本發(fā)明涉及一種基于無(wú)細(xì)胞dna的癌癥早期診斷試劑盒及其應(yīng)用，屬于醫(yī)藥生物檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：無(wú)細(xì)胞dna又稱(chēng)循環(huán)dna，是指一種無(wú)細(xì)胞狀態(tài)的胞外dna，存在于血漿或血清、腦脊液及滑膜液等體液中。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，腫瘤臨床的早期診斷、鑒別診斷、有效觀察及預(yù)后檢測(cè)越來(lái)越受益于腫瘤分子標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)及其檢測(cè)方法的完善。目前認(rèn)為無(wú)細(xì)胞dna是一種無(wú)侵襲性的潛在用途較大的腫瘤標(biāo)志物。目前關(guān)于無(wú)細(xì)胞dna產(chǎn)生的生物學(xué)機(jī)制尚無(wú)定論，但是目前認(rèn)為無(wú)細(xì)胞dna可能來(lái)源于細(xì)胞凋亡或壞死后釋放的dna片段，這些片段通過(guò)毛細(xì)血管壁或淋巴管管壁滲透到血循環(huán)中；也可能來(lái)源于有核細(xì)胞裂解釋放的dna片段，外周血中存在結(jié)構(gòu)完整的腫瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞裂解后產(chǎn)生的dna片段占游離dna片段的大部分。研究表明各種腫瘤患者體內(nèi)的循環(huán)血中均存在腫瘤細(xì)胞，但這些細(xì)胞不是轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞。這些腫瘤細(xì)胞在外周血中在吞噬細(xì)胞的作用下裂解釋放出dna片段，即無(wú)細(xì)胞dna。無(wú)細(xì)胞dna檢測(cè)包括：突變位點(diǎn)檢測(cè)、常甲基化檢測(cè)以及雜合性缺失檢測(cè)等，但是這些檢測(cè)均需要較為復(fù)雜的分子生物學(xué)手段才能獲得結(jié)果，并且這些結(jié)果準(zhǔn)確度較差。一般來(lái)講，直接定量人體體液中無(wú)細(xì)胞dna是一種較好的檢測(cè)手段，但是由于無(wú)細(xì)胞dna以低濃度(0.2至200ng/ml)存在于血清、血漿和其它體液(即尿、腹水等)且高度降解(wang等，2003，cancerres.，63(14)：3966-8)，因此本領(lǐng)域中很難通過(guò)常規(guī)手段直接定量無(wú)細(xì)胞dna而獲得相關(guān)檢測(cè)結(jié)果，尤其是對(duì)于患有早期癌癥的患者來(lái)說(shuō)，目前的檢測(cè)手段很難通過(guò)定量無(wú)細(xì)胞dna將正常個(gè)體與患有早期癌癥的患者區(qū)別開(kāi)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：出人意料的是，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)當(dāng)對(duì)人體施用一定量的化合物或組合物后，患有早期腫瘤的患者體液中源于腫瘤的無(wú)細(xì)胞dna含量會(huì)急劇升高，而正常個(gè)體的無(wú)細(xì)胞dna含量卻無(wú)明顯變化。本發(fā)明的目的之一是提供一種基于無(wú)細(xì)胞dna定量檢測(cè)的癌癥早期診斷試劑盒，其包括具有提高人體免疫力的化合物或組合物以及定量檢測(cè)人體體液中無(wú)細(xì)胞dna的相關(guān)試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述具有提高人體免疫力的化合物或組合物包括但不限于：樹(shù)突細(xì)胞疫苗、免疫檢查點(diǎn)抑制劑、具有提高人體內(nèi)cd4+和cd8+t細(xì)胞比例的化合物以及具有免疫激活或免疫增強(qiáng)作用的中藥。進(jìn)一步地，所述具有提高人體免疫力的化合物或組合物為免疫檢查點(diǎn)抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫檢查點(diǎn)抑制劑選自抗ctla-4抗體、pd1阻斷劑、抗pd1抗體、lag-3抑制劑、pd-l1阻斷劑、抗pd-l1抗體、b7-h3抑制劑、b7-h4抑制劑和/或tim3抑制劑。在一個(gè)具體地實(shí)施方案中，所述抗ctla-4抗體是曲美木單抗(tremelimumab)或伊匹單抗(mdx-d010)；所述pd1阻斷劑是尼沃魯單抗(nivolumab)、蘭伯麗珠單抗(lambrolizumab)、ct-011和/或amp-224；pd-l1阻斷劑是bms-936559；所述lag-3抑制劑是imp321；所述b7-h3抑制劑是mga271。細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(ctla-4)是一種下調(diào)t細(xì)胞活化路徑的免疫檢查點(diǎn)蛋白(fong等人,cancerres.69(2):609-615,2009；webercancerimmunol.immunother,58:823-830,2009)。經(jīng)顯示，阻斷ctla-4可增進(jìn)t細(xì)胞活化和增殖。ctla-4抑制劑包括抗ctla-4抗體?？筩tla-4抗體結(jié)合到ctla-4并且阻斷ctla-4與它在抗原呈遞細(xì)胞上表達(dá)的配體cd80/cd86的相互作用，并由此阻斷由這些分子相互作用引起的免疫反應(yīng)的負(fù)面下調(diào)?？筩tla-4抗體的實(shí)例描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)：5811097、5811097、5855887、6051227、6207157、6682736、6984720及7605238中。一種抗ctla-4抗體是曲美木單抗(替西木單抗(ticilimumab)，cp-675206)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗ctla-4抗體是伊匹單抗(又稱(chēng)10d1，mdx-d010)，一種結(jié)合到ctla-4的完全人類(lèi)單克隆igg抗體。伊匹單抗是以yervoytm的名稱(chēng)銷(xiāo)售并且已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療無(wú)法切除或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。另一種免疫檢查點(diǎn)蛋白是程序性細(xì)胞死亡蛋白1(pd-1)。pd1在針對(duì)感染的發(fā)炎性反應(yīng)時(shí)限制周?chē)M織中的t細(xì)胞活性，并且為了限制自體免疫性，體外pd1阻斷響應(yīng)于特異性抗原靶或混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中的異體細(xì)胞的攻擊而增進(jìn)t細(xì)胞增殖和細(xì)胞激素產(chǎn)生。在pd1阻斷情況下，pd1表達(dá)與反應(yīng)之間顯示出強(qiáng)相關(guān)性(pardoll,naturereviewscancer,12:252-264,2012)。pd1阻斷可以通過(guò)多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)，包括了結(jié)合pd1或其配體pdl1的抗體。pd1和pdl1阻斷劑的實(shí)例描述于以下各案中：美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7488802、7943743、8008449、8168757、8217149；以及pct公開(kāi)的專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)杦o03042402、wo2008156712、wo2010089411、wo2010036959、wo2011066342、wo2011159877、wo2011082400及wo2011161699。在某些實(shí)施方案中，pd1阻斷劑包括抗pd-l1抗體。在某些其它實(shí)施方案中，pd1阻斷劑包括抗pd1抗體及類(lèi)似結(jié)合蛋白，如尼沃魯單抗(mdx1106、bms936558、ono4538)，一種結(jié)合pd-1并通過(guò)其配體pd-l1和pd-l2阻斷pd-1活化的完全人igg4抗體；蘭伯麗珠單抗(mk-3475或sch900475)，一種針對(duì)pd-1的人源化單克隆igg4抗體；ct-011，一種結(jié)合pd1的人源化抗體；amp-224，一種b7-dc的融合蛋白；抗體fc部分；用于阻斷pd-l1(b7-h1)的bms-936559(mdx-1105-01)；以及阿特朱單抗(atezolizumab)。其它免疫檢查點(diǎn)抑制劑包括淋巴細(xì)胞活化基因-3(lag-3)抑制劑，如imp321，一種可溶性ig融合蛋白(brignone等,2007,j.immunol.179:4202-4211)。其它免疫檢查點(diǎn)抑制劑包括b7抑制劑，如b7-h3和b7-h4抑制劑。確切地說(shuō)，抗b7-h3抗體mga271(loo等人,2012,clin.cancerres.(18)3834)。還包括tim3(t細(xì)胞免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和粘蛋白結(jié)構(gòu)域3)抑制劑(fourcade等,2010,j.exp.med.207:2175-86；及sakuishi等,2010,j.exp.med.207:2187-94)。在本發(fā)明試劑盒中，所述免疫檢查點(diǎn)抑制劑是以包含一種或多種其它組分(如生理上可接受的載劑、賦形劑或稀釋劑)的組合物形式施用。這些組合物可以包含一種或多種物質(zhì)，這些物質(zhì)選自由以下各物組成的組：緩沖劑；抗氧化劑，如抗壞血酸；低分子量多肽(如具有少于10個(gè)氨基酸的那些)；蛋白質(zhì)；氨基酸；碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或糊精；螯合劑，如edta；谷胱甘肽；穩(wěn)定劑；及賦形劑。中性緩沖生理鹽水或混有特定血清白蛋白的生理鹽水是適當(dāng)稀釋劑的實(shí)例。根據(jù)適當(dāng)工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，還可以添加防腐劑，如苯甲醇。所述組合物可以使用適當(dāng)賦形劑溶液(例如蔗糖)作為稀釋劑配制成凍干產(chǎn)物形式。適合的組分在所采用的劑量和濃度下對(duì)接受者無(wú)毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫檢查點(diǎn)抑制劑是抗ctla-4抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗ctla-4抗體是在20mmtrishc1、0.1m氯化鈉、0.1％w/v的甘露糖醇、0.1mm三胺五乙酸、0.01％w/v的聚山梨醇酯80(ph7.0)中以5mg/ml配制的伊匹單抗。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述具有免疫激活或免疫增強(qiáng)作用的中藥選自人參、黃芪、熟地黃、醋龜甲、女貞子、紅景天、薏苡仁、桑椹、梔子、三七、靈芝、枸杞子、靈芝、猴頭菇、竹蓀、香菇、玄參、黨參、丹參、決明子、銀杏以及決明子中一種或多種。在本發(fā)明中，所述定量檢測(cè)人體體液中無(wú)細(xì)胞dna的相關(guān)試劑包括提取以及純化人體體液無(wú)細(xì)胞dna的試劑以及用于精確定量dna的試劑。例如，市售的用于提取純化人體體液的無(wú)細(xì)胞dna試劑盒qiaampdna試劑盒(qiagenusa)，以及用于精確定量dna濃度的picogreen。所述試劑盒的檢測(cè)方法如下：(1)給受試者施用具有提高人體免疫力的化合物或組合物；(2)抽取受試者血清或血漿，離心制備無(wú)細(xì)胞血清或血漿，提取其中的無(wú)細(xì)胞dna；(3)測(cè)定無(wú)細(xì)胞dna的濃度。具體實(shí)施方式還可進(jìn)一步通過(guò)實(shí)施例來(lái)理解本發(fā)明，其中所述實(shí)施例說(shuō)明了一些制備或使用方法。然而，要理解的是，這些實(shí)施例不限制本發(fā)明。現(xiàn)在已知的或進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的本發(fā)明的變化被認(rèn)為落入本文中描述的和以下要求保護(hù)的本發(fā)明范圍之內(nèi)。術(shù)語(yǔ)“抗體”包括提到的任何同型或子類(lèi)的糖基化和非糖基化免疫球蛋白，或其與完整抗體競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合的抗原結(jié)合區(qū)，包括單克隆抗體、雙特異性抗體、微型抗體、結(jié)構(gòu)域抗體、合成抗體、抗體模擬物、嵌合抗體、人源化抗體、人類(lèi)抗體、抗體融合物、抗體偶聯(lián)物、單鏈抗體、抗體衍生物、抗體類(lèi)似物及其對(duì)應(yīng)的片段。還包括抗體的免疫片段(例如，fab、fab’、f(ab’)2或scfv)，不管此類(lèi)抗體是經(jīng)由免疫法，通過(guò)重組技術(shù)，借助于體外合成手段還是其它方法整體或部分產(chǎn)生的。因此，如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“抗體”包括那些通過(guò)重組手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體在內(nèi)，如(a)從關(guān)于人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)或由人免疫球蛋白基因制備的雜交瘤分離的抗體；(b)從被轉(zhuǎn)染以表達(dá)抗體的宿主細(xì)胞(例如由轉(zhuǎn)染瘤(transfectoma))分離的抗體；(c)從重組的組合抗體庫(kù)分離的抗體；及(d)通過(guò)涉及將免疫球蛋白基因序列剪接到其它dna序列上的任何其它手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。這些抗體具有源自于兩個(gè)不同動(dòng)物種類(lèi)的生殖系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。然而，在某些實(shí)施方案中，這些抗體可以經(jīng)歷體外誘變(或，當(dāng)使用關(guān)于人免疫球蛋白序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，并因此，這些抗體的vh區(qū)和vl區(qū)的氨基酸序列是盡管源自于特定物種(例如人類(lèi))的生殖系vh和vl序列并且與之相關(guān)，但可能并非在體內(nèi)天然存在于所述物種的抗體生殖系譜系內(nèi)的序列。除非另作指示，否則術(shù)語(yǔ)“抗體”除包含兩個(gè)全長(zhǎng)重鏈和兩個(gè)全長(zhǎng)輕鏈的抗體外，還包括其衍生物、變體、片段及突變蛋白。在一些情形中，“抗體”可包括較少鏈，如在駱駝中天然存在的可能僅包含重鏈的抗體。術(shù)語(yǔ)“患者”或“受試者”可互換使用，并且意思指哺乳動(dòng)物，包括但不限于，人類(lèi)或非人類(lèi)哺乳動(dòng)物，如牛、馬、犬、綿羊或貓。優(yōu)選地，患者是人類(lèi)。實(shí)施例1受試者體液無(wú)細(xì)胞dna的提取及dna定量隨機(jī)從醫(yī)院收取200例早期癌癥患者血液樣本和100例正常人的血清樣本，在200例早期癌癥患者中，其中肺癌患者27例、白血病患者32例、卵巢癌患者25例、子宮癌患者21例、胰腺癌患者33例、胃癌患者35例和肝癌患者27例。在給藥前分別抽取200例患者和100例正常人的血液樣本，然后靜脈注射方式給予200例患者和50例正常人阿特朱單抗(atezolizumab，genentech，usa)0.1mg/kg；另外50例正常人靜脈注射等量生理鹽水作為對(duì)照，注射2天后再次抽取200例患者和100例正常人血液樣本。然后將這些血樣放進(jìn)含5毫升edta的離心管，用離心機(jī)3000g常溫10分鐘離心，抽取上清液。qiaampdna試劑盒(qiagenusa)按廠家程序說(shuō)明提純cell-freedna。部分提純后的dna用quant-ittmdsdnaassaykit(thermofisher，usa)定量其濃度。具體結(jié)果如下：1、總樣本分析cfdna(ng/ml)早期癌癥患者正常組對(duì)照組給藥前10.4±2.98.4±2.48.1±2.6給藥后19.2±3.7*＊8.6±2.38.2±2.1*＊表明經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)患者組與其他組相比，p<0.01結(jié)果表明，在沒(méi)有給予免疫檢查點(diǎn)抑制劑之前，早期癌癥患者和正常人血液樣本中的cfdna含量相比，雖然略有升高，但是統(tǒng)計(jì)學(xué)并不存在差異，而在給藥后早期癌癥患者的cfdna含量接近提高了1倍，而正常人卻沒(méi)有明顯改變。有趣的是，本發(fā)明對(duì)多種不同通路的免疫檢查點(diǎn)抑制劑(例如，伊匹單抗，尼沃魯單抗，替西木單抗等等)進(jìn)行了測(cè)試，均發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的結(jié)果。這提示免疫檢查點(diǎn)抑制劑和cfdna聯(lián)合應(yīng)用具有極佳的癌癥早期診斷價(jià)值。并且在后續(xù)的隨訪觀察中，在上述劑量下的阿特朱單抗對(duì)患者及正常人健康沒(méi)見(jiàn)任何影響。2、肺癌患者樣本分析cfdna(ng/ml)肺癌患者正常組對(duì)照組給藥前10.9±3.18.4±2.48.1±2.6給藥后20.6±3.9*＊8.6±2.38.2±2.13、白血病患者樣本分析cfdna(ng/ml)白血病患者正常組對(duì)照組給藥前9.6±2.48.4±2.48.1±2.6給藥后18.3±3.2*＊8.6±2.38.2±2.14、卵巢癌患者樣本分析cfdna(ng/ml)卵巢癌患者正常組對(duì)照組給藥前11.1±3.28.4±2.48.1±2.6給藥后21.2±4.1*＊8.6±2.38.2±2.15、子宮癌患者樣本分析cfdna(ng/ml)子宮癌患者正常組對(duì)照組給藥前10.6±2.98.4±2.48.1±2.6給藥后19.9±3.8*＊8.6±2.38.2±2.16、胰腺癌患者樣本分析cfdna(ng/ml)胰腺癌患者正常組對(duì)照組給藥前9.3±2.38.4±2.48.1±2.6給藥后18.2±3.2*＊8.6±2.38.2±2.17、胃癌患者樣本分析cfdna(ng/ml)胃癌患者正常組對(duì)照組給藥前9.1±2.18.4±2.48.1±2.6給藥后18.3±3.3*＊8.6±2.38.2±2.18、肝癌患者樣本分析cfdna(ng/ml)肝癌患者正常組對(duì)照組給藥前10.3±2.88.4±2.48.1±2.6給藥后19.1±3.6*＊8.6±2.38.2±2.1實(shí)施例2臨床研究在醫(yī)院腫瘤科收集200例隨機(jī)樣本(在檢查前，患者患癌情況未知)，給藥前抽取患者血液，然后靜脈注射給予阿特朱單抗(atezolizumab，genentech，usa)0.1mg/kg，2天后再次抽取患者血液，按照實(shí)施例1的方法提取及定量cfdna并計(jì)算患癌風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)，對(duì)單一患者而言，患癌風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)＝給藥后cfdna含量/給藥前cfdna含量；當(dāng)患癌風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)>2時(shí)即判定患者有極大的患癌風(fēng)險(xiǎn)，需要進(jìn)一步地臨床檢查。結(jié)果表明，在200例樣本中，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)42例患者患癌風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)>2，在后續(xù)的臨床醫(yī)學(xué)檢查中進(jìn)行了確診，無(wú)一假陽(yáng)性情況出現(xiàn)。但是在患者患癌風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)<2的樣本中，有1例在后續(xù)的檢查中確診患癌。雖然如此，鑒于癌癥早期診斷的困難性，因此這并不影響本發(fā)明試劑盒在癌癥早期診斷中的應(yīng)用。本
發(fā)明內(nèi)容僅僅舉例說(shuō)明了要求保護(hù)的一些具體實(shí)施方案，其中一個(gè)或更多個(gè)技術(shù)方案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個(gè)或多個(gè)技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案也在本申請(qǐng)保護(hù)范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容中具體記載一樣。當(dāng)前第1頁(yè)12