本發(fā)明涉及蔬菜加工與食品生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于16srdna測(cè)序的泡菜發(fā)酵劑定向制備方法。

背景技術(shù)：

泡菜是我國(guó)傳統(tǒng)腌制蔬菜中的一大類別，其歷史可追溯到2000多年以前。千百年來(lái)，泡菜以其酸鮮純正、脆嫩芳香、清爽可口，自然本色、醇厚綿長(zhǎng)、解膩開(kāi)胃、促消化增食欲等品位及功效吸引著業(yè)內(nèi)人士和眾多中外消費(fèi)者。但泡菜是我國(guó)從簡(jiǎn)陋的作坊式模式發(fā)展起來(lái)的發(fā)酵蔬菜加工產(chǎn)品，一家一戶的自然發(fā)酵制作模式代表了它的古老和傳統(tǒng)，及成敗由天的自然發(fā)酵模式又十分現(xiàn)實(shí)地表明了其制作過(guò)程處在不可控或可控性較差的制作環(huán)境之中。純?nèi)樗峋臃N使泡菜工業(yè)的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝發(fā)生了變革，能推動(dòng)了泡菜工業(yè)的發(fā)展。在保持傳統(tǒng)泡菜優(yōu)良品質(zhì)的基礎(chǔ)之上，應(yīng)用直投式乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵泡菜具有以下優(yōu)勢(shì)：1)所接乳酸菌能快速成為優(yōu)勢(shì)菌種，且采用低鹽工藝，產(chǎn)品含鹽量低，不產(chǎn)生高鹽污水；2)ph降低，酸度增加，有利于產(chǎn)品保存；3)縮短了發(fā)酵周期，提高了產(chǎn)品的成熟度；4)蔬菜色澤穩(wěn)定，亮度提高；5)發(fā)酵不受氣候及季節(jié)影響；6)能降低亞硝酸鹽等有害物質(zhì)的含量，確保食品安全；7)可以直接向?qū)I(yè)生產(chǎn)廠家購(gòu)買(mǎi)作為生產(chǎn)發(fā)酵劑使用，在發(fā)酵生產(chǎn)中省略了發(fā)酵劑的制備工序，減少了生產(chǎn)車間的投資和空間，降低了生產(chǎn)成本；8)無(wú)雜菌污染防止了菌種的退化；9)生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)模化，能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模的批量生產(chǎn)。

泡菜的腌制過(guò)程是微生物的發(fā)酵過(guò)程。正是利用微生物的發(fā)酵原理，泡菜在自然發(fā)酵過(guò)程中，豐富的微生物菌群對(duì)泡菜制品的保藏和形成各自獨(dú)特的風(fēng)味起到很大的作用。起發(fā)酵作用主要的微生物為乳酸菌，包括乳桿菌屬、片球菌屬、明串株菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬。但由于一些菌群的不可培養(yǎng)性或較差重復(fù)性，導(dǎo)致傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方式難以全面、客觀地反映泡菜鹽漬過(guò)程中的菌群結(jié)構(gòu)和變化，因此目前根據(jù)傳統(tǒng)分離培養(yǎng)所制得的發(fā)酵劑生產(chǎn)的泡菜難以真正反映其風(fēng)味與品質(zhì)，出現(xiàn)了風(fēng)味單一、發(fā)酵味不醇厚等問(wèn)題。另外，傳統(tǒng)微生物種類鑒定的方法一般采用表型特征鑒定，但此法存在操作步驟繁瑣、工作量大、周期長(zhǎng)、某些檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定等問(wèn)題。因此，根據(jù)不同蔬菜的發(fā)酵特性，尋找更為優(yōu)良、有效的發(fā)酵劑制備方法對(duì)于傳統(tǒng)蔬菜加工方式意義重大。

隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，傳統(tǒng)的微生物鑒定方法常常難以鑒定眾多的生長(zhǎng)習(xí)性復(fù)雜的微生物，因而基于基因組序列的分子鑒定受到廣泛關(guān)注。在細(xì)菌基因組中，編碼16srrna的rdna基因具有良好的進(jìn)化保守性，適宜分析的長(zhǎng)度(約為1540bp)，以及與進(jìn)化距離相匹配的良好變異性，所以成為細(xì)菌分子鑒定的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)識(shí)序列。16srdna序列分析的一個(gè)顯著特點(diǎn)是能及時(shí)鑒定出生長(zhǎng)緩慢或生化反應(yīng)惰性的細(xì)菌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)傳統(tǒng)直投發(fā)酵劑存在發(fā)酵制品風(fēng)味單一等問(wèn)題，提出了一種基于16srdna測(cè)序的泡菜發(fā)酵劑定向制備方法，該方法可定向篩選出主導(dǎo)漬菜鹽漬及鹽漬風(fēng)味、品質(zhì)的不同乳酸菌屬，特異性和目標(biāo)導(dǎo)向性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，不必反復(fù)純化。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，發(fā)明人提供如下技術(shù)方案：

一種基于16srdna測(cè)序的泡菜發(fā)酵劑定向制備方法，至少包括以下步驟：

(1)于泡菜老鹵水中取樣，樣品置于無(wú)菌冷凍管中，立即放入液氮中保存，然后置于超低溫冰箱中，

(2)提取樣品dna并做瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后做pcr，擴(kuò)增16srdna，所述的pcr擴(kuò)增的特異性引物的上游引物515f具有如seqidno.1所示的核苷酸序列(5’-gtgccagcmgccgcgg-3’)，特異性引物的下游引物907r具有如seqidno.2所示的核苷酸序列(5’-ccgtcaattcmtttragttt-3’)，pcr擴(kuò)增區(qū)域?yàn)槲⑸?6srdna的v4-v5可變區(qū)域，測(cè)序前需對(duì)所述pcr產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，

(3)將步驟(2)獲得的pcr產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序并做比對(duì)分析，確定優(yōu)勢(shì)菌群種類與組成比例，

(4)優(yōu)勢(shì)菌株的定向篩選(參考《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)(gb4789.35-2010)方法》以及《乳酸細(xì)菌分離鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》實(shí)施)，將所篩選的菌株分子生物學(xué)鑒定(圖1)，序列同源性須達(dá)到99％，

(5)定向篩選菌株的高密度增殖培養(yǎng)，

(6)離心并冷凍干燥，

將步驟(5)經(jīng)高密度增值培養(yǎng)的菌液經(jīng)冷凍離心，去除上清培養(yǎng)液，收集試管底部菌體；收集的菌體加入凍干保護(hù)劑后做冷凍干燥，其中：菌體與凍干保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1:2-1:4.5，

(7)將步驟(6)得到的各定向篩選和高密度增值培養(yǎng)的菌株冷凍干燥粉按照16srdna測(cè)序確定的優(yōu)勢(shì)菌群種類與組成比例混合，制得泡菜專用直投式發(fā)酵劑。

作為優(yōu)選方案，根據(jù)本發(fā)明所述的一種基于16srdna測(cè)序的泡菜發(fā)酵劑定向制備方法，其中，所述的步驟(4)優(yōu)勢(shì)菌株的定向篩選按如下操作：在所述步驟(1)的所取樣品中，取1ml液體于生理鹽水中進(jìn)行10倍的梯度稀釋，均勻涂布在定向培養(yǎng)基上，然后在35～37℃恒溫箱中定向培養(yǎng)36～72h，觀察菌落；然后將定向培養(yǎng)的菌株進(jìn)行生理生化特征鑒定實(shí)驗(yàn)；根據(jù)鑒定結(jié)果，將定向篩選后的菌株進(jìn)行斜面培養(yǎng)。

作為優(yōu)選方案，根據(jù)本發(fā)明所述的一種基于16srdna測(cè)序的泡菜發(fā)酵劑定向制備方法，其中，所述的步驟(5)定向篩選菌株的高密度增殖培養(yǎng)按如下步驟操作：將上述步驟(4)定向篩選與純化培養(yǎng)的菌株進(jìn)行高密度增值培養(yǎng)，高密度增值培養(yǎng)基為乳酸菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為35～37℃恒溫箱中培養(yǎng)48～72h；所述的乳酸菌培養(yǎng)基配方為：蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母膏5g，吐溫80(tween80)0.5ml，糖或醇10g，酵母粉5g，瓊脂5～6g，蒸餾水(1000ml)；加熱溶解后，校正ph＝6.2～7.2，121℃高壓滅菌15～20分鐘。

作為優(yōu)選方案，根據(jù)本發(fā)明所述的一種基于16srdna測(cè)序的泡菜發(fā)酵劑定向制備方法，其中，所述的步驟(6)中將步驟(5)經(jīng)高密度增值培養(yǎng)的菌液，搖勻后以4000-5000rpm轉(zhuǎn)速于-5～10℃條件下離心25-30分鐘。

作為優(yōu)選方案，根據(jù)本發(fā)明所述的一種基于16srdna測(cè)序的泡菜發(fā)酵劑定向制備方法，其中，所述的步驟(6)中凍干保護(hù)劑配方為：脫脂乳25-30克、淀粉8-10克，丙三醇5-8克、維生素c5-6.5克、d-山梨醇5-7.2克、l-谷氨酸5-6克和蒸餾水250ml；凍干保護(hù)劑加熱溶解后，121℃高壓滅菌15-20分鐘后備用。

作為優(yōu)選方案，根據(jù)本發(fā)明所述的一種基于16srdna測(cè)序的泡菜發(fā)酵劑定向制備方法，其中，所述的步驟(6)中冷凍干燥的主要工藝參數(shù)為：-50～-70℃預(yù)凍12-24h后，-60～80℃凍干24-72h。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

(1)與采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)制備的傳統(tǒng)發(fā)酵劑相比，本發(fā)明通過(guò)高通量測(cè)序鑒定微生物菌群的16srdna，能準(zhǔn)確的獲得泡菜自然發(fā)酵后詳細(xì)微生物群落結(jié)構(gòu)與組成比例，并確定主要的乳酸菌菌群，從而準(zhǔn)確的判斷不同微生物菌群對(duì)泡菜自然發(fā)酵進(jìn)程與制品品質(zhì)的影響。所使用的目標(biāo)菌種具有多樣性、特異性，避免了傳統(tǒng)發(fā)酵劑菌種單一、菌群良莠不齊、非特異性等缺點(diǎn)。

(2)本發(fā)明定向制備獲得的泡菜專用發(fā)酵劑具有特異性與目標(biāo)導(dǎo)向性特征。根據(jù)不同地方泡菜加工的不同工藝及品質(zhì)、風(fēng)味需求，通過(guò)配比菌種構(gòu)成提高發(fā)酵效率，產(chǎn)物穩(wěn)定、風(fēng)味相似(圖2和圖3)，避免了傳統(tǒng)發(fā)酵劑發(fā)酵過(guò)程中所導(dǎo)致的發(fā)酵風(fēng)味不純的缺點(diǎn)。

(3)與傳統(tǒng)篩選方法制備的發(fā)酵劑相比，一種基于16srdna測(cè)序的泡菜發(fā)酵劑定向制備方法在發(fā)酵劑制備過(guò)程中，菌種專一性強(qiáng)、活性高，所制得的發(fā)酵劑干粉易于儲(chǔ)藏與運(yùn)輸。

附圖說(shuō)明

圖1泡菜樣品16srrna基因pcr擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜。

圖2自然發(fā)酵泡菜氣相色譜總離子流圖。

圖3本發(fā)明泡菜專用發(fā)酵劑氣相色譜總離子流圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，更具體地說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。

在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設(shè)備和原料等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本行業(yè)常用的。若無(wú)特別指明，實(shí)施例采用的方法為本領(lǐng)域通用技術(shù)。

實(shí)施例1

一種基于16srdna測(cè)序的泡菜發(fā)酵劑定向制備方法，按以下步驟進(jìn)行：

(1)于泡菜壇中取樣。采集后混勻，置于15ml的無(wú)菌冷凍管中，立即放入液氮中保存，然后置于-70℃超低溫冰箱中。

(2)將步驟(1)采集的樣品用dna提取試劑盒提取微生物的脫氧核糖核酸(英文縮寫(xiě)dna)，所有樣品的dna提取步驟均參照dna提取試劑盒說(shuō)明書(shū)。對(duì)提取到的樣品基因組dna進(jìn)行3％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

(3)將步驟(2)提取的dna用特異性引物進(jìn)行pcr，擴(kuò)增微生物的16srdna，特異性引物的上游引物515f具有如seqidno.1所示的核苷酸序列(5’-gtgccagcmgccgcgg-3’)、下游引物907r具有如seqidno.2所示的核苷酸序列(5’-ccgtcaattcmtttragttt-3’)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(即pcr)擴(kuò)增區(qū)域?yàn)槲⑸?6srdna的v4-v5可變區(qū)域，測(cè)序前對(duì)所述pcr產(chǎn)物進(jìn)行回收純化。

(4)將步驟(3)獲得的pcr產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序。篩選測(cè)序所得數(shù)據(jù)并與已有數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行序列比對(duì)，獲得菌群的可操作分類單元(otus)；且與現(xiàn)有16sv4-v5數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。根據(jù)標(biāo)簽序列和reads，泡菜中乳桿菌屬(lactobacillus)占有比例為58.7％，分別為：清酒乳桿菌(lactobacillussakei)(核苷酸序列如seqidno.3所示)、戊糖乳桿菌(lactobacilluspentosus)(核苷酸序列如seqidno.4所示)、短乳桿菌(lactobacillusbrevis)(核苷酸序列如seqidno.5所示)、植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)(核苷酸序列如seqidno.6所示)，比例分別為：31.6％、10.9％、11.8％、4.4％；片球菌屬(pediococcus)占有比例為18.1％：主要為戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus)(核苷酸序列如seqidno.7所示)；魏斯氏菌屬(weissellas)占有比例為3.7％：主要為魏斯氏菌(weissellasoli)(核苷酸序列如seqidno.8所示)。

(5)乳桿菌屬的定向篩選：

(5.1)清酒乳桿菌(lactobacillussakei)的定向篩選：在上述步驟(1)的所取樣品中，取1ml液體于生理鹽水中進(jìn)行10倍的梯度稀釋，均勻涂布在mrs培養(yǎng)基，然后在35～37℃恒溫箱中培養(yǎng)48～72h，觀察菌落。挑選出呈乳白色、圓形光滑的單菌落，進(jìn)行斜面培養(yǎng)48～72h；接入液體mrs培養(yǎng)基培養(yǎng)48～60h。改良mrs瓊脂培養(yǎng)基配方為：蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母膏5g，吐溫80(tween80)0.5ml，糖或醇10g，酵母粉5g，k2hpo42g，檸檬酸二銨2g，mgso4·7h2o0.48g，na2co310g，nacl2g，瓊脂15～20g，蒸餾水(自來(lái)水)1000ml，加入1.6％溴甲酚紫溶液約1.4ml加熱溶解后，校正ph為6.2，121℃高壓滅菌15～20分鐘。

將篩選的菌株進(jìn)行生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)，符合以下結(jié)果：

(5.2)戊糖乳桿菌(lactobacilluspentosus)的定向篩選：在上述步驟(1)的所取樣品中，取1ml液體于生理鹽水中進(jìn)行10倍的梯度稀釋，均勻涂布在改良mrs平板上，30℃有氧培養(yǎng)48h。挑取有溶鈣圈的單菌落，平板劃線反復(fù)分離純化，經(jīng)革蘭氏染色確定為純化的革蘭氏陽(yáng)性桿菌菌株。改良mrs瓊脂培養(yǎng)基配方為：20g/l玉米漿干粉、牛肉膏5.0克、酵母粉4.0克、葡萄糖20.0克、吐溫801.0毫升、磷酸氫二鉀2.0克、乙酸鈉5.0克、檸檬酸三胺2.0克、硫酸鎂0.2克；硫酸錳0.05克、瓊脂粉15.0克和蒸餾水1升；加熱溶解后，校正ph為6.2，121℃高壓滅菌15～20分鐘。在mrs固體培養(yǎng)基中加入0.75％碳酸鈣，滅菌后放入60℃恒溫水浴中備用，用前加入0.1％納他霉素。

將活化后的菌株，按2％接菌量接入乳酸菌培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，30℃有氧培養(yǎng)48h。然后篩選進(jìn)行生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)，符合以下結(jié)果：

(5.3)植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)的定向篩選：在上述步驟(1)的所取樣品中，取1ml液體于生理鹽水中進(jìn)行10倍的梯度稀釋，均勻涂布在定向mrs培養(yǎng)基上，于35～37℃恒溫箱中培養(yǎng)48～72h，觀察菌落，挑選出有溶鈣圈、呈乳白色、不透明、圓形光滑的單菌落，在mrs平板上劃線培養(yǎng)48～72h；斜面培養(yǎng)后，接入液體培養(yǎng)mrs培養(yǎng)48～72h。mrs瓊脂培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10.0克、牛肉膏5.0克、酵母粉4.0克、葡萄糖20.0克、吐溫801.0毫升、磷酸氫二鉀2.0克、乙酸鈉5.0克、檸檬酸三胺2.0克、硫酸鎂0.2克；硫酸錳0.05克、1％碳酸鈣、0.05‰的納他霉素、瓊脂粉15.0克和蒸餾水1升；加熱溶解后，校正ph為6.2，121℃高壓滅菌15～20分鐘。

將篩選的菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，符合以下結(jié)果：

(5.4)短乳桿菌(lactobacillusbrevis)的定向篩選：在上述步驟(1)的所取樣品中，取1ml液體于生理鹽水中進(jìn)行10倍的梯度稀釋，均勻涂布在mrs改良培養(yǎng)基，然后在37℃恒溫箱中培養(yǎng)48h，觀察菌落，挑選出呈乳白色、不透明、圓形光滑的單菌落，在mrs改良培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)48h。斜面培養(yǎng)后，接入液體mrs改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h。mrs改良培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫二銨2g和蒸餾水1000ml。溶解后，校正ph為6.5，121℃高壓滅菌15～20分鐘。

將篩選的菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，符合以下結(jié)果：

(6)片球菌屬的定向篩選：

戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus)的定向篩選：

取步驟(1)中1ml液體于生理鹽水中進(jìn)行10倍的梯度稀釋，均勻涂布在mrs十0.5％caco3培養(yǎng)基上，挑取菌落四周有明顯的透明圈、斜嵌于培養(yǎng)基內(nèi)的呈菱形、生長(zhǎng)在表面的呈規(guī)則的圓形、白色扁平的菌落。mrs培養(yǎng)基同(5.2)。菌落經(jīng)革蘭氏染色為陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)為陰性，經(jīng)亞甲藍(lán)單染色后與光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞球狀，四聯(lián)或成片狀排列。

將篩選的菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，符合以下結(jié)果：

(7)魏斯氏菌屬的定向篩選：

魏斯氏菌(weissellasoli)的定向篩選：

取步驟(1)中1ml液體于生理鹽水中進(jìn)行10倍的梯度稀釋，均勻涂布在mrs十0.5％caco3培養(yǎng)基上，挑取有溶鈣圈、白色圓形、黏稠、表面光滑，有光澤、邊緣整齊的菌落；在mrs平板上反復(fù)劃線直至觀察菌落形態(tài)大小一致表明已純化，純化后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢和過(guò)氧化氫接觸酶實(shí)驗(yàn)，選取革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫接觸酶陰性的菌株。

將篩選的菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，符合以下結(jié)果：

(8)將步驟(5)-(7)所篩選的菌株進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純化后pcr，序列同源性達(dá)到99％，如圖1所示。

(9)定向篩選菌株的高密度增殖培養(yǎng)。將步驟(5)、(6)、(7)定向篩選與純化培養(yǎng)的清酒乳桿菌、戊糖乳桿菌、短乳桿菌、植物乳桿菌、戊糖片球菌、魏斯氏菌進(jìn)行高密度增值培養(yǎng)，高密度增值培養(yǎng)基為mrs瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為35～37℃恒溫箱中培養(yǎng)48～72h；所述的乳酸菌培養(yǎng)基配方為：蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母膏5g，吐溫80(tween80)0.5ml，糖或醇10g，酵母粉5g，瓊脂5～6g，蒸餾水(1000ml)；加熱溶解后，校正ph＝6.2～7.2，121℃高壓滅菌15～20分鐘。

(10)定向篩選菌株的收集：將步驟(9)得到的經(jīng)高密度增值培養(yǎng)的菌液，加入3.5％經(jīng)高溫滅菌的脫脂奶粉，搖勻后以5000rpm轉(zhuǎn)速于-5℃條件下離心30分鐘，去除上清培養(yǎng)液，收集試管底部菌體。

(11)直投式發(fā)酵劑的冷凍干燥。將步驟(10)收集的菌體加入凍干保護(hù)劑，凍干保護(hù)劑配方為：脫脂乳30克、淀粉10克，丙三醇5克、維生素c5克、d-山梨醇5克、l-谷氨酸5克和蒸餾水250ml。凍干保護(hù)劑加熱溶解后，121℃高壓滅菌20分鐘。菌體與凍干保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1:4.5。冷凍干燥條件為：-70℃預(yù)凍24h后，-80℃凍干24h。

(12)泡菜專用直投式發(fā)酵劑的制備。按照16srdna測(cè)序結(jié)果所確認(rèn)的乳酸菌的組成，將上述的凍干清酒乳桿菌、戊糖乳桿菌、短乳桿菌、植物乳桿菌、戊糖片球菌、魏斯氏菌按照比例31.6％、10.9％、11.8％、4.4％、18.1％、3.7％混合，制得泡菜專用直投式發(fā)酵劑。經(jīng)檢測(cè)，活菌含量為10¹⁰～10¹³cfu/g。

將本發(fā)明制得的泡菜專用直投式發(fā)酵劑用于腌制，與自然發(fā)酵的泡菜比較，經(jīng)固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用方法分析其風(fēng)味，發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)性風(fēng)味基本一致，結(jié)果如圖2和圖3所示。

實(shí)施例2

其他同實(shí)施例1，不同之處在于：

步驟(7)：將步驟(6)得到的經(jīng)高密度增值培養(yǎng)的菌液，加入2.7％經(jīng)高溫滅菌的脫脂奶粉，搖勻后以4000rpm轉(zhuǎn)速于10℃條件下離心25分鐘，去除上清培養(yǎng)液，收集試管底部菌體。

步驟(8)直投式發(fā)酵劑的冷凍干燥。將步驟(7)收集的菌體加入凍干保護(hù)劑，凍干保護(hù)劑配方為：脫脂乳26克、淀粉8克，丙三醇8克、維生素c6.5克、d-山梨醇7.2克、l-谷氨酸6克和蒸餾水250ml；凍干保護(hù)劑加熱溶解后，121℃高壓滅菌15分鐘后備用。菌體與凍干保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1:2.5。冷凍干燥條件為：-50℃預(yù)凍12h后，-60℃凍干72h。

經(jīng)檢測(cè)，本實(shí)施例與實(shí)施例1達(dá)到同樣技術(shù)效果，不再贅述。

sequencelisting

<110>浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120>一種基于16srdna測(cè)序的泡菜發(fā)酵劑定向制備方法

<130>z171136

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