數(shù)量有限不利于復(fù)雜親緣關(guān)系的鑒定等;ce技術(shù)中目前可供選擇的熒光素?cái)?shù)量有限,無(wú)法實(shí)現(xiàn)大量str基因座的并行檢測(cè)。
snp(singlenucleotidepolymorphism,單核苷酸多態(tài)性)作為第三代遺傳標(biāo)記,應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐的優(yōu)越性已越發(fā)顯著。與str(自發(fā)突變率為10-3~10-5)相比,snp具有相對(duì)較低的自發(fā)突變率(10-8);而單個(gè)的snp位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物可以控制在200bp以下,容易實(shí)現(xiàn)多個(gè)位點(diǎn)的復(fù)合擴(kuò)增,并有利于降解檢材的分型;二等位基因的特性也使其分型結(jié)果的分析簡(jiǎn)便易行,更加容易完成向自動(dòng)化的轉(zhuǎn)變。然而snp分型采用的技術(shù)平臺(tái)無(wú)論是minisequencing(核心是單堿基延伸)、連接反應(yīng)還是質(zhì)譜分析,均最多只能完成幾十個(gè)遺傳標(biāo)記的并行檢測(cè),獲取有效信息的能力受限。
高通量并行測(cè)序技術(shù)(massivelyparallelsequencing,mps),為解決這一科學(xué)問(wèn)題提供了方法學(xué)上的前景:與傳統(tǒng)的ce技術(shù)相比,mps技術(shù)可以對(duì)多達(dá)幾千個(gè)snp進(jìn)行并行檢測(cè),節(jié)約檢測(cè)樣本量及檢測(cè)時(shí)間;與barcode技術(shù)相結(jié)合,可以對(duì)多樣本并行檢測(cè);文庫(kù)構(gòu)建時(shí)依賴pcr技術(shù),但無(wú)需電泳及熒光標(biāo)記,可將引物設(shè)計(jì)的盡可能短,進(jìn)一步提高降解檢材的分型成功率;對(duì)序列內(nèi)部堿基的深度讀取,可提高法醫(yī)學(xué)混合樣本的分析能力。美國(guó)thermofisherscientific公司在iontorrentpgmtm測(cè)序平臺(tái)已推出兩款商業(yè)化snp檢測(cè)試劑盒,一是用于個(gè)體識(shí)別的“precisionididentitypanel”,試劑盒中共含有124個(gè)snp位點(diǎn),主要針對(duì)歐洲人群,部分位點(diǎn)在中國(guó)人群中多態(tài)性差;另一個(gè)是用于族源信息推斷的“precisionidancestrypanel”,不適用于個(gè)體識(shí)別和親緣鑒定。美國(guó)illumina公司在miseq平臺(tái)上推出可同時(shí)檢測(cè)str和snp遺傳標(biāo)記的檢測(cè)試劑盒forenseqdnasignature,其中含有95個(gè)用于個(gè)體識(shí)別的snp位點(diǎn),24個(gè)用于表型鑒定的位點(diǎn),56個(gè)先祖snp位點(diǎn)。上述snp位點(diǎn)的篩選基于歐洲人群,在中國(guó)人群中檢測(cè)效能受限,同樣無(wú)法滿足法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親緣鑒定的需求。另外,以往針對(duì)法醫(yī)學(xué)snp位點(diǎn)的研究及相關(guān)專利申請(qǐng),均集中于最多幾十個(gè)snp的檢測(cè)體系構(gòu)建,且集中針對(duì)一類染色體進(jìn)行標(biāo)記的檢測(cè)(常染色體,x染色體或者y染色體)。
因此,建立一套針對(duì)中國(guó)人群并覆蓋人類全基因組的高多態(tài)性snp檢測(cè)體系,用于滿足個(gè)體識(shí)別及親權(quán)鑒定的需求,并為復(fù)雜疑難案件的解決提供更多的技術(shù)檢測(cè)手段具有重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷,提供一種基于高通量測(cè)序平臺(tái)的可同時(shí)檢測(cè)273個(gè)覆蓋人類基因組snp遺傳標(biāo)記的檢測(cè)試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一方面,本發(fā)明提供一種基于高通量測(cè)序的snp位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒,該檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)273個(gè)snp位點(diǎn),其中所述273個(gè)snp位點(diǎn)中的234個(gè)位于常染色體上、9個(gè)位于y染色體上、30個(gè)位于x染色體上。
為了進(jìn)一步優(yōu)化上述技術(shù)方案,本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括:
優(yōu)選地,所述273個(gè)snp位點(diǎn)信息如表1所示。
優(yōu)選地,該檢測(cè)試劑盒包含由273個(gè)snp位點(diǎn)的引物對(duì)的引物組合物,所述引物組合物的序列如seqidno:1-seqidno:546所示。該snp位點(diǎn)的擴(kuò)增引物序列如表2所示。
表1:本試劑盒中所包含的snp位點(diǎn)信息
表2:本試劑盒中273個(gè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增引物序列
優(yōu)選地,該檢測(cè)試劑盒還包括自行編寫(xiě)的bed文件,所述bed文件用于snp位點(diǎn)的結(jié)果分析;該bed文件可用于高通量測(cè)序儀測(cè)序軟件(或插件)使用,或采用自行編寫(xiě)插件進(jìn)行273個(gè)snp位點(diǎn)的分型。該bed文件如下:
另一方面,本發(fā)明提供一種上述snp位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒在三聯(lián)體親子鑒定、二聯(lián)體親子鑒定、祖孫鑒定、同胞鑒定以及個(gè)體識(shí)別司法鑒定領(lǐng)域中的應(yīng)用。
最后,本發(fā)明還提供一種上述snp位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法,包括如下步驟:
步驟1)取樣本dna于pcr擴(kuò)增體系中,采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建;
步驟2)對(duì)步驟1)中構(gòu)建的文庫(kù)進(jìn)行純化和定量;
步驟3)對(duì)步驟2)定量后的文庫(kù)進(jìn)行接頭和測(cè)序引物的連接;
步驟4)對(duì)步驟3)制備的文庫(kù)在高通量測(cè)序平臺(tái)完成測(cè)序;
步驟5)采集測(cè)序信號(hào),采用自行編寫(xiě)的bed文件對(duì)步驟4)獲取的測(cè)序文件進(jìn)行質(zhì)控及結(jié)果分析。
為了進(jìn)一步優(yōu)化上述技術(shù)方案,本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括:
優(yōu)選地,所述樣本dna采集于血液(斑)、唾液(斑)、精液(斑)、毛發(fā)、組織等人類生物檢材;或者,可選的,所述樣本dna為標(biāo)準(zhǔn)品,如女性標(biāo)準(zhǔn)品dna9947a,男性標(biāo)準(zhǔn)品9948等。
優(yōu)選地,所述步驟1)中pcr擴(kuò)增體系包括pcr反應(yīng)緩沖液、如seqidno:1-seqidno:546所示序列的引物組合物、taq聚合酶以及去離子水。
優(yōu)選地,所述步驟1)中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性11min;94℃30s,60℃60s,70℃60s,22個(gè)循環(huán);60℃延伸30min。
優(yōu)選地,所述步驟2)中的純化采用ampure磁珠完成,所述步驟2)中的定量可采用qubit或qpcr方式。
優(yōu)選地,所述步驟4)中的高通量測(cè)序平臺(tái)包括iontorrent或者miseq。
優(yōu)選地,所述步驟5)中的結(jié)果分析為針對(duì)fasta格式測(cè)序信息采用自行編寫(xiě)插件進(jìn)行273個(gè)snp位點(diǎn)的結(jié)果分型。
本發(fā)明所述試劑盒包含的273個(gè)snp位點(diǎn)分別位于常染色體(234個(gè))、y染色體(9個(gè))、x染色體(30個(gè)),在中國(guó)主要人群中均具有良好的遺傳多態(tài)性和個(gè)體識(shí)別能力,其中常染色體snp位點(diǎn)在各染色體上平均分配,位點(diǎn)之間的平均物理距離約為10mb。靈敏度檢測(cè)顯示,10-1ngdna進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建時(shí),分型成功率為100%。試劑盒中含有的234個(gè)常染色體snp位點(diǎn)組成的檢測(cè)系統(tǒng)用于個(gè)體識(shí)別的累積個(gè)體識(shí)別率為1-1.49e-62,用于二聯(lián)體親權(quán)鑒定的累積非父排除率為1-2.98e-12,用于三聯(lián)體親權(quán)鑒定的累積非父排除率為1-3.51e-23,非常適合在法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親緣鑒定中應(yīng)用。
本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:
(一)試劑盒中snp位點(diǎn)的選擇原則
(1)篩選snp數(shù)據(jù)庫(kù):hapmap(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)、1000genomes(http://www.1000genomes.org/home)、dbsnp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)、snpforid52-plex在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://spsmart.cesga.es/snpforid.php);司法鑒定技術(shù)規(guī)范《法醫(yī)snp分型與應(yīng)用規(guī)范sf/zjd0105003-2015》、已發(fā)表的關(guān)于亞洲或者中國(guó)漢族人群的snp研究文獻(xiàn);
(2)根據(jù)hapmap數(shù)據(jù)庫(kù)(#28,phases2&3)篩選在北京漢族人群(chb)中maf>0.3,位于內(nèi)含子區(qū)域的常染色體snp位點(diǎn);要求snp符合hardy-weinberg平衡定量;與數(shù)據(jù)庫(kù)中其它10個(gè)人群(asw、ceu、chd、gih、jpt、lwk、mex、mkk、tsi和yri)的遺傳差異小(fst<0.06);
(3)候選snp位點(diǎn)間物理距離>5mb;與目前中國(guó)市場(chǎng)已有商業(yè)化試劑盒中包含的str基因座之間物理距離>5mb;位點(diǎn)不落在拷貝數(shù)變異區(qū)域(copynumbervariants,cnv);位點(diǎn)側(cè)翼序列(±120bp)的gc含量在30-60%之間;側(cè)翼序列(±15bp)不含有多聚堿基及插入缺失遺傳標(biāo)記(insertion/deletion,indel)。
(二)文庫(kù)構(gòu)建
各snp位點(diǎn)的文庫(kù)構(gòu)建引物序列見(jiàn)表2。文庫(kù)的構(gòu)建采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),反應(yīng)體系為20μl。文庫(kù)構(gòu)建條件:95℃預(yù)變性11min;94℃30s,60℃60s,70℃60s,22個(gè)循環(huán);60℃延伸30min。
(三)測(cè)序及數(shù)據(jù)分析
構(gòu)建文庫(kù)完成純化和定量后,連接接頭及測(cè)序引物,根據(jù)檢測(cè)樣本量選擇在高通量測(cè)序平臺(tái)(美國(guó)thermofisherscientific公司的iontorrent或者美國(guó)illumina公司的miseq)完成測(cè)序;
采用自行編寫(xiě)的bed文件進(jìn)行質(zhì)控及結(jié)果分析。
與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明提供了一種基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)人類基因組273個(gè)snp位點(diǎn)進(jìn)行并行檢測(cè)的試劑盒,包括文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序質(zhì)控及結(jié)果分析等。本發(fā)明利用了高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)snp位點(diǎn)進(jìn)行并行測(cè)序,在讀取位點(diǎn)信息的同時(shí)可以獲取側(cè)翼序列變異信息;單次測(cè)序可以獲取多達(dá)384個(gè)樣本在273個(gè)snp位點(diǎn)的序列信息,節(jié)約dna樣本量及檢測(cè)時(shí)間;片段文庫(kù)集中于200bp以下,適用于法醫(yī)學(xué)降解檢材。
附圖說(shuō)明
圖1為編寫(xiě)插件對(duì)高通量測(cè)序snp位點(diǎn)的分析結(jié)果。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明所述的snp位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒的主要成分包括:pcr擴(kuò)增體系和樣本dna(可為標(biāo)準(zhǔn)品dna9947a、標(biāo)準(zhǔn)品dna9948),pcr擴(kuò)增體系具體包括2.5×pcr反應(yīng)緩沖液ⅱ(ris-hcl、kcl、mgcl2、dntp)、5×引物組合物(273個(gè)snp位點(diǎn)的文庫(kù)構(gòu)建引物對(duì),序列為seqidno:1-seqidno:546所示)、taq聚合酶(具有熱穩(wěn)定性的dna聚合酶)以及去離子水。文庫(kù)構(gòu)建體系包含5μl2.5×pcr反應(yīng)緩沖液ⅱ、2μl5×引物組合物,2utaq聚合酶,10ng-1ng的樣本dna(可為1μl標(biāo)準(zhǔn)品dna9947a(10ng/μl)或1μl標(biāo)準(zhǔn)品dna9948(10ng/μl))以及11μl去離子水。其中,273個(gè)snp位點(diǎn)的位點(diǎn)信息如上述表1所示,273個(gè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增引物序列如上述表2所示。
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例,對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案,而不能以此來(lái)限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1
本實(shí)施例為標(biāo)準(zhǔn)品dna9948的分型結(jié)果。
其檢測(cè)方法如下:
步驟1)取1μl標(biāo)準(zhǔn)品dna9948(10ng/μl)進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建,pcr體系為20μl,其中含5μl2.5×pcr反應(yīng)緩沖液ⅱ,2μl5×引物混合物,1μltaq聚合酶(2u),1μl標(biāo)準(zhǔn)品dna9948及11μl去離子水。文庫(kù)構(gòu)建pcr條件:95℃預(yù)變性11min;94℃30s,60℃60s,70℃60s,22個(gè)循環(huán);60℃延伸30min。
步驟2)對(duì)步驟1)構(gòu)建的文庫(kù)進(jìn)行純化和定量。純化采用ampure磁珠完成,定量可采用qubit或qpcr方式。本次采用qpcr完成文庫(kù)定量。
步驟3)對(duì)步驟2)定量后文庫(kù)進(jìn)行接頭和測(cè)序引物的連接。
步驟4)對(duì)步驟3)制備的文庫(kù)在高通量測(cè)序平臺(tái)(美國(guó)thermofisherscientific公司的iontorrent或美國(guó)illumina公司的miseq)完成測(cè)序。
步驟5)采集測(cè)序信號(hào),采用自行編寫(xiě)的bed文件對(duì)步驟4)獲取的測(cè)序文件進(jìn)行質(zhì)控及結(jié)果分析;其具體為針對(duì)fasta格式測(cè)序信息采用自行編寫(xiě)插件進(jìn)行273個(gè)snp位點(diǎn)的結(jié)果分型。分析插件包含snp測(cè)序質(zhì)控,其結(jié)果如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)品dna9948分型結(jié)果見(jiàn)下表,可用于其它實(shí)驗(yàn)室參考。
實(shí)施例2
本實(shí)施例為本發(fā)明所述的snp位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒在三聯(lián)體親緣鑒定疑似突變現(xiàn)象中的應(yīng)用。
一例三聯(lián)體親緣檢測(cè)案件,涉及生母-孩子(女)-可疑父。采用實(shí)施例1所述的檢測(cè)方法操作。
基于ce技術(shù)的str檢測(cè)結(jié)果:采用常規(guī)pcr-ce檢測(cè)試劑盒g(shù)oldeye20a(北京基點(diǎn)認(rèn)知生物有限公司)對(duì)19個(gè)常染色體str基因座進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)生母與孩子在19個(gè)str基因座上完全符合孟德?tīng)栠z傳定律,可疑父與孩子在2個(gè)str基因座(vwa和fga)發(fā)生一步突變。通過(guò)計(jì)算,累積親權(quán)指數(shù)cpi為378.361,根據(jù)三聯(lián)體親子鑒定標(biāo)準(zhǔn),無(wú)法判斷可疑父與孩子之間存在親子關(guān)系。補(bǔ)充檢測(cè)其他3個(gè)輔助str檢測(cè)商業(yè)化試劑盒(goldeye18nc檢測(cè)試劑盒、agcu21+1檢測(cè)試劑盒、investigatorhdplex檢測(cè)試劑盒)對(duì)28個(gè)新增常染色體str基因座進(jìn)行分型檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)新增str基因座d3s4529基因座發(fā)生一步突變。即共檢測(cè)47個(gè)str基因座中發(fā)現(xiàn)3個(gè)str基因座(vwa、fga、d3s4529)發(fā)生一步突變。
基于mps技術(shù)的snp檢測(cè)結(jié)果:采用該試劑盒對(duì)上述涉案樣本進(jìn)行及高通量測(cè)序檢測(cè),結(jié)果表明,三個(gè)樣本在234個(gè)常染色體snp位點(diǎn)的分型結(jié)果均符合孟德?tīng)栠z傳定律,孩子(女)與可疑父在30個(gè)x-snp位點(diǎn)的結(jié)果符合x(chóng)染色體遺傳標(biāo)記遺傳定律,結(jié)果見(jiàn)下表。
實(shí)施例3
本實(shí)施例為本發(fā)明所述的snp位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒在50名無(wú)關(guān)個(gè)體中的法醫(yī)學(xué)檢測(cè)效能。
采用實(shí)施例1所述的檢測(cè)方法對(duì)50名無(wú)關(guān)個(gè)體血液樣本進(jìn)行檢測(cè)。50名個(gè)體為志愿者。
結(jié)果:
(1)50名個(gè)體在234個(gè)常染色體snp位點(diǎn)及30個(gè)x-snp位點(diǎn)均得到完整分型,其中25名男性個(gè)體在9個(gè)y-snp位點(diǎn)得到完整分型。
(2)根據(jù)50名無(wú)關(guān)個(gè)體在273個(gè)snp位點(diǎn)的頻率數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)234個(gè)常染色體snp位點(diǎn)相互獨(dú)立,用于個(gè)體識(shí)別的累積個(gè)體識(shí)別率為1-1.49e-62,用于二聯(lián)體親權(quán)鑒定的累積非父排除率為1-2.98e-12,用于三聯(lián)體親權(quán)鑒定的累積非父排除率為1-3.51e-23,可以滿足實(shí)際工作需求。30個(gè)x-snp位點(diǎn)的檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示,在女性群體中的累積個(gè)體識(shí)別率為1-1.13738e-12,在男性群體中的累積個(gè)體識(shí)別率為1-6.23849e-09。9個(gè)y-snp在25名男性個(gè)體中共發(fā)現(xiàn)6種單倍型。以上x(chóng)-snp和y-snp位點(diǎn)的遺傳信息可以親緣關(guān)系的判斷提供更豐富的信息。
以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述,但其只作為范例,本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言,任何對(duì)該實(shí)用進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此,在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改,都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
sequencelisting
<110>司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所
<120>一種基于高通量測(cè)序的snp位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
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