本發(fā)明涉及牲畜體內(nèi)支原體感染檢測方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測奶牛凍精中支原體的方法。

背景技術(shù)：

在冷凍精液的半永久性保存(-196℃)條件下，往往也能延長細菌、病毒、支原體、蟲卵等生物體的存活時間。許多病原微生物可以通過精液傳播，而且精液傳播傳染病的能量是很大的，l頭帶病公牛的冷凍精液可能在數(shù)年之內(nèi)把某些傳染病散播到全球幾個大陸?，F(xiàn)有資料表明:通過冷凍精液傳播的一些牛病主要有:口蹄疫、牛結(jié)核病副結(jié)核病、牛布氏桿菌病、牛毛滴蟲病、牛生殖器官弧菌病,各型鉤端螺旋體病,支原體病、牛傳染性鼻氣管炎、傳染性膿疤龜頭包皮炎、牛病毒性腹瀉和副流感、纖維乳頭狀瘤病、藍舌病、牛白血病等。

支原體是一類能在無活細胞培養(yǎng)基中繁殖的最小微生物，無細胞壁、繁殖形式多樣、具有高度多形性。大部分支原體都是宿主特異性的黏膜常在菌，主要寄生在鼻腔，其次在乳腺。1976年首次報道牛支原體與牛呼吸系統(tǒng)疾病有關(guān)，1983年我國黎濟申首次報道從患乳腺炎牛乳中牛分離到牛支原體。

目前，牛支原體的分離培養(yǎng)鑒定雖然能夠確診，但操作復雜，所需條件高，主要通過支原體培養(yǎng)和生理生化特性鑒定，這些方法耗費時間長，一般需要3天左右，不利于支原體感染疾病的快速診斷。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

(一)解決的技術(shù)問題

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種快速檢測奶牛凍精中支原體的方法，使得檢測時間大大縮短，極大的提高了檢測效率。

(二)技術(shù)方案

為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

一種快速檢測奶牛凍精中支原體的方法，步驟如下：(1)將奶牛凍精在常溫下解凍2-3min，解凍后取50ul置于1.5ml離心管中，在12000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min；(2)將離心后的上清液丟棄，加入0.5mldna提取裂解液，靜置5min；(3)靜置后繼續(xù)加入100ul氯仿，混合均勻，12000r/min轉(zhuǎn)速下離心3min，將上清液移到硅膠柱中，12000r/min轉(zhuǎn)速下離心1min；(4)離心后，加入50ul蒸餾水洗脫dna；(5)取2ul洗脫后的dna加入到18ulpcr混合液中，進行pcr反應(yīng)；(6)選用瓊脂糖凝膠電泳檢測方法，電泳20min，觀察結(jié)果。

優(yōu)選的，步驟(2)所述dna提取裂解液的配制方法為：取57.6g鹽酸胍、50ml水飽和酚，加入蒸餾水配置成100ml的溶液。

優(yōu)選的，步驟(5)所述pcr混合液的配制為：取2.5umdntp、160ul引物1、40ul引物2、40ultaqdna聚合酶、40ul緩沖液，加入640ul蒸餾水配置成0.92ml混合液。

優(yōu)選的，所述引物1為10umtaatttagaagctttaaatgagcgc，引物2為40umcatatctaggtcaattaaggctttg。

優(yōu)選的，所述緩沖液中含有1.5umkcl、2.0ummgcl2、3um甘油。

(三)有益效果

本發(fā)明提供了一種快速檢測奶牛凍精中支原體的方法，通過利用pcr方法，建立基于奶牛支原體核酸檢測的快速技術(shù)，能在3小時內(nèi)獲得結(jié)果，極大的提高了檢測效率，為支原體感染疾病治療和阻止支原體進一步擴散贏得了時間。

附圖說明

圖1是奶牛精液dna提取結(jié)果，圖2是奶牛支原體檢測結(jié)果。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例：

一種快速檢測奶牛凍精中支原體的方法，該方法用到的溶液如下：

dna提取裂解液：取57.6g鹽酸胍、50ml水飽和酚，加入蒸餾水配置成100ml溶液。

pcr混合液：取2.5umdntp、160ul引物1、40ul引物2、40ultaqdna聚合酶、40ul緩沖液，加入640ul蒸餾水配置成0.92ml混合液。其中，引物1為10umtaatttagaagctttaaatgagcgc，引物2為40umcatatctaggtcaattaaggctttg，緩沖液中含有1.5umkcl、2.0ummgcl2、3um甘油。

檢測步驟如下：

(1)將奶牛凍精在常溫下解凍3min，解凍后取50ul置于1.5ml離心管中，在12000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min；(2)將離心后的上清液丟棄，加入0.5mldna提取裂解液，靜置5min；(3)靜置后繼續(xù)加入100ul氯仿，混合均勻，12000r/min轉(zhuǎn)速下離心3min，將上清液移到硅膠柱中，12000r/min轉(zhuǎn)速下離心1min；(4)離心后，加入50ul蒸餾水洗脫dna；(5)取2ul洗脫后的dna加入到18ulpcr混合液中，進行pcr反應(yīng)；(6)選用瓊脂糖凝膠電泳檢測方法，電泳20min，觀察結(jié)果。

觀察結(jié)果：如圖2所示，說明奶牛凍精中有支原體產(chǎn)物生成。

綜上，本發(fā)明實施例具有如下有益效果：

本發(fā)明提供了一種快速檢測奶牛凍精中支原體的方法，通過利用pcr方法，能在3小時內(nèi)獲得結(jié)果，極大的提高了檢測效率，有利于及時治療支原體感染疾病。

需要說明的是，在本文中，諸如第一和第二等之類的關(guān)系術(shù)語僅僅用來將一個實體或者操作與另一個實體或操作區(qū)分開來，而不一定要求或者暗示這些實體或操作之間存在任何這種實際的關(guān)系或者順序。而且，術(shù)語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設(shè)備所固有的要素。在沒有更多限制的情況下，由語句“包括一個……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的過程、方法、物品或者設(shè)備中還存在另外的相同要素。

以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的精神和范圍。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種快速檢測奶牛凍精中支原體的方法，涉及牲畜體內(nèi)支原體感染檢測方法技術(shù)領(lǐng)域，是將解凍后的奶牛凍精離心處理，向上清液中依次加入DNA提取裂解液和氯仿，提取得到DNA，然后進行PCR擴增，最后采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測并觀察結(jié)果；該檢測方法通過利用PCR方法，建立基于奶牛支原體核酸檢測的快速技術(shù)，能在3小時內(nèi)獲得結(jié)果，極大的提高了檢測效率，為支原體感染疾病治療和阻止支原體進一步擴散贏得了時間。

技術(shù)研發(fā)人員：巴桑旺堆;朱彥賓;李純錦;羅布;平措占堆;德吉央宗;梁春芳;尼瑪;旺久;貢嘎桑布;付丹丹;王闖;次仁卓瑪
受保護的技術(shù)使用者：西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所
技術(shù)研發(fā)日：2017.03.28
技術(shù)公布日：2017.08.04