本申請(qǐng)涉及基因突變檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種基于pcr的系統(tǒng)和少數(shù)等位基因和突變的富集方法。

背景技術(shù)：

檢測(cè)核酸突變或變異對(duì)包括疾病檢測(cè)和預(yù)后在內(nèi)的各種情況都非常重要。涉及臨床和診斷應(yīng)用的一個(gè)突出關(guān)注是能檢測(cè)到臨床上非常重要的低水平的突變和少數(shù)等位基因。在很多方面，能夠區(qū)分突變非常重要，對(duì)于下列情況尤為如此：從組織活檢和體液如血漿或者血清進(jìn)行癌癥早期檢測(cè)；術(shù)后或者放療、化療后對(duì)殘留病灶的評(píng)估；疾病分期和用于預(yù)后的分子分析或者根據(jù)不同病人使用不同的治療方案；對(duì)治療結(jié)果、癌癥緩解和復(fù)發(fā)進(jìn)行監(jiān)測(cè)等。對(duì)癌癥相關(guān)的體細(xì)胞突變的有效檢測(cè)在很大程度上取決于所選用的技術(shù)和方法。

檢測(cè)和鑒定致癌基因突變和腫瘤抑制基因突變主要是分析癌前或者癌組織，痰，尿液，糞便和釋放到血液中的循環(huán)胞外dna。樣本通常包括野生型和突變型dna，野生型dna經(jīng)常超過所述突變dna貢獻(xiàn)的量。在許多情況下，野生型dna大大超過突變dna，使檢測(cè)和鑒定極低濃度的少數(shù)等位基因非常困難。因而現(xiàn)階段亟需用于富集少數(shù)等位基因和突變的系統(tǒng)和方法。基于建立用于少數(shù)等位基因和突變的富集的系統(tǒng)和方法的必要性，本發(fā)明因此而來。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本申請(qǐng)旨在提供一種富集少數(shù)等位基因和突變的系統(tǒng)和方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本申請(qǐng)的一個(gè)方面，提供了一種核酸分子組合物，用于富集在目標(biāo)核酸的靶核酸序列的等位基因突變，可以滿足上述少數(shù)等位基因和突變檢測(cè)和鑒定少數(shù)等位基因和突變的需要。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種核酸分子組合物，用于富集在目標(biāo)核酸的靶核酸序列的等位基因突變，包括：(a)能夠擴(kuò)增靶核酸序列的正向引物和反向引物和(b)包括第一段序列的第一阻斷物，此序列滿足下述要求(i)和靶核酸序列的野生型等位基因相匹配或互補(bǔ)和(ii)能夠被dna聚合酶延伸。該組核酸分子可以進(jìn)一步包括第二阻斷物，此阻斷物含有與野生型等位基因的互補(bǔ)基因相匹配或者互補(bǔ)的第二段序列。

在一些實(shí)施方案中，第一阻斷物或第二阻斷物不與任一所述正向引物或反向引物重疊。在其它一些實(shí)施方案中，第一阻斷物或第二阻斷物可以包含一個(gè)或多個(gè)修飾的核酸或鍵。在第一阻斷物或第二阻斷物還可以有在3'末端修飾的核酸或鍵。所述的修飾的核苷酸或鍵可以包括pna，lna，2’-o-甲基核酸，2’-o-烷基核酸，2’-熒光標(biāo)記核酸，硫代磷酸酯鍵和它們的任意組合。

在一些實(shí)施例中，靶核酸序列覆蓋編碼egfrt790m(egfrexon20)、egfrl858r(egfrexon21)、egfrexon19del、brafv600e、brafv600k、brafv600d、brafv600g、brafv600a、brafv600r，或者表8和9中列出的任意一個(gè)突變的區(qū)域。

正向或者反向引物長度可以是在10-50個(gè)核苷酸之間，比如約15-30，約16-28，約17-26，約18-24，或者約為20-22個(gè)核苷酸。第一阻斷物或第二阻斷物長度可以約是5-100個(gè)核苷酸，例如，約10-50，約15-30，約16-28，約17-26，約18-24，或約為20-22個(gè)核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，一般來說，阻斷物比引物要短。

本發(fā)明還提供了包括如上所述的核酸分子組合物，用于擴(kuò)增反應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)試劑的試劑盒。該試劑盒可以包括一種或多種選自緩沖劑，dna聚合酶，rna酶抑制劑，延伸核苷酸(extensionnucleotides)和探針組成的試劑。

本發(fā)明還提供了一種用于富集靶核酸序列的等位基因突變的方法。該方法包括提供一種如上所述的核酸分子組合物；在第一或者第二阻斷物存在的條件下用正向引物和反向引物擴(kuò)增靶核酸序列。

該富集方法可以用于檢測(cè)靶核酸序列中是否存在等位基因突變。此方法包括如上所述的富集等位基因突變用于制備擴(kuò)增產(chǎn)物；和檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在等位基因突變。該檢測(cè)步驟可以通過基因測(cè)序或者本領(lǐng)域中已知的其他技術(shù)來進(jìn)行。靶核酸序列可覆蓋編碼egfrt790m、egfrl858r、egfrexon19del、brafv600e、brafv600k、brafv600d、brafv600g、brafv600a、brafv600r，或者表8和9中列出的任意一個(gè)突變的區(qū)域。

其中表8為：

表9為：

所述的富集方法也可以用于評(píng)估患有癌癥受試者或懷疑患有癌癥(例如，肺癌和黑色素瘤)的受試者。這樣的評(píng)價(jià)方法，包括：首先從所述受試者獲得生物樣品；然后進(jìn)行檢測(cè)以確定一個(gè)或多個(gè)等位基因突變是否存在于上述生物樣品中。在一個(gè)實(shí)例中，癌癥是肺腺癌，如非小細(xì)胞肺癌。該生物樣品可以是血清，血漿，全血，唾液或痰。該方法還可以包括根據(jù)上述的一個(gè)或者多個(gè)等位基因突變的存在來確定或推薦一個(gè)治療療程。該方法還可以包括：當(dāng)所述一個(gè)或多個(gè)等位基因突變存在時(shí)，在治療療程中進(jìn)行給藥的步驟。

本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例的細(xì)節(jié)在下面的實(shí)施例描述中闡述。其它特征、目的以及本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)將通過說明書和/或權(quán)利要求書展示。

本發(fā)明的詳細(xì)描述

本發(fā)明基于或者至少部分地基于一個(gè)意外的發(fā)現(xiàn)，即與特定核苷酸突變(如野生型突突變)匹配或者互補(bǔ)的寡核苷酸阻斷物(第一阻斷物和/或第二阻斷物)能阻斷或者抑制特定的核酸突變的擴(kuò)增，從而允許其它突變(例如，突變變體)的富集。因此本發(fā)明還可以提供一種富集這些突變反應(yīng)的系統(tǒng)和用于檢測(cè)的目標(biāo)區(qū)域的核酸突變是否存在的方法。

反應(yīng)系統(tǒng)

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的富集反應(yīng)系統(tǒng)包括引物，阻斷物和pcr擴(kuò)增所必需的成分。如圖2a-c中所示，本發(fā)明的系統(tǒng)具有：(i)第一阻斷物，此阻斷物能結(jié)合或者雜交到與正向引物結(jié)合的同一條鏈或者序列中；和(ii)第二阻斷物和反向引物能結(jié)合或雜交到相反鏈和/或互補(bǔ)序列中。引物對(duì)(即一條正向引物和一條反向引物)用于擴(kuò)增含有熱點(diǎn)突變的區(qū)域，而阻斷物用于阻止核酸突變的擴(kuò)增(例如一種豐富的等位基因突變?nèi)缫吧偷任换?。阻斷物是與核酸突變(例如野生型等位基因)互補(bǔ)的寡核苷酸，其3'端被設(shè)計(jì)成與感興趣的突變完全匹配。例如，它完全與野生型等位基因退火，能被dna聚合酶延伸。熔解溫度與寡核苷酸的長度高度相關(guān)。通過延長阻斷物的長度，阻斷物能承受較高的反應(yīng)溫度，并保持與野生型等位基因的結(jié)合。另一方面，在初始的低反應(yīng)溫度下，阻斷物也可以與突變等位基因退火；然而，因?yàn)橥蛔兊任换虻耐蛔儔A基并不與阻斷物的3'端匹配，延伸無法進(jìn)行。一旦溫度升高，這導(dǎo)致阻斷物從突變型等位基因解離。因此，阻斷物緊密地與野生型結(jié)合而容易與突變變性，引物得以在反應(yīng)中擴(kuò)增感興趣的區(qū)域。因?yàn)樽钄辔锱c野生型退火，引物延伸不能繼續(xù)通過封鎖區(qū)域，因此突變等位基因被優(yōu)先擴(kuò)增。

例如如圖2a所示，阻斷物和野生型等位基因退火，延伸的阻斷物阻止了外引物的pcr擴(kuò)增。圖2b中，每一個(gè)阻斷物在3’端都有錯(cuò)配所以無法保持對(duì)突變等位基因的結(jié)合，所以可被外引物擴(kuò)增。在圖2c中，非特異性延伸只導(dǎo)致了整個(gè)特定模板的等位基因在這一個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增失敗，結(jié)果無假陽性pcr產(chǎn)物形成。

本文所公開的系統(tǒng)優(yōu)于等位基因特異性pcr(as-pcr)，也被稱為擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(amplificationmutationrefractorysystem，arms，參考newtonc,grahama,heptinstalll,etal.analysisofanypointmutationindna.theamplificationrefractorymutationsystem(arms).nucleicacids….1989；17(7):2503-2516.http://nar.oxfordjournals.org/content/17/7/2503.short.accessedmarch18,2015)，這是一種通過嘗試來尋找正確的技術(shù)來富集熱點(diǎn)突變。在as-pcr方法中，引物的3'末端被設(shè)計(jì)成完全匹配于感興趣的突變，并且允許特定的突變擴(kuò)增(圖1a和1b)。比如qiagen公司therascreenegfr和羅氏的cobasegfr系統(tǒng)采用這種技術(shù)。然而，等位基因特異性的非特異性延伸引物(圖1c)的固有缺點(diǎn)降低了靈敏度，導(dǎo)致罕見的體細(xì)胞突變與野生型之間的區(qū)分不可靠。therascreen的lod是0.5％-7.02％(參考therascreenegfrrgqpcrkit.https://www.qiagen.com/us/products/catalog/assay-technologies/complete-assay-kits/personalized-healthcare/therascreen-egfr-rgq-pcr-kit-na),cobas的lod是5％(參考egfrmutationtest.http://molecular.roche.com/assays/pages/cobasegfrmutationtest.aspx)。

阻斷物

如上所述，阻斷物(在本文中有時(shí)被稱為“阻斷劑”)和想要抑制的一個(gè)特定的核酸互補(bǔ)，如大量的等位基因突變(例如野生型等位基因)。這樣的阻斷物可以設(shè)計(jì)成短的單鏈的寡聚物，此寡聚物不超過100個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地50個(gè)核苷酸或更少，還更優(yōu)選地30個(gè)核苷酸或更小，最優(yōu)選地20個(gè)核苷酸或更小，最低下限是大約5個(gè)核苷酸。

阻斷物在某些情況下可用本領(lǐng)域中已知的一些方法進(jìn)行修飾以保護(hù)其不被3'或5’外切酶活性所降解。阻斷物可進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)修飾以防止3'或5'核酸外切酶活性的降解。這樣的修飾包括但不限于2'-o-甲基核糖核苷酸修飾，硫代磷酸酯主鏈修飾，二硫代磷酸酯主鏈修飾，磷酸酯主鏈修飾，甲基磷酸骨架修飾，3'末端磷酸化修飾和3'端烷基取代。在一些實(shí)施方案中，阻斷物因?yàn)榇嬖谝粋€(gè)或者多個(gè)修飾而不被3’和/或5'核酸外切酶活性作用。

阻斷物的3'末端被設(shè)計(jì)為完全匹配于感興趣的特定核酸的突變。如以下例所示，一個(gè)阻斷物完全和野生型等位基因退火，能夠被dna聚合酶延伸。

阻斷物的熔解溫度(tm)與它的長度高度相關(guān)。阻斷物的tm值范圍可以從40℃至70℃，比如40℃至70℃，41℃至69℃，42℃至68℃，43℃至67℃，44℃至66℃，或約53℃至約56℃，或其間的任何范圍。在其它實(shí)施方案中，在擴(kuò)增中pcr循環(huán)條件下阻斷物的tm值可以比退火/延伸溫度高約3℃至6℃。

在一些實(shí)施例中，阻斷物在pcr擴(kuò)增期間不被降解。根據(jù)本發(fā)明，阻斷物可以是可延伸或不可延伸的。在一些實(shí)施例中，阻斷物可以在其3'末端包括一個(gè)不可延伸的阻斷部分。在一些實(shí)施例中，阻斷物還可以在其3'末端，5'末端和/或二者之間的任意位置包括其它部分(包括但不限于額外的不可延伸的阻斷部分，淬滅部分，熒光部分等)。在其他實(shí)施例中，阻斷物可延伸，而且在其3'末端不包括任何不可延伸的阻斷部分。在這種情況下，阻斷物在pcr過程中延伸。通過延伸阻斷物的長度，阻斷物承受較高的反應(yīng)溫度，并保持與野生型等位基因配對(duì)。

引物

根據(jù)本發(fā)明，一條正向引物和/或一條反向引物可被設(shè)計(jì)成與各種合適的位置互補(bǔ)(完全或部分)，這些位置對(duì)應(yīng)于一個(gè)或多個(gè)感興趣的核酸的突變。例如，某些情況下和目標(biāo)區(qū)域雜交時(shí)，正向引物或者反向引物的3’端可距離目標(biāo)區(qū)域的一個(gè)或者多個(gè)核酸突變0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，80，100，250，500，1000，2000或更多個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施例中，當(dāng)雜交至靶區(qū)域時(shí)，正向引物或者反向引物的3’端可與雜交區(qū)域內(nèi)的一個(gè)或者多個(gè)核酸突變相距不足30個(gè)核苷酸遠(yuǎn)。引物可以是約10-50bp的寡核苷酸，例如約15-30，約16-28，約17-26，約18-24或約20-22，或其間的任何范圍內(nèi)。

在一些情況下，正向或反向引物和阻斷物可能重疊并競(jìng)爭(zhēng)雜交部分或全部的目標(biāo)區(qū)域。例如引物和阻斷物可能有0，5，10，15，或更多個(gè)核苷酸重疊。在一些實(shí)施例中，引物和阻斷物不重疊或不競(jìng)爭(zhēng)雜交部分或全部的目標(biāo)區(qū)域。

上面討論的引物和/或阻斷物可包括一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基或不同于天然存在的堿基(即腺嘌呤，胞嘧啶，鳥嘌呤，胸腺嘧啶和尿嘧啶)的堿基。在一些實(shí)施例中，經(jīng)修飾的堿基仍然能夠有效地與含有腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶或胸腺嘧啶的核酸單元雜交。在一些實(shí)施例中，經(jīng)修飾的堿基可以增加匹配和不匹配的靶核酸序列間的tm值的差別和/或減少不匹配的結(jié)合效率，因此不僅提高了檢測(cè)的特異性，也提高了選擇性。

修飾堿基是通過加入或去除一個(gè)或多個(gè)功能基團(tuán)而使其與天然存在的堿基不同，差異體現(xiàn)在雜環(huán)環(huán)結(jié)構(gòu)(即，碳替代為雜原子，或相反的替代)和/或一個(gè)或多個(gè)堿基的連接臂結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施例中，天然存在的堿基，經(jīng)修飾的堿基和堿基類似物的所有互變異構(gòu)形式也可以包括在本發(fā)明的引物和阻斷物中。

修飾堿基的一些實(shí)例可包括，例如，一般的類堿基類似物的7-脫氮嘌呤和其衍生物和吡唑并嘧啶和它們的衍生物(參見例如，wo90/14353和us20100285478，并通過引用將其這些專利的整體內(nèi)容并入本文)。這種類型的堿基類似物的實(shí)例包括，例如，鳥嘌呤類似物6-氨基-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4(5h)-酮(ppg)，腺嘌呤類似物4-氨基-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶(ppa)和黃嘌呤類似物1h-吡唑并[4,4-d]嘧啶-4(5h)-6(7h)-二酮(ppx)。這些堿基類似物，當(dāng)出現(xiàn)在本發(fā)明的一些實(shí)施例中的寡核苷酸時(shí)，可以增強(qiáng)雜交并提高錯(cuò)配的區(qū)分。

另外，在一些實(shí)施例中，經(jīng)修飾的糖或糖類似物可以在一個(gè)或更多的寡核苷酸的核苷酸亞基中存在。糖修飾包括，但不限于，取代基附著到糖的2'，3'和/或4’的碳原子上，不同差向異構(gòu)體形式的糖，在糖苷鍵的α或β構(gòu)型的差異和其它端基異構(gòu)的變化。糖部分包括，但不限于，戊糖，脫氧戊糖，己糖，脫氧己糖，核糖，脫氧核糖，葡萄糖，阿拉伯糖，五環(huán)呋喃糖，木糖，來蘇糖和環(huán)戊基。

例如，鎖核酸(lna)型修飾通常涉及對(duì)核糖和脫氧核糖核苷酸的戊糖的改變，此改變約束，或者“鎖定”a型dna中所見的n型構(gòu)象的糖。在一些實(shí)施例中，這種鎖定可以通過2'-o，4'-c-亞甲基鍵在1,2:5,6-二異亞丙基-alpha-d-異呋喃糖中實(shí)現(xiàn)。在其他實(shí)施例中，這種改變可用于合成鎖定核苷酸亞磷酰胺單體。(例如，參考wengelj.,ace.chem.res.,32:301-310(1998),u.s.pat.no.7,060,809；obika,etal.,tetrahedronlett39:5401-5405(1998)；singh,etal.,chemcommun4:455-456(1998)；koshkin,etal.,tetrahedron54:3607-3630(1998)，每一個(gè)公開文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用將其整體并入本文)。

在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，經(jīng)修飾的堿基包括8-氮雜-7-脫氮-da(ppa)，8-氮雜-7-脫氮-dg(ppg)，2’-脫氧假異胞啶(2'-deoxypseudoisocytidine)，5-氟-2'脫氧尿苷(fdu)，鎖定核酸(lna)，或2'-o,4'-c-乙烯橋聯(lián)核酸(ena)堿基)。可在本發(fā)明中使用的經(jīng)修飾的堿基的其它實(shí)例在美國專利7517978號(hào)中有描述，該專利申請(qǐng)的公開內(nèi)容通過引用將其整體并入本文。

許多經(jīng)修飾的堿基，包括例如lna，ppa，ppg，5-氟du的(fdu)，可商購，并且可以用于本領(lǐng)域中公知的寡核苷酸合成方法中。在一些實(shí)施例中，修飾的引物和阻斷物可以使用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)方法合成。例如，在某些實(shí)施方案中，修飾的部分或堿基可以通過使用如下幾種方式(a)修飾的核苷作為dna合成的支撐，(b)修飾的核苷作為亞磷酰胺，(c)dna合成時(shí)的試劑(例如摻入dna序列時(shí)經(jīng)過芐胺處理的可轉(zhuǎn)換酰胺)，或(d)的合成后修飾。

由于核苷酸結(jié)構(gòu)的靈活性，部分錯(cuò)配的堿基對(duì)可部分形成沃森-克里克(watson-crick)結(jié)合。這個(gè)特點(diǎn)使得阻斷效率降低，因?yàn)樗部梢栽谕蛔兊牡任换蜓由?。鎖定核酸(lna)和一些其他的核酸類似物具有更剛性的結(jié)構(gòu)可用于減輕該問題。使用的阻斷物可以在或者靠近感興趣的突變的位置含有一個(gè)或兩個(gè)lna。

在一些實(shí)施例中，引物或阻斷物合成時(shí)，修飾堿基放在3'端。在一些實(shí)施例中，修飾堿基被放在引物或阻斷物的3’端1-6個(gè)核苷酸之間，例如，距引物或阻斷物3’端2，3，4或5個(gè)核苷酸。在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，引物或阻斷物被合成，使得修飾堿基放在3'-最末端。

改性間鍵也可以存在于本發(fā)明中公開的引物和阻斷物。這樣修飾的鍵包括，但不限于，肽，磷酸，磷酸二酯，烷基磷酸酯，烷烴膦酸酯，硫代，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，氨基磷酸酯，取代的氨基磷酸酯和類似物的堿基，糖和/或核苷酸間鍵若干進(jìn)一步的改進(jìn)，這是與它們?cè)谟米髯钄辔锖?或引物的寡核苷酸的使用相關(guān)，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見。

dna聚合酶的3’→5’外切酶活性能夠從寡核苷酸的3’端去除錯(cuò)配堿基，因此區(qū)別于阻斷物的堿基也被消化掉。硫代磷酸酯鍵比磷酸二酯鍵對(duì)外切酶活性更難消化；因此可被用在阻斷物的3’端。

方法

上述系統(tǒng)可以在用于識(shí)別，富集和/或定量樣品中等位基因突變的各種方法中使用。

在本發(fā)明中所公開的方法包括在一個(gè)或者多個(gè)阻斷物存在時(shí)用一條正向引物和一條反向引物擴(kuò)增靶區(qū)域。阻斷物是在沒有核酸突變的情況下，包括一個(gè)和要富集的目標(biāo)區(qū)域互補(bǔ)的序列。該方法可進(jìn)一步包括檢測(cè)靶區(qū)域的擴(kuò)增。本發(fā)明所述方法可以高靈敏度地檢測(cè)核酸突變，某些情況下最低檢測(cè)限(lod)可達(dá)0.01％-0.001％。

如圖2a所示，當(dāng)阻斷物退火到突變(例如野生型突變)上時(shí)，該阻斷物延伸并阻止pcr擴(kuò)增，由此阻止一個(gè)遠(yuǎn)端的正向引物或反向引物的延伸。在一些實(shí)施例中，正向或反向引物可以距離阻斷物的雜交區(qū)域0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，80，100，250，500，1000，2000個(gè)核苷酸或更遠(yuǎn)。在一些實(shí)施例中，阻斷物具有足夠高的tm，無法被復(fù)制的正向或者反向引物所置換。在一些實(shí)施例中，在擴(kuò)增反應(yīng)中使用的酶不具有鏈置換活性。

多種dna聚合酶可以在本發(fā)明中使用。在某些情況下，用本發(fā)明方法擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域所使用的酶包括但不限于：高保真dna聚合酶和具有3’端外切酶活性的修復(fù)酶。可用于本發(fā)明所述方法中的酶舉例如下:包括但不限于，pfu熱啟動(dòng)dna聚合酶(pfuturbo熱啟動(dòng)dna聚合酶)，phusion^tm熱啟動(dòng)高保真dna聚合酶，phusionhot^tm啟動(dòng)ii高保真dna聚合酶，phire^tm熱啟動(dòng)dna聚合酶，phire^tm熱啟動(dòng)iidna聚合酶，kod熱啟動(dòng)dna聚合酶，q5高保真熱啟動(dòng)dna聚合酶，amplitaq，phusionhsii，deepvent和kapa高保真dna聚合酶。

用于擴(kuò)增核酸序列的一般方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。本發(fā)明可以使用任何這樣的現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)存在的方法。在一些實(shí)施例中，擴(kuò)增可以使用數(shù)字pcr的方法，如vogelsteinandkinzler("digitalpcr,"pnas,96:9236-9241(1999)所描述的。這種方法包括在目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增前稀釋所要擴(kuò)增的樣本。稀釋包括稀釋到傳統(tǒng)的常規(guī)板，多孔板，納米孔，以及稀釋到微墊或作為微滴。(參考beernr,etal.,"on-chip,real-time,single-copypolymerasechainreactioninpicoliterdroplets,"anal.chem.79(22):8471-8475(2007)；vogelsteinandkinzler,"digitalpcr,"pnas,96:9236-9241(1999)；和pohlandshih,"principleandapplicationsofdigitalpcr,"expertreviewofmoleculardiagnostics,4(1):41-47(2004))。當(dāng)與數(shù)字pcr結(jié)合使用時(shí)，本發(fā)明可以大大提高數(shù)字pcr的靈敏度。這是由于本發(fā)明提供了在檢測(cè)遺傳情況包括稀有遺傳時(shí)顯著抑制野生型相關(guān)的背景噪聲(比如至少約60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％，99.9％，99.99％，99.999％，或約100％)。通過本發(fā)明的方法由于可在一個(gè)數(shù)字pcr反應(yīng)的單個(gè)體積中更易與目標(biāo)區(qū)域結(jié)合大大提高了靶向靈敏度。

當(dāng)用pcr(例如，數(shù)字pcr)檢測(cè)稀有遺傳變化時(shí)，給定反應(yīng)混合物中的絕大部分都是野生型序列，而很少包含罕見的遺傳事件。本發(fā)明所述方法可有效抑制野生型，例如如本文所述的大于1：10000。在一些實(shí)例中，每個(gè)數(shù)字pcr中包括10000個(gè)野生型分子，但是因?yàn)楸景l(fā)明所述方法對(duì)野生型擴(kuò)增的抑制而不抑制單個(gè)稀有目標(biāo)的擴(kuò)增，仍然可以檢測(cè)到1個(gè)稀有突變。

本發(fā)明所述方法進(jìn)一步包括使用本領(lǐng)域中通用的檢測(cè)方法來檢測(cè)目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增。例如，檢測(cè)可以通過擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線，通過質(zhì)譜法或通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序獲得。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物中核酸變異的數(shù)目和類型不同，擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)出不同的熔解曲線。用于確定熔解曲線的方法已被充分描述并在本領(lǐng)域眾所周知，對(duì)于使用質(zhì)譜以及核酸測(cè)序的方法也都在本領(lǐng)域中普遍使用(參見sambrookandrussell，molecularcloning:alaboratorymanual,(3^rded.)(2001)和plum,opticalmethods,currentprotocolsinnucleicacidchemistry,2001-2011)以及currentprotocolsinnucleicacidchemistry,2001-2011,specificallyliquidchromatography-massspectrometryanalysisofdnapolymerasereactionproducts)。核酸測(cè)序方法也是常規(guī)和本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。任何測(cè)序方法都可與本發(fā)明共同使用(參見currentprotocolsinmolecularbiology,1995-2010)。

本發(fā)明的方法還包括通過比較與目標(biāo)區(qū)域是否存在核酸突變相關(guān)聯(lián)的已知擴(kuò)增水平的擴(kuò)增產(chǎn)物的量來檢測(cè)目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增情況。用于檢測(cè)擴(kuò)增或測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的量的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且可以使用任何這樣的方法(參見sambrook和russell著《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第3版)》(2001)和加拉格爾等人所著《當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)方案：不可缺少的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)》(2008)))。

本發(fā)明的方法所檢測(cè)的核酸變異包括在目標(biāo)區(qū)域中的突變，缺失和/或插入。缺失包括去除目標(biāo)區(qū)域的單個(gè)核苷酸堿基?？杀粰z測(cè)的缺失包括1個(gè)堿基缺失，2，3，4，5個(gè)或更多(如數(shù)百或數(shù)千)核苷酸堿基。突變可包括但不限于替換(如顛換和轉(zhuǎn)換)、脫堿基位點(diǎn)、交聯(lián)的位點(diǎn)，以及化學(xué)改變或修飾的堿基?？梢员粰z測(cè)的突變包括在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的1個(gè)突變，2，3，4，5個(gè)或更多核苷酸堿基突變。插入包括添加一個(gè)核苷酸到靶區(qū)域?？梢詸z測(cè)可包括1個(gè)堿基插入，2，3，4，5個(gè)或更多(例如數(shù)百或數(shù)千)核苷酸堿基插入到目標(biāo)區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，缺失、突變和/或插入由本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)。

本文所公開的系統(tǒng)和方法可最小化假陽性，而假陽性是as-pcr的最大的弱點(diǎn)。本研究方法不是用延伸突變的dna的方法，而是利用阻斷寡聚核苷酸退火到野生型dna上并阻斷其擴(kuò)增的方法使得所述突變dna被優(yōu)先擴(kuò)增(圖2a和2b)。偶然的等位基因非特異性阻斷物的延伸對(duì)富集的結(jié)果幾乎沒有影響(圖2c)。野生型未阻斷的殘余的擴(kuò)增可在后續(xù)的ngs測(cè)序進(jìn)行識(shí)別。

如本文所公開的，本發(fā)明所述的系統(tǒng)和方法可有效地阻斷大于99.9％的野生型擴(kuò)增，導(dǎo)致突變等位基因的比例從1/10000顯著增加到1/7，即從約0.01％到約14％。稀有假陽性不是等位基因特異性寡核苷酸的固有非特異性延伸引入，而是僅由dna聚合酶的核苷酸摻入錯(cuò)誤所引發(fā)。采用帶有3'至5'外切酶活性的高保真聚合酶可以進(jìn)一步減少假陽性，進(jìn)一步降低了稀有誤報(bào)。

用途與應(yīng)用

本文所公開的方法可以用于富集或檢測(cè)各種感興趣的靶核酸。靶核酸可以是雙鏈核酸或單鏈核酸的一部分。

可使用的核酸樣品的來源，包括但不限于人類細(xì)胞如循環(huán)血液，培養(yǎng)的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。其他哺乳動(dòng)物的組織，血液和培養(yǎng)的細(xì)胞也是模板核酸的可用來源。此外，病毒，噬菌體，細(xì)菌，真菌和其它微生物也可以是核酸分析的來源。該dna可以是基因組，也可以是質(zhì)粒，噬菌體，細(xì)菌人工染色體(bac)，酵母人工染色體(yac)或其它為載體的克隆。rna可以直接從有關(guān)的細(xì)胞中分離，也可以通過在體外從合適的rna啟動(dòng)子擴(kuò)增或通過體外轉(zhuǎn)錄得到。本發(fā)明可以用于檢測(cè)基因組dna的突變，不管是人類，動(dòng)物或其它生物體。本發(fā)明方法在遺傳性或獲得性疾病或病癥的分析中有特殊的用途；其中一種特殊用途是用于遺傳性疾病和癌癥的檢測(cè)。

在一些實(shí)施方案中，模板序列或核酸樣品可以是基因組dna。在其它實(shí)施例中，模板序列或核酸樣品可以是cdna。在其它實(shí)施方案中，如在通過rt-pcr同時(shí)分析基因表達(dá)的情況下，模板序列或核酸樣品可以是rna。dna或rna模板序列或核酸樣品可從任何類型的組織中被提取，例如，福爾馬林固定石蠟包埋的腫瘤標(biāo)本。

在一些實(shí)施方案中，靶核酸可以存在于在受試者的一個(gè)細(xì)胞中，如哺乳動(dòng)物(例如人類)，植物，真菌(例如酵母)，原生動(dòng)物，細(xì)菌或病毒。例如，靶核酸可以存在于感興趣的有機(jī)體的基因組中(例如在染色體上)或在染色體以外的核酸中。在一些實(shí)施方案中，靶核酸可以是rna，例如mrna。在其它一些實(shí)施方案中，靶核酸可以是dna(例如雙鏈dna)。

在具體實(shí)施方案中，靶核酸可以是特異存在于感興趣的生物體中的，即靶核酸沒有在其它生物體中發(fā)現(xiàn)或在類似于所感興趣的生物體的有機(jī)體中無法找到。在一些實(shí)施方案中，靶核酸可以是病毒核酸。例如，病毒核酸可以是在人類免疫缺陷病毒(hiv)，流感病毒(例如甲型流感病毒，乙型流感病毒，或流感肝炎病毒)，或登革熱病毒中。靶核酸可以存在于細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，靶核酸可以是一個(gè)原生動(dòng)物核酸。在一些實(shí)施方案中，靶核酸是真菌(例如酵母)的核酸。

在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶核酸可以是哺乳動(dòng)物(例如人類)的核酸。例如，哺乳動(dòng)物核酸可以在循環(huán)腫瘤細(xì)胞，上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞中找到。在其它實(shí)例中，靶核酸是在受試者的血液中自由循環(huán)的核酸，例如無細(xì)胞核酸(cfdna)或癌癥患者的血液中的循環(huán)腫瘤dna(ctdna)。為了能夠更好地利用從患者血漿中得到的有限的無細(xì)胞核酸(cfdna)，可以使用多重pcr和一個(gè)通用的pcr反應(yīng)程序。如在以下實(shí)施例中所示，結(jié)果表明，所有三種測(cè)試的突變熱點(diǎn)成功共富集。多重測(cè)定允許同時(shí)檢測(cè)一系列的驅(qū)動(dòng)基因突變，這滿足了肺癌液體活檢的需求。

為了達(dá)到cap所推薦的5天的周轉(zhuǎn)時(shí)間這一目標(biāo)，文庫制備過程已優(yōu)化到4個(gè)小時(shí)以下。整個(gè)液體活檢的估計(jì)周期為4天，包括樣品物流、測(cè)序、數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解釋。

在一個(gè)實(shí)例中，靶核酸鏈?zhǔn)且粭l含有特定變異的鏈，如單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，snp)或遺傳突變。該類突變的實(shí)例包括點(diǎn)突變，易位或反轉(zhuǎn)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明中的組合物、方法和/或本文所公開的試劑盒可在診斷過程中用于檢測(cè)循環(huán)系統(tǒng)中的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中的組合物、方法和/或試劑盒可用于早期癌癥診斷中檢測(cè)血液中的腫瘤細(xì)胞dna。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明中的組合物、方法和/或試劑盒可用于癌癥或疾病相關(guān)的遺傳變異或體細(xì)胞突變的檢測(cè)和驗(yàn)證。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明中的組合物、方法和/或試劑盒可用于snp基因分型——四-，三-和二-等位基因的snp。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明中的組合物、方法和/或試劑盒可以被用于識(shí)別一個(gè)或多個(gè)核苷酸插入或缺失突變。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明中的組合物、方法和/或試劑盒可用于qc人類鑒定試驗(yàn)的混合dna樣品中dna的分型，細(xì)胞污染物檢測(cè)中細(xì)胞系的qc，等位基因的基因表達(dá)分析，病毒分型/稀有病原體檢測(cè)，從混合的樣品中進(jìn)行突變檢測(cè)，在血液中檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞和/或產(chǎn)前診斷。

癌癥有關(guān)的用途

在本發(fā)明公開的系統(tǒng)和方法在如下領(lǐng)域中特別有用：(一)從組織活檢和如血漿或血清之類的體液中所做的癌癥早期檢測(cè)；(二)手術(shù)或放化療后殘留病變的評(píng)估；(三)疾病分期、用于預(yù)后的分子分析或?yàn)椴∪藗€(gè)體個(gè)性化定制治療方案；(四)監(jiān)測(cè)治療結(jié)果和癌癥的緩解或復(fù)發(fā)。

2015年，美國癌癥死亡人數(shù)估計(jì)為589430人(參考siegelrl,millerkd,jemala.cancerstatistics,2015.cacancerjclin.2015；65(1):5-29.doi:10.3322/caac.21254)。在所有的癌癥中，非小細(xì)胞肺癌(nsclc)是癌癥死亡的首要原因，占22.8％。以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療相比于單獨(dú)支持治療可適度提高晚期非小細(xì)胞肺癌患者9％即12個(gè)月的生存期(參考spirosg,ruddrm,souhamirl,etal.chemotherapyversussupportivecareinadvancednon-smallcelllungcancer:improvedsurvivalwithoutdetrimenttoqualityoflife.thorax.2004；59(10):828-836.doi:10.1136/thx.2003.020164)。相比之下，靶向治療在治療決策制定過程中結(jié)合了腫瘤基因分型，治療效果有很大的提高。例如，吉非替尼，一種可靶向表皮生長因子受體(egfr)的小分子酪氨酸激酶抑制劑(tki)(參考paezjg,japa,tracys,etal.egfrmutationsinlungcancer:correlationwithclinicalresponsetogefitinibtherapy.2004；304(june):1497-1501)，相比于典型的化療的20％反應(yīng)速率，其反應(yīng)速率可高達(dá)75％；相比于典型的化療的10.3個(gè)月中位存活率，吉非替尼方案中患者的存活期可達(dá)28.2個(gè)月(參考barrkumarakulasinghen,zanwijknvan,soora.moleculartargetedtherapyinthetreatmentofadvancedstagenon-smallcelllungcancer(nsclc).respirology.february2015.doi:10.1111/resp.12490)。然而，靶向治療并沒有惠及所有的非小細(xì)胞肺癌患者。靶向治療的高效性依賴于病人體中可操作致癌驅(qū)動(dòng)基因突變的存在。這些突變是發(fā)起或維持腫瘤形成過程的分子異?？梢酝ㄟ^針對(duì)每個(gè)基因組改變的藥劑中和。如果沒有靶向腫瘤的過程中，吉非替尼在野生型egfr基因的非小細(xì)胞肺癌患者中只有微乎其微0-6.6％的應(yīng)答速率，但在有egfr突變的患者中有超乎尋常的75％的應(yīng)答速率(參考如douillardj-y,shepherdfa,hirshv,etal.molecularpredictorsofoutcomewithgefitinibanddocetaxelinpreviouslytreatednon-small-celllungcancer:datafromtherandomizedphaseiiiinteresttrial.jclinoncol.2010；28(5):744-752.doi:10.1200/jco.2009.24.3030和hirschfr,varella-garciam,bunnpa.,etal.molecularpredictorsofoutcomewithgefitinibinaphaseiiiplacebo-controlledstudyinadvancednon-small-celllungcancer.jclinoncol.2006；24(31):5034-5042.doi:10.1200/jco.2006.06.3958和maruyamar,nishiwakiy,tamurat,etal.phaseiiistudy,v-15-32,ofgefitinibversusdocetaxelinpreviouslytreatedjapanesepatientswithnon-small-celllungcancer.jclinoncol.2008；26(26):4244-4252.doi:10.1200/jco.2007.15.0185和mokt,wuy.gefitiniborcarboplatin–paclitaxelinpulmonaryadenocarcinoma.nengljmed.2009sep3；361(10):947-57以及http://scholar.google.com/scholar？hl＝en&btng＝search&q＝intitle:new+england+journal#2.accessedapril13,2015)。因此，靶向治療之前務(wù)必要進(jìn)行驅(qū)動(dòng)突變?cè)囼?yàn)。

組織活檢一直是突變鑒定的主要方法。然而，這種方法對(duì)非小細(xì)胞肺癌的病人的病情檢測(cè)并不理想。大約75％的非小細(xì)胞肺癌病例在診斷時(shí)已經(jīng)處于晚期，但組織固體活檢在檢測(cè)腫瘤之間和腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性方面的固有缺點(diǎn)往往導(dǎo)致耐藥性。事實(shí)上，腫瘤異質(zhì)性的存在是在使用靶向治療開發(fā)有效的癌癥治療方法過程中的一個(gè)主要挑戰(zhàn)(參考yancovitzm,littermana,yoonj,etal.intra-andinter-tumorheterogeneityofbraf(v600e))mutationsinprimaryandmetastaticmelanoma.plosone.2012；7(1):e29336.doi:10.1371/journal.pone.0029336)。液體活檢作為一個(gè)有吸引力的方法，有全面捕獲基因組改變的潛力，從而使靶向治療有效的實(shí)現(xiàn)。另外，液體活檢容易重復(fù)，這使得將它用于腫瘤監(jiān)控變化成為可能，因而可用于治療期間指導(dǎo)用藥。液體活檢也有潛力用于術(shù)后或治療之后可能導(dǎo)致復(fù)發(fā)微小殘留疾病的測(cè)量(參考diehlf,schmidtk,chotima,etal.circulatingmutantdnatoassesstumordynamics.natmed.2008；14(9):985-990.doi:10.1038/nm.1789)。此外，它還可以在后續(xù)護(hù)理過程中充當(dāng)檢測(cè)復(fù)發(fā)的早期征兆的一個(gè)重要配套工具。然而，由于循環(huán)系統(tǒng)中腫瘤細(xì)胞的核酸(ctdna)和腫瘤細(xì)胞的數(shù)量極低，再加上更為嚴(yán)重的由檢測(cè)所帶來的人為誤差，液體活檢尚未用于醫(yī)生的日常工作中。

本發(fā)明所公開的系統(tǒng)和方法可作為一種可靠的、快速的測(cè)定晚期非小細(xì)胞肺癌的患者的液體活檢方法。開發(fā)這樣一個(gè)可靠且快速的檢測(cè)方法的障礙是雙重的，迄今尚無克服了以下兩方面困難的平臺(tái)：

第一個(gè)困難是靈敏度。即使在晚期癌癥患者中，循環(huán)系統(tǒng)中腫瘤dna(ctdna)的存量可能會(huì)非常低。newman等人在晚期非小細(xì)胞肺癌患者血漿觀察到的范圍為0.04％至3.2％(參考newmanam,bratmansv,toj,etal.anultrasensitivemethodforquantitatingcirculatingtumordnawithbroadpatientcoverage.natmed.2014；20(5):548-554.doi:10.1038/nm.3519)。定量pcr(qpcr)這種常用的技術(shù)可以達(dá)到約1％的檢測(cè)下限(lod)，下一代測(cè)序(ngs)大多能達(dá)到1-2％lod。數(shù)字pcr在這方面示出了最有希望的進(jìn)展，其lod低至0.01％(參考detectionofraremutationsinbloodsamplesbydropletdigitalpcr.http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/bulletin_6317.pdf)。

第二個(gè)困難是多重測(cè)定的能力。已發(fā)現(xiàn)的可操作突變的數(shù)量和血液樣品的體積有限使得單重測(cè)定不適于液體活檢。因此，功能性液體活檢的一個(gè)關(guān)鍵功能是從一個(gè)單一的血漿dna樣品并行檢測(cè)多個(gè)關(guān)聯(lián)驅(qū)動(dòng)的突變的能力。目前，ngs是能夠提供足夠的多重功能的唯一成熟平臺(tái)。

本文所公開的液體活檢專注于識(shí)別可操作致癌突變以指導(dǎo)治療方案的選擇。大約75％非小細(xì)胞肺癌在診斷時(shí)是轉(zhuǎn)移性的或已處于晚期(參考readec,gantia.egfrtargetedtherapyinnon-smallcelllungcancer:potentialroleofcetuximab.bioltargetsther.2009:215-224.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc2726075/.accessedapril13,2015)，對(duì)這樣的患者可采用靶向治療。在這些患者中的腫瘤存在較高的水平異質(zhì)性。本發(fā)明方法的主要目的是在一個(gè)異種腫瘤細(xì)胞群中測(cè)試可操作突變，并密切監(jiān)測(cè)腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)和分子耐藥性的上升。處于治療后的后續(xù)護(hù)理時(shí)期的病人也可從液體活檢中大大受益。有研究發(fā)現(xiàn)，分子測(cè)試可以比放射學(xué)檢查早數(shù)月發(fā)現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)的可能(參考misales,yaegerr,hobors,etal.emergenceofkrasmutationsandacquiredresistancetoanti-egfrtherapyincolorectalcancer.nature.2012；486(7404):532-536.doi:10.1038/nature11156以及diazla,williamsrt,wuj,etal.themolecularevolutionofacquiredresistancetotargetedegfrblockadeincolorectalcancers.nature.2012；486(7404):537-540.doi:10.1038/nature11219)。

如在下面實(shí)施例中所述，本文公開的系統(tǒng)和方法可以被成功地用于熱點(diǎn)突變的富集和檢測(cè)包括那些編碼egfrt790m、egfrl858r、egfrexon19del、brafv600e、brafv600k、brafv600d、brafv600g、brafv600a和brafv600r。

egfrt790m突變是一個(gè)在酪氨酸酶抑制劑(tki)靶向治療患者中的頻繁獲得性突變，該突變導(dǎo)致表皮生長因子受體790位的蘇氨酸被甲硫氨酸替換。這突變后的殘基增加了對(duì)atp的親和力并競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抑制劑的結(jié)合位點(diǎn)(參考yunc-h,mengwasserke,tomsav,etal.thet790mmutationinegfrkinasecausesdrugresistancebyincreasingtheaffinityforatp.procnatlacadsciusa.2008；105(6):2070-2075.doi:10.1073/pnas.0709662105)。低于5％的癌細(xì)胞獲得該突變后，病人便會(huì)表現(xiàn)出對(duì)tki治療敏感性的降低(參考lindemanni,caglept,beasleymb,etal.moleculartestingguidelineforselectionoflungcancerpatientsforegfrandalktyrosinekinaseinhibitors:guidelinefromthecollegeofamericanpathologists,internationalassociationforthestudyoflungcancer,andassociationformolecularpatho.archpathollabmed.2013；137(6):828-860.doi:10.5858/arpa.2012-0720-oa)。因此，有必要密切監(jiān)察t790m的出現(xiàn)。t790m的檢測(cè)可以協(xié)助醫(yī)生在治療期間做出切換藥物到第三代egfrtki的決定或暫停用藥的決定(參考watanabes,tanakaj,otat,etal.clinicalresponsestoegfr-tyrosinekinaseinhibitorretreatmentinnon-smallcelllungcancerpatientswhobenefitedfromprioreffectivegefitinibtherapy:aretrospectiveanalysis.bmccancer.2011；11(1):1.doi:10.1186/1471-2407-11-1)。

egfrl858r是致癌的驅(qū)動(dòng)基因，占所有egfr激活肺癌的43％(參考mitsudomit,yatabey.epidermalgrowthfactorreceptorinrelationtotumordevelopment:egfrgeneandcancer.febsj.2010；277(2):301-308.doi:10.1111/j.1742-4658.2009.07448.x)。含有egfrl858r突變的細(xì)胞系dna以不同比率與野生型dna混合，使用以上所公開的方法和系統(tǒng)(表3)可以進(jìn)行富集。與t790m的結(jié)果相似，863倍的富集用來檢測(cè)0.01％的等位基因突變是綽綽有余的。

除了上述點(diǎn)突變，其他核酸變異或突變也通過本發(fā)明的方法和系統(tǒng)進(jìn)行富集和/或擴(kuò)增?？梢詰?yīng)用的核酸變異的實(shí)例列明在下面的列表8和9中。

本文所公開的的系統(tǒng)和方法可以提供最佳液體活檢產(chǎn)品和方式。相比在硅片上由單個(gè)活檢樣本占用整個(gè)illumina公司hiseq的全部容量增強(qiáng)液體活檢(參考sullivanm.guardanthealthtakesanother$50mfor“l(fā)iquidbiopsy”cancertest.2015以及http://venturebeat.com/2015/02/03/guardant-health-takes-another-50m-for-ground-breaking-liquid-biopsy-test/)，本文公開的測(cè)定法降低了體外非突變dna的存在，可以允許致癌突變的更靈敏的檢測(cè)；相對(duì)于illumina公司hiseq的全部容量增強(qiáng)液體活檢，本發(fā)明以相同的hiseq測(cè)序容量可處理10,000個(gè)樣本。

組合物和試劑盒

本發(fā)明包括含有上述引物和阻斷物的組合物或反應(yīng)混合物。該組合物可以進(jìn)一步包含選自核酸聚合酶，延伸的核苷酸以及檢測(cè)試劑的一種或多種試劑。

該檢測(cè)試劑可以包含核苷酸探針，例如分子信標(biāo)探針或標(biāo)記有熒光團(tuán)和淬滅劑的標(biāo)記熒光探針——陰陽探針。例如，參考美國專利號(hào)5925517，6103476，6150097，6270967，6326145和7799522所述。除了上述的試劑，該組合物也可包括，一種或多種鹽，例如氯化鈉，氯化鎂，氯化鉀，硫酸鎂；緩沖劑，例如tris緩沖液，n-(2-羥乙基)哌嗪-n'-2-乙烷磺酸(hepes)，2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(mes)，mes鈉鹽，3-(n-嗎啡啉)丙磺酸(mops)，n-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(taps)；增溶劑；洗滌劑，例如非離子型去污劑，如tween-20；核酸酶抑制劑及其類似物。

本發(fā)明進(jìn)一步包括試劑盒和用于進(jìn)行擴(kuò)增、富集和/或用于檢測(cè)的靶核酸序列的診斷系統(tǒng)。為此，一個(gè)或多個(gè)用于本文公開的方法的反應(yīng)組分可以以用于在靶核酸鏈的富集和檢測(cè)中使用的試劑盒的形式提供。這樣的試劑盒提供了在一個(gè)或多個(gè)容器中或基質(zhì)上(通過靜電相互作用或共價(jià)鍵結(jié)合)的一種或多種反應(yīng)組分的適當(dāng)含量。

使用本文所述的方法對(duì)一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增或富集或測(cè)序(例如用于ngs或sanger測(cè)序)的試劑盒，可包括以下的：正向引物，反向引物，一種或多種阻斷物，核酸聚合酶，延伸的核苷酸和檢測(cè)探針。試劑盒的其他組分的實(shí)例包括但不限于，一個(gè)或多個(gè)不同的聚合酶，用于聚合反應(yīng)(在1x或濃縮的形式)緩沖液和一種或多種染料或用于檢測(cè)聚合產(chǎn)物的熒光分子，其中一種或多種引物用于特異性擴(kuò)增對(duì)應(yīng)核酸或靶核酸，一種或多種探針用于特異結(jié)合于控制核酸或靶核酸。該試劑盒還可以包括以下部件中的一個(gè)或多個(gè)：支持、終止、修改或消化試劑，滲透劑和用于檢測(cè)一個(gè)檢測(cè)探針的裝置。

在擴(kuò)增和/或檢測(cè)方法中使用的反應(yīng)組分可以以各種形式來提供。例如，組分(例如酶，三磷酸核苷酸，阻斷物和/或引物)可以懸浮在水性溶液或作為冷凍干燥的或凍干的粉末、丸或珠。在后一種情況下，組分再生時(shí)，形成完整的混合物用于在測(cè)定中使用。

試劑盒或系統(tǒng)可以包含其用量足以滿足所述至少一個(gè)測(cè)定的需要。本文所描述的組件的任何組合，還可以包括指導(dǎo)其組分使用的表格。在一些應(yīng)用中，一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)成分可以以單獨(dú)的事先測(cè)量好的個(gè)人用量進(jìn)行包裝，典型包裝包括使用一次性使用的管或等同容器。在這樣的情況下，測(cè)試靶核酸的樣品可以被添加到單獨(dú)的管并直接進(jìn)行的擴(kuò)增。在試劑盒中提供的組分的量可以是任何適當(dāng)?shù)牧?，并且可以取決于目標(biāo)市場(chǎng)對(duì)該產(chǎn)品的需求。確定適當(dāng)?shù)牧康囊话銣?zhǔn)則可以在以下書籍中找到：例如，sambrook和russell著《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第3版)》(2001)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社；frederickm.ausube,《分子生物學(xué)方法》，johnwiley&sons出版社(2003)。

本發(fā)明的試劑盒可包括任何數(shù)量的對(duì)于實(shí)施本發(fā)明的方法有用的另外的試劑或物質(zhì)。這樣的物質(zhì)包括但不限于：細(xì)胞裂解試劑(包括緩沖液)，二價(jià)陽離子的螯合劑或抑制其它核酸的試劑，用于確保所述酶復(fù)合物和反應(yīng)的其它成分功能正常的對(duì)照dna，dna碎片試劑(包括緩沖液)，擴(kuò)增反應(yīng)試劑(包括緩存)，液和洗滌液?？梢栽谌魏螠囟认绿峁┍景l(fā)明的試劑盒。例如，對(duì)于含有蛋白質(zhì)成分或存在于液體中的復(fù)合物儲(chǔ)存時(shí)，最好保持低于0℃，優(yōu)選等于或低于-20℃，或以其他方式處于凍結(jié)狀態(tài)。

試劑盒的容器可以是任何常規(guī)的容器，其能夠保持所提供的形式，例如，微量離心管，安瓿瓶，或檢測(cè)裝置，例如液流設(shè)備，試劑盒，橫向流動(dòng)，或其他類似設(shè)備。所述試劑盒可以包括用于檢測(cè)的靶核酸標(biāo)記的或未標(biāo)記的核酸探針。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還可以包括指示要使用的組件中的任何本文描述的方法，例如，使用沒有核酸提取和/或純化的粗基質(zhì)的方法。對(duì)于這樣的試劑盒和系統(tǒng)典型的包裝材料包括固體基質(zhì)(例如玻璃，塑料，紙，箔，微粒等)，用于在各種設(shè)置下(如在小瓶，微量滴定板孔，微陣列等)，固定反應(yīng)成分或檢測(cè)探針。

所述的系統(tǒng)中，除了含有試劑盒組分，還可以包括用于測(cè)定的儀器，例如用于從標(biāo)記探針檢測(cè)信號(hào)的光度計(jì)。

說明書如書面指示或錄像示范詳述使用試劑盒或本發(fā)明的系統(tǒng)的方式，任選由試劑盒提供。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明在此提供了使用任何組合物或試劑盒的方法，也在此提供了對(duì)于任何方法或測(cè)定的實(shí)施方法和/或任何用于試劑盒實(shí)施任何測(cè)定或方法的裝置的使用。

任選地，試劑盒或本發(fā)明的系統(tǒng)還包括軟件，以加快數(shù)據(jù)的生成，分析和/或存儲(chǔ)，以及便于對(duì)數(shù)據(jù)庫的訪問。該軟件包括邏輯指令，指令集，或可以在數(shù)據(jù)的收集，存儲(chǔ)和/或分析中使用的合適的計(jì)算機(jī)程序。數(shù)據(jù)的比較和關(guān)聯(lián)分析可以使用試劑盒或本發(fā)明的系統(tǒng)附帶的軟件。

所有上述方法中，試劑和系統(tǒng)提供各種基于血液的，非侵入性的評(píng)估的受試者(經(jīng)其允許)的疾病狀態(tài)的診斷工具。這些試劑和系統(tǒng)診斷測(cè)試方法，其可以加上其他的篩選試驗(yàn)，例如胸部x射線或ct掃描的使用，提高診斷的準(zhǔn)確性和/或直接附加的測(cè)試。在其它方面，本文中所描述的本發(fā)明可以用于疾病的預(yù)后監(jiān)測(cè)和復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)的常規(guī)評(píng)估，基于監(jiān)測(cè)可以響應(yīng)于特定的療法。本文中所描述的本發(fā)明還可以用于存在于手術(shù)前和治療后樣品診斷特征的變化的評(píng)價(jià)，并確定反映腫瘤的存在和可用于評(píng)估復(fù)發(fā)的概率的基因表達(dá)譜。

采用上述方案后，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)和效果：本發(fā)明能夠從一個(gè)微創(chuàng)過程表征疾病狀態(tài)，即通過取血樣而不分離癌細(xì)胞。目前現(xiàn)有技術(shù)的做法從基因表達(dá)譜癌癥腫瘤的分類取決于組織樣品，通常是腫瘤樣品。在非常小的腫瘤的情況下，活檢是有問題的，如果腫瘤未發(fā)生或不可見，找到它的樣品是不可能的。本發(fā)明技術(shù)方案中當(dāng)對(duì)腫瘤樣品進(jìn)行分析時(shí)不需要對(duì)腫瘤進(jìn)行純化或分離；而當(dāng)血樣時(shí)其額外的優(yōu)勢(shì)在于該材料易于制備，且在后續(xù)的分析中相當(dāng)穩(wěn)定；在待分析樣本是mrna時(shí)，這種穩(wěn)定性顯得尤為重要。

附圖說明

構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的說明書附圖用來提供對(duì)本申請(qǐng)的進(jìn)一步理解，本申請(qǐng)的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本申請(qǐng)，并不構(gòu)成對(duì)本申請(qǐng)的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1示出了用突變的特異性引物說明等位基因特異性pcr(as-pcr)。其中，圖1a中寡核苷酸完全匹配突變序列并且允許用反向引物允許延伸和pcr擴(kuò)增(未示出)。圖1b中寡核苷酸在3'末端有不匹配并且不匹配野生型序列，從而防止了寡核苷酸延伸和擴(kuò)增。圖1c中有非特異性延伸發(fā)生并導(dǎo)致包含突變的等位基因的序列的假陽性pcr產(chǎn)物。

圖2a，2b和2c是本發(fā)明的系統(tǒng)原理示意圖。圖2a中一個(gè)阻斷物和野生型等位基因退火和延伸的阻斷物阻斷了外引物的pcr擴(kuò)增。圖2b中每個(gè)阻斷物在3'端不匹配，不和突變的等位基因退火，從而允許外引物擴(kuò)增。圖2c中非特異性延伸只導(dǎo)致整個(gè)特定模板的等位基因的在這一個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增失敗，無假陽性pcr產(chǎn)物形成。

具體實(shí)施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說明都是例示性的，旨在對(duì)本申請(qǐng)?zhí)峁┻M(jìn)一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本申請(qǐng)所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請(qǐng)的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。

需要說明的是，本申請(qǐng)的說明書和權(quán)利要求書及上述附圖中的術(shù)語“第一”、“第二”等是用于區(qū)別類似的對(duì)象，而不必用于描述特定的順序或先后次序。應(yīng)該理解這樣使用的數(shù)據(jù)在適當(dāng)情況下可以互換，以便這里描述的本申請(qǐng)的實(shí)施方式例如能夠以除了在這里圖示或描述的那些以外的順序?qū)嵤?。此外，術(shù)語“包括”和“具有”以及它們的任何變形，意圖在于覆蓋不排他的包含，例如，包含了一系列步驟或單元的過程、方法、系統(tǒng)、產(chǎn)品或設(shè)備不必限于清楚地列出的那些步驟或單元，而是可包括沒有清楚地列出的或?qū)τ谶@些過程、方法、產(chǎn)品或設(shè)備固有的其它步驟或單元。

正如背景技術(shù)所介紹的，現(xiàn)有技術(shù)中在許多情況下，野生型dna大大超過突變dna，使檢測(cè)和鑒定極低濃度少數(shù)等位基因極為困難，本發(fā)明提供了一種核酸分子組合物用于富集在目標(biāo)核酸的靶核酸序列的等位基因突變，包括：(a)能夠擴(kuò)增靶核酸序列的正向引物和反向引物和(b)包括第一段序列的第一阻斷物，此序列滿足下述要求(i)和靶核酸序列中的野生型等位基因相匹配或互補(bǔ)和(ii)能夠被dna聚合酶延伸。通過與特定核苷酸突變(如野生型突突變)匹配或者互補(bǔ)的寡核苷酸阻斷物能阻斷或者抑制特定的核酸突變的擴(kuò)增，從而允許其它突變(例如，突變變體)的富集，以檢測(cè)的目標(biāo)區(qū)域的核酸突變是否存在。

定義

“核酸”是指dna分子(例如，cdna或基因組dna)，rna分子(例如，mrna)，或dna或rna類似物。dna或rna類似物可從核苷酸類似物合成。所述核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈dna。

如本文使用的，術(shù)語“靶核酸”或“靶”指的是含有靶核酸序列的核酸。靶核酸可以是單鏈或雙鏈的，并且經(jīng)常是dna，rna，dna或rna或它們的組合的衍生物。“目標(biāo)核酸序列”，“靶核酸序列”或“目標(biāo)區(qū)域”是指包括所有或單鏈核酸的序列的一部分的特定序列。靶核酸序列可以是核酸模板范圍內(nèi)，其可以是任何形式的單鏈或雙鏈核酸。模板可以是純化的或分離的核酸，或可以是非純化的或非隔離的。

術(shù)語“等位基因”通常是指在對(duì)位于一對(duì)同源染色體的相同位置上，控制相對(duì)性狀的一對(duì)基因。例如，同源染色體上。等位基因可以指其中單個(gè)細(xì)胞或生物體或在多個(gè)細(xì)胞或生物體相同的物理位置(“allelelic變種”)的不同內(nèi)同源染色體上發(fā)現(xiàn)了同樣的物理位置之間不同的dna序列。在一些情況下，等位基因可以對(duì)應(yīng)于在特定物理位點(diǎn)的單核苷酸差異。在其它的實(shí)施方案和等位基因可對(duì)應(yīng)于核苷酸(單個(gè)或多個(gè))插入或缺失。

如本文所用，術(shù)語“稀有等位基因變異”是相較于替代等位基因變異在靶多核苷酸鏈中存量更低的等位基因突變。稀有等位基因變異也可被稱為“次要等位基因突變”和/或“突變等位基因突變”。例如，稀有等位基因變異可以在一個(gè)頻率上找到小于1/10，1/100，1/1000，1/10000，1/100000，1/1000000，1/10000000，1/100000000或1/1000000000相比另一個(gè)等位基因變異對(duì)于一個(gè)給定的snp或基因。換句話說，罕見等位基因變異可以是，在1，10，100，1000微升樣本或反應(yīng)體體積中有小于2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，50，75，100，250，500，750，1000，2500，5000，7500，10000，25000，50000，75000，100000，250000，500000，750000或1000000個(gè)拷貝。

如本文所用，術(shù)語“豐富等位基因變異”可以是指樣品中存在的比替代等位基因變異更高水平的變異。豐富等位基因變異也可被稱為一個(gè)“主要等位基因變異”和/或“野生型等位基因變異”。例如，豐富的等位基因變異的頻率可以是大于10×，100×，1000×，10000×，100000×，1000000×，10000000×，100000000×或1000000000×相比另一個(gè)等位基因變異對(duì)于一個(gè)給定的snp或基因。換句話說，豐富等位基因變異可以是，例如，在1，10，100，1000微升樣本或反應(yīng)體體積重有大于2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，50，75，100，250，500，750，1000，2500，5000，7500，10000，25000，50000，75000，100000，250000，500000，750000或1000000份個(gè)拷貝。

如本文所用的術(shù)語“擴(kuò)增”和它的變異包括任何用于產(chǎn)生多個(gè)拷貝或至少多核苷酸的一部分的互補(bǔ)鏈的方法，所述多核苷酸通常被稱為“模板”。該模板多核苷酸可以是單鏈或雙鏈。一個(gè)給定模板的擴(kuò)增產(chǎn)物的群體，統(tǒng)稱為“擴(kuò)增子”。擴(kuò)增子的多核苷酸可以是單鏈或雙鏈的，或者是兩者的混合物。通常情況下，模板將包括靶核酸序列，將所得的擴(kuò)增子將包括基本相同的序列，或與靶核酸序列基本上互補(bǔ)的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，特定的擴(kuò)增子的多核苷酸是基本上相同的，或基本上彼此互補(bǔ)；在一些實(shí)施例中一個(gè)給定的擴(kuò)增子內(nèi)的多核苷酸可以具有彼此不同的核苷酸序列。擴(kuò)增可以以線性或指數(shù)方式進(jìn)行，并且可以涉及一個(gè)給定模板的重復(fù)和連續(xù)的復(fù)制以形成兩個(gè)或更多的擴(kuò)增產(chǎn)物。一些典型的擴(kuò)增反應(yīng)涉及連續(xù)和重復(fù)的基于模板的核酸合成，從而產(chǎn)生多個(gè)包含模板的部分核苷酸序列子鏈，并在一定程度上共享模板核苷酸序列同一性或與模板或互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，每一例核酸合成可被稱為擴(kuò)增的一次“循環(huán)”，包括創(chuàng)建自由的3'端(例如，通過切口雙鏈dna的一條鏈)，由此產(chǎn)生的引物和引物延伸步驟；任選地，附加的變性步驟也可以包括其中模板是部分地或完全變性。在一些實(shí)施方案中，一輪擴(kuò)增包括擴(kuò)增的單個(gè)循環(huán)的重復(fù)給定的次數(shù)。例如，一個(gè)輪擴(kuò)增可以包括的5，10，15，20，25，30，35，40，50，75，100或更多次特定循環(huán)的重復(fù)。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，擴(kuò)增包括其中特定的多核苷酸模板進(jìn)行核酸合成的兩個(gè)連續(xù)循環(huán)的任何反應(yīng)。合成可以包括模板依賴性核酸合成。

“阻斷物”(這里也稱為“寡核苷酸阻斷物”，“阻斷物”，“阻斷物探針”或“寡阻斷物”)這個(gè)詞是指核酸的一條鏈或能夠雜交到一條由引物(正向引物或反向引物)的約束的，可以位于相同，相反或互補(bǔ)鏈上的組成特定的等位基因變異的dna鏈的寡核苷酸，該寡核苷酸可以減少或阻止該特定的等位基因變異的擴(kuò)增。阻斷物可以被設(shè)計(jì)得可以緊密結(jié)合野生型等位基因(例如，豐富等位基因變異)，以抑制野生型等位基因擴(kuò)增，而使得擴(kuò)增可以在相同或相反的鏈上的突變等位基因(例如，稀有的等位基因變異)的鏈上通過引物進(jìn)行延伸而發(fā)生。

術(shù)語“引物”或“引物寡核苷酸”是指單鏈核酸或能夠與模板核酸雜交并充當(dāng)延伸起始點(diǎn)，根據(jù)模板核酸的組成進(jìn)行核酸合成的一條寡核苷酸。術(shù)語“延伸核苷酸”是指能夠在擴(kuò)增期間被摻入延伸產(chǎn)物的任何核苷酸，即dna，rna或其dna或rna的衍生物如dna或rna，其可包括一個(gè)標(biāo)簽。

本文中所使用的“修飾堿基”一詞一般指的是核酸中與天然存在的堿基或堿基化學(xué)鍵不同的任何修飾。這種修飾包括堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)，或核酸中堿基的化學(xué)鍵，或核酸骨架結(jié)構(gòu)上的變化(參見實(shí)施例)。

術(shù)語“檢測(cè)探針”是指具有與其靶核酸序列充分互補(bǔ)、在嚴(yán)格的雜交條件下形成穩(wěn)定的探針:靶核酸序列雜交產(chǎn)物的一段寡核苷酸。探針通常是合成的寡聚物，其可包括與目標(biāo)區(qū)域以外的序列互補(bǔ)的堿基，這些堿基不影響在嚴(yán)格的雜交條件下探針與目標(biāo)核酸之間的雜交。一條不與靶核酸互補(bǔ)的序列可以是均聚物(例如poly-a或poly-t)，啟動(dòng)子序列，限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，或賦予期望的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)的序列(例如催化位點(diǎn)或發(fā)夾結(jié)構(gòu))，或有助于檢測(cè)和/或擴(kuò)增的標(biāo)記區(qū)域?！胺€(wěn)定”或“檢測(cè)穩(wěn)定”是指一個(gè)反應(yīng)混合物的溫度比混合物中所含的雙鏈核酸的熔解溫度(tm)低2℃，更優(yōu)選比tm低至少5℃，甚至更優(yōu)選比tm低至少10℃。

術(shù)語“雜交”或“退火”是指全部或者部分互補(bǔ)的核苷酸鏈能在特定條件下以平行或者優(yōu)選地反向平行形成一個(gè)穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)或區(qū)域，組成核苷酸的兩條鏈通過氫鍵連接在一起。雖然氫鍵通常在腺嘌呤和胸腺嘧啶或尿嘧啶(a和t或u)之間形成或胞嘧啶和鳥嘌呤(c和g)之間形成，其他堿基對(duì)可以形成氫鍵。

術(shù)語“優(yōu)先雜交(preferentiallyhybridize)”是指在嚴(yán)格雜交條件，核酸或寡核苷酸(例如引物，阻斷物，或探針)下可以雜交到其靶核酸序列形成穩(wěn)定的雜交體，例如指示在樣品中存在至少一個(gè)序列或感興趣的有機(jī)體。核酸與靶核酸特異性的雜交，即特異到足夠的程度能把靶核酸序列存在(或不存在)準(zhǔn)確地檢測(cè)出來。優(yōu)先雜交一般指的是樣品中的靶核酸序列和非靶核酸序列之間的的雜交信號(hào)至少有10倍的差異。

術(shù)語“嚴(yán)格的雜交條件”或“嚴(yán)格的條件”是指一條核酸或寡聚物特異性雜交到其預(yù)期的靶核酸序列，而不是另一序列的條件。嚴(yán)格的條件可能根據(jù)眾所周知的一些因素而變化，例如gc含量和序列長度，并且可由分子生物學(xué)的常用方法來預(yù)測(cè)或決定(例如標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定)。

術(shù)語“基本上同源”或“基本對(duì)應(yīng)”是指探針，核酸或寡核苷酸中的一段序列有至少10，20，30，40，50，100，150，200，300，400，或500個(gè)連續(xù)堿基，這些堿基有至少80％(優(yōu)選至少85％，90％，95％，96％，97％，98％和99％和最優(yōu)選100％)與參考序列的相同長度的連續(xù)堿基相同。序列之間的同源性可以表示為被比較的每組至少10個(gè)堿基中的錯(cuò)配堿基數(shù)。

術(shù)語“基本上互補(bǔ)”是指一個(gè)寡核苷酸包含一段至少10，20，30，40，50，100，150，200，300，400，或500連續(xù)堿基，這些堿基有至少80％(優(yōu)選至少85％，90％，95％，96％，97％，98％和99％和最優(yōu)選100％)與參考序列的相同長度的連續(xù)堿基相同。序列之間的同源性可以表示為被比較的每組至少10個(gè)堿基中的錯(cuò)配堿基數(shù)。

本文所使用的術(shù)語“受試者”指的是具有基因組的任何生物體，優(yōu)選地，活的動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物，這一直是診斷、治療、觀察或?qū)嶒?yàn)的對(duì)象。受試者的例子可以是人類，家畜動(dòng)物(肉牛和奶牛，羊，家禽，豬等)，或伴侶動(dòng)物(狗，貓，馬等)。

術(shù)語“生物樣品”是指從生物體(例如患者)或來自生物體的組成部分(例如細(xì)胞)獲得的樣品。所述樣品可以是任何生物組織，細(xì)胞或液體。所述樣品可以是“臨床樣品”，這是從受試者所來的樣品，如人類患者或獸醫(yī)受試者的樣品。這樣的樣品，包括但不限于：唾液，痰，血液，血細(xì)胞(例如白細(xì)胞)，羊水，血漿，精液，骨髓和組織或穿刺活檢樣本，尿液，腹膜液和胸膜液，或從中得到的細(xì)胞。生物樣品還可以包括組織切片，如用于組織學(xué)目的的冰凍切片。生物樣品也可以被稱為“患者樣品”。生物樣品也可以包括基本上純化或分離的蛋白，膜制劑，或細(xì)胞培養(yǎng)物。

如本文使用的，在用來指任何一套組成成分時(shí)，“接觸”的術(shù)語及其突變包括以下所述的任何過程，由此將接觸的成分混合成同樣的混合物(例如被添加到相同的隔室或溶液)，并不一定要求所列舉組分之間的實(shí)際物理接觸。所列舉的組分可以以任何順序或任何組合(或子組合)接觸，并且可以包括，其中一個(gè)或一些所列舉的組分隨后從混合物中除去，可選在添加其它所列的成分之前除去。例如，“a接觸b和c”，包括任意和所有的以下幾種情況：(ⅰ)a與c混合，然后b被加入到混合物中；(ⅱ)a和b混合成混合物；b從混合物中除去，然后c被加入到混合物中；和(iii)a被加入到b和c的混合物中?！胺磻?yīng)混合物與模板接觸”包括任何或所有的下列情況：(i)所述模板與所述反應(yīng)混合物的第一個(gè)組分接觸產(chǎn)生混合物；然后將反應(yīng)混合物的其它組分以任何順序或組合中加入混合物；和(ii)反應(yīng)混合物在于模板混合前完全混合.

本文所用術(shù)語“混合物”指的是無任何特定順序的成分的組合?；旌衔锍煞謴?fù)雜，空間上不能分離成不同的成分。混合物實(shí)例包括溶解在相同的水溶液中的不同元素，或許多空間上無法分別的以隨機(jī)或無任何特定的順序附著到固體支撐上的不同元素。換言之，一個(gè)混合物是不可尋址的。具體而言，本領(lǐng)域所熟知的表面結(jié)合的寡核苷酸陣列，不是表面結(jié)合的寡核苷酸混合物，因?yàn)楸砻娼Y(jié)合的寡核苷酸種類是空間上不同的且陣列是可尋址的。

通過“診斷”或“評(píng)估”癌癥(例如肺癌或黑色素瘤)指的是一種癌癥的診斷，癌癥發(fā)展階段的診斷，癌癥的類型或分類的診斷，癌癥復(fù)發(fā)的診斷或檢測(cè)，癌癥進(jìn)程的診斷或檢測(cè)，癌癥的預(yù)后，或癌癥對(duì)手術(shù)或非手術(shù)治療的反應(yīng)的評(píng)估。

通常，疾病或病癥的診斷是基于對(duì)一個(gè)或多個(gè)因素和/或指示該疾病的癥狀的評(píng)價(jià)。即，診斷是基于表示疾病或病癥存在與否的因素的存在，不存在或量。每個(gè)被認(rèn)為指示特定疾病的因素或癥狀并不需要與特定疾病唯一相關(guān)；即，有可能從一個(gè)診斷因素或癥狀推斷出不同的診斷結(jié)果。同樣地，可能存在這樣的情況，指示特定疾病的一個(gè)因素或癥狀存在于并不具有該病的個(gè)體中。診斷方法可以單獨(dú)使用，或與醫(yī)療領(lǐng)域中已知的對(duì)某種疾病或病癥的其它診斷方法和/或分期方法結(jié)合使用，例如，肺癌或黑色素瘤。

本文公開了一些數(shù)值范圍?？梢岳斫獾氖敲總€(gè)中間值，除非另有明確說明，到下限的單位的十分之一，該范圍的上限和下限也具體公開。在所述范圍內(nèi)或者所述范圍內(nèi)的中間值和任何其它所述值或中間值之間的每個(gè)較小的范圍也包含在本發(fā)明之內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可獨(dú)立地包括或排除在該范圍內(nèi)，并且包括在較小范圍內(nèi)的任一界限，無界限，或兩個(gè)界限的每個(gè)范圍也包括在本發(fā)明內(nèi)，服從于所述范圍內(nèi)的任意排除的界限。當(dāng)所述范圍包括一個(gè)或兩個(gè)界限時(shí)，不包括任一或兩個(gè)界限的范圍也包括在發(fā)明中。

術(shù)語“約”通常是指定數(shù)目的上下10％。例如，“大約20”指的是18至22之間；“約1”指的是0.9-1.1之間?！凹s”的意思可能在上下文中很清晰，如四舍五入，因此，“約1”也可以是指從0.5至1.4之間。

本發(fā)明公開了優(yōu)選的實(shí)施例，但是那些熟練的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到除了本發(fā)明所述以外，其它組分和條件也可用在本文所述的方法。

前述實(shí)例和優(yōu)選地實(shí)施例應(yīng)該理解為解釋本發(fā)明而不是受限于權(quán)利要求書所要求的本發(fā)明。容易理解，上述特征的變化和組合可以在不脫離本發(fā)明的權(quán)利要求書所要求的范圍中使用。這樣的變化不應(yīng)該被視為脫離本發(fā)明的范圍，并且所有這些變化旨在被包括在以下權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1

在此實(shí)施例中，三個(gè)突變熱點(diǎn)egfrt790m，egfrl858r、egfrexon19del和brafv600e/v600k/v600d/v600g/v600a/v600r作為示例來實(shí)施上述公開的方法。對(duì)幾種類型的pcr的化學(xué)和核酸修飾進(jìn)行了測(cè)試。下述結(jié)果證明本發(fā)明公開的富集系統(tǒng)是可行性的。

表1a為使用的阻斷物，其中，egfr-19del-f-4表示用于egfrexon19deletion的阻斷物序列。

表1a阻斷物序列

*:硫代磷酸酯鍵；+:lna

表1b為使用的引物；其中egfr_e19表示用于擴(kuò)增egfrexon19deletion的引物序列。

表1b引物序列

egfrt790m突變是tki靶向治療的患者體內(nèi)經(jīng)常發(fā)生的獲得性突變，在egfr790位置上的突變導(dǎo)致了甲硫氨酸取代了蘇氨酸。此突變的殘基增加了對(duì)atp的親和力且超過了抑制劑對(duì)atp的親和力。即使有5％的癌細(xì)胞獲得這種突變，患者對(duì)tki的敏感性也開始降低。因此有必要密切監(jiān)控t790m的出現(xiàn)。對(duì)t790m的檢測(cè)可以協(xié)助醫(yī)生在治療中做出決定把藥物轉(zhuǎn)向第三代egfrtki或者暫停用藥。

從含有egfrt790m突變的細(xì)胞系中抽提的dna按照不同的比例與野生型dna混合并富集(表2)。將所得文庫用illuminamiseq測(cè)序并用clc基因組工作臺(tái)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)分析。富集倍數(shù)隨著樣本突變濃度降低而增加。研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所公開的方法和系統(tǒng)能夠從含0.015％到8.5％的突變含量的樣品富集t790m，富集了583倍，并能有效的識(shí)別突變。

表2egfrt790m富集結(jié)果

egfrl858r是致癌驅(qū)動(dòng)突變，占了所有egfr激活肺癌的43％。從含有egfrl858r突變的細(xì)胞系中抽提的dna按照不同的比例與野生型dna混合并按照本發(fā)明所公開的方法和系統(tǒng)富集(表3)。和t790m結(jié)果類似，863倍的富集可以綽綽有余地檢測(cè)0.01％的突變等位基因。

表3egfrl858r富集結(jié)果

由于阻斷物是基于野生型序列設(shè)計(jì)，上述公開的方法和系統(tǒng)可以在任何特定的位點(diǎn)富集多于一種類型的突變。例如，在braf纈氨酸600位點(diǎn)上，上面公開的方法和系統(tǒng)具有通過一對(duì)阻斷物富集并v600e，v600k，v600d，v600g，v600a和v600r的突變。表4表明，除了v600e外，brafv600阻斷物還從有野生型背景的三個(gè)braf基因突變的混合物中同時(shí)富集了所有突變。

表4braf纈氨酸600突變混合物富集結(jié)果

*％所有突變?cè)谝吧捅尘跋碌模?，單個(gè)等位基因濃度不同

為了證明重復(fù)性，對(duì)8個(gè)0.01％的egfrt790m的富集進(jìn)行重復(fù)(表5)和富集范圍為4.1-7.9％，小于兩倍的差異。這些結(jié)果顯著高于野生型中因?yàn)楹塑账徨e(cuò)誤摻入而富集的人工突變(高達(dá)1.2％)，因此變異識(shí)別不受影響。為了檢測(cè)<0.01％的樣品的突變，如下所述可確定自信閾值。富集前和富集后的濃度非常類似于對(duì)數(shù)函數(shù)的單調(diào)遞增關(guān)系。鑒于富集結(jié)果是高度可重復(fù)的，可以使用對(duì)數(shù)關(guān)系來估計(jì)富集前的ctdna的濃度范圍，

表5從0.01％樣本中富集t790m的8個(gè)重復(fù)

本發(fā)明所公開的方法可進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增，這里顯示上述的所有三個(gè)位點(diǎn)可以共同富集(表6)。因此，本發(fā)明所公開的方法不僅可以現(xiàn)在建立多重芯片(panel)檢測(cè)表8中所列的突變，也可覆蓋將來為臨床證實(shí)的更多的突變。

表6三重富集結(jié)果

實(shí)施例2

rna能更有效地檢測(cè)各種激酶融合。一個(gè)alk或ros1融合轉(zhuǎn)錄本可以來自多個(gè)染色體重排，這些重排發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)域。對(duì)表達(dá)slc34a2-ros1融合基因的細(xì)胞系進(jìn)行了檢測(cè)。將rna逆轉(zhuǎn)錄并稀釋高至野生型cdna的100倍，在所有情況下，融合轉(zhuǎn)錄本都可以被識(shí)別。

總之，上述結(jié)果表明，本發(fā)明所公開的系統(tǒng)和方法可以檢測(cè)0.01％的突變，具有高重復(fù)性。而且系統(tǒng)能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)突變位點(diǎn)。

表7egfrt790m富集率提高

實(shí)施例3

對(duì)那些已有批準(zhǔn)療法的在≥1％nsclc患者體內(nèi)發(fā)生的突變?cè)O(shè)計(jì)引物和阻斷物，可以設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。

和引物類似，在每個(gè)位點(diǎn)的阻斷物也根據(jù)經(jīng)驗(yàn)證實(shí)，但常常需要進(jìn)一步優(yōu)化。本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了集中方法來調(diào)整阻斷物的組成，因此優(yōu)化了阻斷效率。表7顯示了每個(gè)egfrt790m阻斷物的效果以及如何調(diào)整提高富集效率。

表8列舉了可操作的具有明確的臨床用途的驅(qū)動(dòng)突變，其中egfrc.2231_2232ins18、egfrc.2237_2251del15、egfrc.2235_2246del12等都發(fā)生在egfrexon19del。每個(gè)突變用單重反應(yīng)測(cè)定，那些含有這些突變中的單個(gè)突變的細(xì)胞系dna滴定到1％，0.1％和0.01％用于富集。突變型和野生型dna用qubit定量，1％樣品的濃度使用qpcr和illuminamiseq測(cè)序證實(shí)。隨后從1％的樣品稀釋得到0.1％和0.01％的樣品。

表8待富集的有靶向藥突變列表

實(shí)施例4

在此實(shí)施例中，對(duì)多重富集和兼容性進(jìn)行檢測(cè)。

引物池首先在無阻斷物時(shí)測(cè)試并優(yōu)化以均勻擴(kuò)增。在非小細(xì)胞肺癌患者體內(nèi)可以共存的一組突變用來指導(dǎo)多重檢測(cè)。將含有這些兼容性突變的細(xì)胞系dna混合。多重富集反應(yīng)分別對(duì)1％，0.1％和0.01％dna混合物進(jìn)行，分別代表血液中ctdna的水平。所有突變位點(diǎn)都被同時(shí)富集。

表9alk和ros1融合列表

實(shí)施例5

在此實(shí)施例中，對(duì)具有頻繁融合部位的目標(biāo)區(qū)域富集進(jìn)行檢測(cè)。

引物被設(shè)計(jì)針對(duì)alk和ros1融合轉(zhuǎn)錄本(表9)。對(duì)包含這些融合的細(xì)胞系的cdna進(jìn)行測(cè)試。引物被首先用來測(cè)試擴(kuò)增效率，然后cdna與的野生型cdna不同比例稀釋，并確定了比較可信的所需的最小細(xì)胞量。

實(shí)施例6

對(duì)野生型dna最初的富集測(cè)試顯示出現(xiàn)了高達(dá)1.2％t790m突變等位基因，這是由于核苷酸摻入而放大的錯(cuò)誤。然而，在egfr790所觀察到的升高的錯(cuò)誤率在egfr858和braf600上要少的多。對(duì)每組阻斷物都進(jìn)行了大量測(cè)試以確定其可信閾值。在多個(gè)重復(fù)樣本中的50個(gè)野生型細(xì)胞系被用作陰性對(duì)照，以確定在每個(gè)位點(diǎn)上的人為誤差的范圍。

細(xì)胞游離dna(cfdna)標(biāo)準(zhǔn)品被用來測(cè)試panel。簡(jiǎn)要地說，上述突變dna滴度通過超聲打斷至類似cfdna，并進(jìn)行測(cè)試，以估計(jì)在每個(gè)滴度進(jìn)行可靠檢測(cè)所需要的cfdna量。細(xì)胞游離rna的標(biāo)準(zhǔn)品也以類似的方式產(chǎn)生并進(jìn)行測(cè)試。

液體活檢對(duì)從bioserve公司獲得的20去掉編號(hào)的nsclc(非小細(xì)胞肺癌)患者的樣品進(jìn)行了初步驗(yàn)證。樣品是一對(duì)標(biāo)本，一份是手術(shù)或者治療前的血漿，另一份是ffpe腫瘤組織。bioserve公司樣本采集還包括5例從靶向治療獲得的耐藥性。

表8中所列的驅(qū)動(dòng)突變的阻斷物被單獨(dú)測(cè)試以達(dá)到至少100倍的富集。然后，它們進(jìn)行多重富集測(cè)試。引物混合并優(yōu)化以使擴(kuò)增均一。覆蓋的均勻性，定義為存在的總堿基>0.2×平均覆蓋率，為90％或更高。阻斷物池然后進(jìn)行多重富集pcr檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物間的可能的寡聚物干擾。有問題的引物/阻斷物會(huì)進(jìn)行調(diào)整。表9中用來擴(kuò)增融合部位的引物都進(jìn)行測(cè)試以確保最佳檢測(cè)。對(duì)56個(gè)突變的每一個(gè)的突變識(shí)別閾值都單獨(dú)檢測(cè)。對(duì)樣品進(jìn)行處理以確定該配對(duì)組織和血液樣品之間的一致性。

根據(jù)初步數(shù)據(jù)和對(duì)pcr和阻斷化學(xué)的理解，所有這些突變位點(diǎn)都可以被共同富集。但是，如果出現(xiàn)阻斷物/引物不相容，該反應(yīng)可分成兩個(gè)。nsclc患者中可以共存的突變列表可被編輯(compiled)，至少這些可以并存的突變可以被共同富集。

交叉污染和假陽性的發(fā)生應(yīng)該是罕見的，但不是沒有可能。因?yàn)楹?jiǎn)單的工作流程和低成本，可以并行構(gòu)建來自同一患者的兩個(gè)文庫以盡量減少，如果不是消除，罕見的污染和假陽性的情況。

以上所述僅為本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本申請(qǐng)，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本申請(qǐng)可以有各種更改和變化。凡在本申請(qǐng)的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>蘇州艾達(dá)康醫(yī)療科技有限公司

<120>基于阻斷物的富集系統(tǒng)及其應(yīng)用

<130>

<160>25

<170>patentinversion3.51

<210>1

<211>17

<212>dna/rna

<213>人工序列

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(16)…(16)

<223>硫代磷酸酯鍵修飾的g

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(17)…(17)

<223>鎖核酸，

2'-o,4'-c-亞甲基β-d-呋喃核糖基鳥嘌呤

<400>1

cgtgcaactcatcacgg17

<210>2

<211>13

<212>dna/rna

<213>人工序列

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(12)…(12)

<223>硫代磷酸酯鍵修飾的t

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(13)…(13)

<223>鎖核酸，

2'-o,4'-c-亞甲基β-d-呋喃核糖基鳥嘌呤

<400>2

catgagctgcgtg13

<210>3

<211>15

<212>dna/rna

<213>人工序列

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(14)…(14)

<223>硫代磷酸酯鍵修飾的t

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(15)…(15)

<223>鎖核酸，

2'-o,4'-c-亞甲基β-d-呋喃核糖基鳥嘌呤

<400>3

ggcatgagctgcgtg15

<210>4

<211>15

<212>dna/rna

<213>人工序列

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(14)…(14)

<223>硫代磷酸酯鍵修飾的t

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(14)…(14)

<223>鎖核酸，

2'-o,4'-c-亞甲基β-d-呋喃核糖基胸腺嘧啶

<400>4

ggcatgagctgcgtg15

<210>5

<211>18

<212>dna/rna

<213>人工序列

<400>5

tcacagattttgggctgg18

<210>6

<211>15

<212>dna/rna

<213>人工序列

<400>6

aaactgctggttgac15

<210>7

<211>18

<212>dna/rna

<213>人工序列

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(17)…(17)

<223>硫代磷酸酯鍵修飾的g

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(17)…(17)

<223>鎖核酸，

2'-o,4'-c-亞甲基β-d-呋喃核糖基鳥嘌呤

<400>7

tcacagattttgggctgg18

<210>8

<211>14

<212>dna/rna

<213>人工序列

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(13)…(13)

<223>硫代磷酸酯鍵修飾的g

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(13)…(13)

<223>鎖核酸，

2'-o,4'-c-亞甲基β-d-呋喃核糖基鳥嘌呤

<400>8

gcagtttggccagc14

<210>9

<211>27

<212>dna/rna

<213>人工序列

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(26)…(26)

<223>硫代磷酸酯鍵修飾的c

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(26)…(26)

<223>鎖核酸，

2'-o,4'-c-亞甲基β-d-呋喃核糖基胞嘧啶

<400>9

gtcgctatcaaggaattaagagaagca27

<210>10

<211>15

<212>dna/rna

<213>人工序列

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(14)…(14)

<223>硫代磷酸酯鍵修飾的a

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(14)…(14)

<223>鎖核酸，

2'-o,4'-c-亞甲基β-d-呋喃核糖基腺嘌呤

<400>10

tgcctacgccaccag15

<210>11

<211>16

<212>dna/rna

<213>人工序列

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(15)…(15)

<223>硫代磷酸酯鍵修飾的t

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(15)…(15)

<223>鎖核酸，

2'-o,4'-c-亞甲基β-d-呋喃核糖基胸腺嘧啶

<400>11

gtagttggagctggtg16

<210>12

<211>19

<212>dna/rna

<213>人工序列

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(19)…(19)

<223>鎖核酸，

2'-o,4'-c-亞甲基β-d-呋喃核糖基腺嘌呤

<400>12

tttggtctagctacagtga19

<210>13

<211>19

<212>dna/rna

<213>人工序列

<400>13

actccatcgagatttcact19

<210>14

<211>21

<212>dna/rna

<213>人工序列

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(20)…(20)

<223>硫代磷酸酯鍵修飾的鳥嘌呤

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(20)…(20)

<223>鎖核酸，

2'-o,4'-c-亞甲基β-d-呋喃核糖基鳥嘌呤

<400>14

attttggtctagctacagtga21

<210>15

<211>19

<212>dna/rna

<213>人工序列

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(18)…(18)

<223>硫代磷酸酯鍵修飾的胞嘧啶

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(18)…(18)

<223>鎖核酸，

2'-o,4'-c-亞甲基β-d-呋喃核糖基胞嘧啶

<400>15

actccatcgagatttcact19

<210>16

<211>55

<212>dna/rna

<213>引物

<400>16

acactctttccctacacgacgctcttccgatctgtcatagggactctggatccca55

<210>17

<211>54

<212>dna/rna

<213>引物

<400>17

gactggagttcagacgtgtgctcttccgatctccacacagcaaagcagaaactc54

<210>18

<211>53

<212>dna/rna

<213>引物

<400>18

acactctttccctacacgacgctcttccgatctctccaggaagcctacgtgat53

<210>19

<211>52

<212>dna/rna

<213>引物

<400>19

gactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgtctttgtgttcccggacat52

<210>20

<211>55

<212>dna/rna

<213>引物

<400>20

acactctttccctacacgacgctcttccgatctggaacgtactggtgaaaacacc55

<210>21

<211>54

<212>dna/rna

<213>引物

<400>21

gactggagttcagacgtgtgctcttccgatcttgcctccttctgcatggtattc54

<210>22

<211>57

<212>dna/rna

<213>引物

<400>22

acactctttccctacacgacgctcttccgatctttcatgaagacctcacagtaaaaa57

<210>23

<211>52

<212>dna/rna

<213>引物

<400>23

gactggagttcagacgtgtgctcttccgatctccacaaaatggatccagaca52

<210>24

<211>53

<212>dna/rna

<213>引物

<400>24

acactctttccctacacgacgctcttccgatctaggcctgctgaaaatgactg53

<210>25

<211>54

<212>dna/rna

<213>引物

<400>25

gactggagttcagacgtgtgctcttccgatctttgttggatcatattcgtccac54