本發(fā)明涉及微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的試劑盒及用途。

背景技術(shù)：

牛支原體(mycoplasmabovis，m.bovis)是感染牛的一種重要的致病性病原體，1961年hale在美國首次從患乳腺炎的牛乳中分離到該病原，它屬于柔膜體綱、支原體目、支原體科、支原體屬，可以引起牛肺炎、乳房炎、關(guān)節(jié)炎、生殖道炎和流產(chǎn)等多種臨床疾病。我國在2008年從患肺炎的犢牛肺臟中首次分離到該病原，此后相繼在重慶、甘肅、寧夏、貴州、山西、吉林等大部分省份報(bào)道了牛支原體病。我國牛場牛支原體肺炎的發(fā)病率在50％～100％，病死率高達(dá)10％～50％，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

牛支原體的主要傳播途徑是通過飛沫呼吸道傳播，在養(yǎng)殖場環(huán)境中感染牛支原體的帶菌?？赏ㄟ^咳嗽以及呼出的氣體、乳汁等將病原排出體外，漂浮在空氣中，在避免陽光直射條件下可存活數(shù)周，因此，健康動物經(jīng)呼吸道吸入牛支原體氣溶膠后即可感染，引發(fā)疾病。

目前國內(nèi)外還沒有理想的疫苗可以預(yù)防本病，許多研究顯示牛支原體疫苗的保護(hù)作用甚微弱，所以通過疫苗增強(qiáng)牛的免疫力目前還難以實(shí)現(xiàn)。支原體沒有細(xì)胞壁，而多數(shù)細(xì)菌都有細(xì)胞壁，這使得現(xiàn)有抗生素對支原體的殺菌效果不明顯。因此，通過定期監(jiān)測，結(jié)合衛(wèi)生消毒及生物安全防控等可有效預(yù)防本病的發(fā)生?，F(xiàn)有常用的牛支原體診斷方法如病原的分離培養(yǎng)、核酸檢測以及血清學(xué)方法都很難做到早期預(yù)警和隱性感染牛的篩查。

以環(huán)境氣溶膠樣本為監(jiān)測對象，應(yīng)用靈敏、特異和快速的real-timepcr方法可以有效地進(jìn)行群體監(jiān)測，并對牛場衛(wèi)生消毒和生物安全效果進(jìn)行評估。但由于牛支原體氣溶膠中細(xì)菌的含量很低，對檢測方法的靈敏度要求很高，再加之氣溶膠樣本的采集相對較困難，因此，目前還未有針對牛支原體氣溶膠采用taqman技術(shù)進(jìn)行檢測的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種檢測環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的試劑盒及用途。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的引物和探針組合，包括正向引物、反向引物和探針；其正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物序列如seqidno.2所示，探針序列如seqidno.3所示。

具體序列如下：

正向引物：5′-agctgatggcggtatacaacaa-3′；(seqidno.1)

反向引物：5′-catatctaggtcaattaaggctttggt-3′；(seqidno.2)

探針：5′-(vic)acgcttaatataaacatccctgtta(bhq-2)-3′(seqidno.3)。

第二方面，本發(fā)明提供一種用于檢測環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的試劑盒，該試劑盒中包含上述的引物和探針組合。

進(jìn)一步的，該試劑盒中還包括：陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、陰性對照和實(shí)時熒光定量pcr(qpcr)試劑。

所述陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒由含有如seqidno.4所示(141個堿基)的核苷酸片段構(gòu)成的peasy-t3重組質(zhì)粒組成；具體如下：

5'-gacttagttatagctgatggcggtatacaacaagttaatgaagctaaaaaaacgcttaaaacgcttaatataaacatccctgttattggattagtaaaaaatgagtttcacaaaaccaaagccttaattgacctagatatg-3'；(seqidno.4)

所述陰性對照為peasy-y3空載質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

所述實(shí)時熒光定量pcr(qpcr)試劑為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)試劑。

第三方面，本發(fā)明提供一種非診斷目的的檢測環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的方法，步驟如下：

(1)采集環(huán)境氣溶膠樣本；

(2)提取氣溶膠樣本的基因組總dna；

(3)以提取的基因組總dna為模板，采用上述的試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增體系的擴(kuò)增曲線對環(huán)境氣溶膠樣本中是否含有牛支原體進(jìn)行判斷，擴(kuò)增曲線ct值≤37.0時，擴(kuò)增曲線成s型曲線，則表明氣溶膠樣本中含有牛支原體病原核酸，檢測結(jié)果為陽性；當(dāng)擴(kuò)增曲線ct值＞37.0時，擴(kuò)增曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有牛支原體病原核酸，檢測結(jié)果為陰性。

步驟(1)中，采集環(huán)境氣溶膠樣本的方法為：采用國際標(biāo)準(zhǔn)的全玻璃液體沖擊式采樣器(all-glass-impinger，簡稱agi)，以30ml含0.01％(v/v)牛血清白蛋白的pbs(ph7.0)為采樣介質(zhì)，按照12.5l/min的采樣流量采集30min，收集養(yǎng)殖場環(huán)境中的氣溶膠樣本。

步驟(2)中，提取氣溶膠樣本的基因組總dna的方法為：將采集到的氣溶膠樣本在室溫下離心，棄上清液，應(yīng)用細(xì)菌基因組dna試劑盒(商業(yè)化產(chǎn)品，現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)試劑盒)提取總dna。

步驟(3)中，擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μl，包括2×probeqpcrmix10μl，模板1μl，10μmol/l的正向引物和反向引物各0.9μl，probe0.8μl，rnasefreeddh2o6.4μl。

步驟(3)中，擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：預(yù)變性95℃30s，然后95℃變性5s、60℃退火延伸30s進(jìn)行45個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束后采集熒光信號，最后40℃30s反應(yīng)結(jié)束。

本發(fā)明的有益效果：

(1)對現(xiàn)有技術(shù)中對牛支原體的防治現(xiàn)狀及危害的分析，本發(fā)明選擇牛支原體所共有的uvrc基因序列設(shè)計(jì)合成引物，建立taqman實(shí)時熒光定量pcr，可對養(yǎng)殖場氣溶膠樣本中牛支原體與其它病原進(jìn)行區(qū)分，并在養(yǎng)殖場環(huán)境中開展牛支原體病的流行病學(xué)調(diào)查，對養(yǎng)殖場中不同環(huán)境區(qū)域，包括動物飼養(yǎng)舍、運(yùn)動場、擠奶廳及產(chǎn)房等采集氣溶膠樣本，利用taqman實(shí)時熒光定量pcr檢測牛支原體的含量及其分布情況，為場區(qū)衛(wèi)生消毒試劑的選擇、使用次數(shù)及重點(diǎn)消毒區(qū)域的確定提供參考。

(2)本發(fā)明的試劑盒可以檢測養(yǎng)殖場環(huán)境氣溶膠中牛支原體，具有簡捷快速、靈敏特異、低廉準(zhǔn)確及實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。利用本發(fā)明的方法可以對養(yǎng)殖場環(huán)境氣溶膠中的牛支原體的流行與隱性感染進(jìn)行群體監(jiān)測，為養(yǎng)殖場牛支原體病的防控提供技術(shù)支持，也可以開展牛支原體病的流行病學(xué)調(diào)查，為牛支原體病的科學(xué)防控提供理論支撐。

(3)本發(fā)明建立的taqman實(shí)時熒光定量pcr方法，通過倍比稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行靈敏度檢測，最低濃度為4.0拷貝/反應(yīng)。以牛支原體、無乳支原體、絲狀支原體絲狀亞種sc型、絲狀支原體山羊亞種、綿羊肺炎支原體、山羊支原體山羊肺炎亞種、溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、睡眠嗜組織菌基因組dna等為模板，在建立的檢測方法下進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明僅有牛支原體有陽性擴(kuò)增，其他菌株擴(kuò)增均為陰性，表明與其他菌株無交叉反應(yīng)，具有很強(qiáng)的特異性。

對3個不同濃度的陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了批內(nèi)檢測和批間檢測，計(jì)算出批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)，其批內(nèi)誤差和批間誤差均小于10％。批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)ct值的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明：相同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒ct值之間差異均不顯著(p>0.05)。

本發(fā)明所述的檢測環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的試劑盒及用途，既可應(yīng)用于養(yǎng)殖場環(huán)境氣溶膠中牛支原體的檢測與鑒定，也可用于臨床血液、血清、奶樣、鼻拭子、組織等樣本的檢測與鑒定。本發(fā)明的方法可用于養(yǎng)殖場環(huán)境中臨床樣本的直接檢測，也可用于科學(xué)研究等非疾病的診斷。

附圖說明

構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本申請的進(jìn)一步理解，本申請的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本申請，并不構(gòu)成對本申請的不當(dāng)限定。

圖1：taqman實(shí)時熒光定量pcr檢測牛支原體標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線(熒光定量pcr儀自動生成)，利用480ⅱ中g(shù)enescanningsoftwareversion1.5的absquant/2ndderivativemax分析模式建立擴(kuò)增動力學(xué)曲線，圖中，曲線1-9代表4.0×10⁸-4.0×10⁰拷貝數(shù)/反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，曲線10為陰性對照，每個濃度設(shè)3個重復(fù)。

圖2：taqman實(shí)時熒光定量pcr檢測牛支原體標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用480ⅱ中g(shù)enescanningsoftwareversion1.5的absquant/2ndderivativemax分析模式分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果各點(diǎn)基本在一條直線上，圖中，各點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度從左到右依次為4.0×10²-4.0×10⁸拷貝數(shù)/反應(yīng)。

圖3：普通pcr檢測牛支原體靈敏性擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳檢測，圖中，1-9號泳道分別是模板為4.0×10⁸-4.0×10⁰拷貝數(shù)/反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，10號泳道為陰性對照。

圖4：taqman實(shí)時熒光定量pcr檢測牛支原體特異性擴(kuò)增曲線，其中，曲線1和2的模板分別為，4.0×10⁴拷貝數(shù)/反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品和牛支原體dna，均為s型曲線；曲線3-10分別為：無乳支原體、絲狀支原體絲狀亞種sc型、絲狀支原體山羊亞種、綿羊肺炎支原體、山羊支原體山羊肺炎亞種、溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、睡眠嗜組織菌，均為一條直線，擴(kuò)增反應(yīng)為陰性；曲線11為陰性對照。

具體實(shí)施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說明都是例示性的，旨在對本申請?zhí)峁┻M(jìn)一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本申請所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。

正如背景技術(shù)所介紹的，現(xiàn)有技術(shù)中還未針對牛支原體氣溶膠采用taqman技術(shù)進(jìn)行檢測的相關(guān)報(bào)道?；诖耍景l(fā)明提出了一種檢測環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的試劑盒及用途。

在本申請的一種實(shí)施方案中，提供了一種用于檢測環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的引物和探針組合，包括正向引物、反向引物和探針；其正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物序列如seqidno.2所示，探針序列如seqidno.3所示。

具體序列如下：

正向引物：5′-agctgatggcggtatacaacaa-3′；(seqidno.1)

反向引物：5′-catatctaggtcaattaaggctttggt-3′；(seqidno.2)

探針：5′-(vic)acgcttaatataaacatccctgtta(bhq-2)-3′(seqidno.3)。

上述探針的5′端標(biāo)記vic，3′端標(biāo)記bhq-2。

檢測環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的難點(diǎn)主要為：

一方面，氣溶膠(aerosol)是指懸浮在氣體中的固體和/或液體微粒與氣體載體共同組成的多相體系。根據(jù)微粒的成分可以劃分為生物氣溶膠和化學(xué)氣溶膠。在氣溶膠的體系中，把具有生命的氣溶膠粒子和活性粒子以及由有生命活性的機(jī)體所釋放到空氣中的各種質(zhì)粒統(tǒng)稱為生物氣溶膠，又稱為微生物氣溶膠，主要分為細(xì)菌氣溶膠、病毒氣溶膠和真菌氣溶膠等，與人類及動物的健康密切相關(guān)。通過監(jiān)測養(yǎng)殖場環(huán)境中氣溶膠微生物，可以有效地預(yù)警預(yù)測傳染病的暴發(fā)流行。

但由于氣溶膠樣本的采集相對較困難，而且氣溶膠中牛支原體的含量較低，若有效檢出氣溶膠中的目標(biāo)病原體，對檢測方法的靈敏度要求很高。因此，目前對于牛支原體多采用鼻拭子樣本進(jìn)行檢測，針對的是單一個體，難以實(shí)現(xiàn)群體監(jiān)測。

另一方面，牛支原體的保守16srna序列與無乳支原體pg2株同源性高達(dá)99％，但是其表面膜蛋白的同源性非常低，可以通過p81基因的體外表達(dá)產(chǎn)物建立一種敏感的血清學(xué)診斷方法。因此，金云云等人為快速檢測牛支原體，根據(jù)genbank中登錄的牛支原體p81基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過條件優(yōu)化，建立了牛支原體環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法。

關(guān)于牛支原體致病機(jī)理的研究目前尚無統(tǒng)一定論，但是眾多學(xué)者認(rèn)為其對宿主細(xì)胞的黏附作用是其感染宿主的第一步，而這種黏附作用主要由牛支原體表面的眾多脂蛋白來完成，p48蛋白作為牛支原體表面的一種脂蛋白，具有高度的保守性。因此，有報(bào)道根據(jù)牛支原體p48脂蛋白基因和無乳支原體基因之間的差異，設(shè)計(jì)并篩選出一對特異性pcr擴(kuò)增引物，建立了牛支原體的pcr快速檢測方法。

oppd/f是寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)atp結(jié)合蛋白質(zhì)的簡稱，是牛支原體特異性基因，編碼牛支原體2條短肽。有報(bào)道根據(jù)牛支原體oppd/f基因的特異性保守序列設(shè)計(jì)的，用以定性、定量檢測待測樣品中的牛支原體。

因此，對于牛支原體而言，能夠作為靶標(biāo)序列的保守基因種類很多，以不同的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物不同，對于牛支原體的診斷和檢測效果并不相同。本申請對用于設(shè)計(jì)引物的牛支原體的靶標(biāo)序列進(jìn)行了優(yōu)化篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以uvrc基因作為靶標(biāo)序列設(shè)計(jì)引物，靈敏度高，特異性強(qiáng)。

本申請?jiān)谠囼?yàn)過程中，設(shè)計(jì)了多組不同的引物和探針，并分別進(jìn)行組合，經(jīng)反應(yīng)后分別檢測其特異性和擴(kuò)增效率，以篩選最優(yōu)的可用于臨床檢測的引物和探針組合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以上述的引物和探針組合對牛支原體進(jìn)行檢測的特異性和靈敏度最優(yōu)，能夠適用于牛支原體氣溶膠樣本的檢測。而其他的引物和探針組合則不能滿足對于氣溶膠中牛支原體檢測的靈敏度要求。

在本申請的另一種實(shí)施方案中，提供了一種用于檢測環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的試劑盒，該試劑盒中包含上述的引物和探針組合；還包括：陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、陰性對照和實(shí)時熒光定量pcr(qpcr)試劑。

所述陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒由含有如seqidno.4所示(141個堿基)的核苷酸片段構(gòu)成的peasy-t3重組質(zhì)粒組成；具體如下：

5'-gacttagttatagctgatggcggtatacaacaagttaatgaagctaaaaaaacgcttaaaacgcttaatataaacatccctgttattggattagtaaaaaatgagtttcacaaaaccaaagccttaattgacctagatatg-3'；(seqidno.4)

所述陰性對照為peasy-y3空載質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

本申請利用taqman實(shí)時熒光定量pcr檢測牛支原體的含量及其分布情況，預(yù)報(bào)牛支原體發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，為場區(qū)衛(wèi)生消毒試劑的選擇、使用次數(shù)及重點(diǎn)消毒區(qū)域的確定提供參考。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本申請的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實(shí)施例詳細(xì)說明本申請的技術(shù)方案。

480ⅱ熒光定量pcr儀(羅氏公司)，梯度pcr儀(takara公司)，ms-i型多功能微生物采樣器(青島眾瑞智能儀器有限公司)。細(xì)菌基因組dna提取試劑盒(目錄號：dp302)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(目錄號：dp209)和高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒(目錄號：dp107)購自天跟生化科技(北京)有限公司；peasy-t3載體試劑盒購自北京全式金生物科技有限公司。probeqpcrmix試劑盒(codeno.：rr391)、lataq(codeno.：rr02ma)均購自寶生物工程(大連)有限公司。其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

無乳支原體(mycoplasmaagalactiae)pg2株、絲狀支原體絲狀亞種sc型(mycoplasmamycoidessubsp.mycoidessmallcolony，mmmsc)pg1株、絲狀支原體山羊亞種(mycoplasmamycoidessubsp.capri,mmc)pg3株、綿羊肺炎支原體(mycoplasmaovipneumonia，mo)y98株、山羊支原體山羊肺炎亞種(mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae，mccp)87001株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。牛支原體、多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌、睡眠嗜組織菌均由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；臨床上確診為牛支原體陽性的氣溶膠dna樣本由山東師范大學(xué)反芻動物疾病研究中心保存。

本發(fā)明實(shí)施例中所用的未進(jìn)行具體說明試驗(yàn)材料均為本領(lǐng)域常規(guī)的試驗(yàn)材料，均可通過商業(yè)渠道購買得到。

實(shí)施例1：引物與探針的設(shè)計(jì)

參考genebank中牛支原體特異性的uvrc基因(gengbankno.af003959)和oppd基因(gengbankno.af130119.1)，利用primerexpress3.0軟件設(shè)計(jì)七對特異性引物和探針，具體序列見表1。設(shè)計(jì)引物時，首先在genebank數(shù)據(jù)上blast了引物設(shè)計(jì)區(qū)域uvrc基因和oppd-oppf基因的保守性，均與現(xiàn)有牛支原體菌株序列100％匹配。再對設(shè)計(jì)的上下游引物和探針進(jìn)行blast對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均不與其他基因序列相匹配，保證了引物序列的特異性。經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選了一對最佳的引物(如seqidno.1、2所示)和探針(如seqidno.3所示)，由華大基因合成，預(yù)期擴(kuò)增dna產(chǎn)物130bp。

表1牛支原體特異性的引物對與探針序列

實(shí)施例2：檢測環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體方法的建立及檢測方法的靈敏性、特異性考察

1、牛支原體uvrc基因部分片段的擴(kuò)增

以牛支原體陽性病料dna作為模板，應(yīng)用上游引物mb-141-f：5'-gacttagttatagctgatggcggtatac-3'和下游引物mb-r：5'-catatctaggtcaattaaggctttggt-3'(seqidno.2所示)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50μl：10×lapcrbufferii(mg²⁺plus)5μl、2.5mmdntpmixture8μl、lataq0.5μl(5u/μl)、模板2μl，10μmol/l的上、下游引物分別為1μl，滅菌超純水32.5μl。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)入94℃30s，58℃30s，72℃30s，共進(jìn)行32個循環(huán)；72℃延伸10min，最后停止于4℃。對pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳鑒定，然后按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒的說明進(jìn)行切膠純化。

2、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將回收的目的片斷克隆至peast-t3載體，重組質(zhì)粒送華大基因測序，將測序結(jié)果與序列表中seqidno.4所示的序列進(jìn)行比對，正確的重組質(zhì)粒命名為peast-t3-uvrc。以該質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，用紫外分光光度計(jì)測定其濃度為850ng/μl，按照下述公式計(jì)算出每μl質(zhì)粒中的dna拷貝數(shù)為4.0×10¹⁰拷貝/μl。

質(zhì)?？截悢?shù)濃度(copies/μl)＝質(zhì)粒濃度×(6.02×10²³)/dna堿基數(shù)×2×324.5(堿基的平均分子量)

3、taqman實(shí)時熒光定量pcr的擴(kuò)增條件的建立

設(shè)立上下游引物和探針終濃度梯度為0.1-1.0mol/l，以確定反應(yīng)的最佳引物和探針濃度；設(shè)立溫度梯度為59-62℃，根據(jù)pcr擴(kuò)增結(jié)果，選取最佳退火溫度。以ct最小值、熒光最高值為標(biāo)準(zhǔn)，分別對退火溫度、引物濃度、探針濃度、循環(huán)條件進(jìn)行優(yōu)化(接下來的步驟4中的各項(xiàng)參數(shù)即為優(yōu)化結(jié)果)。

4、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將質(zhì)粒peast-t3-uvrc按10倍進(jìn)行倍比稀釋至4.0×10⁸-4.0×10⁰拷貝數(shù)/μl，以每一個標(biāo)準(zhǔn)品(每一濃度平行做3管重復(fù))和待測樣本為模板進(jìn)行taqman實(shí)時熒光定量pcr擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μl：2×probeqpcrmix10μl，質(zhì)粒peast-t3-uvrc：1μl，濃度為10μmol/l的上游引物和下游引物(分別如seqidno.1、2所示)各0.9μl，濃度為10μmol/l的probe(如seqidno.3所示)0.8μl，rnasefreeddh2o6.4μl。同時設(shè)置陰性對照，進(jìn)行擴(kuò)增，選擇533-580nm波長的vic通道吸收熒光信號，反應(yīng)程序如下：

預(yù)變性：95℃30s(升溫速率4.4℃/s)，1cycle。

pcr：分析模式：定量分析，95℃5s(升溫速率4.4℃/s)，60℃30s(升溫速率2.2℃/s，acquisitionmode:single)，45cycles。

降溫：40℃30s(升溫速率2.2℃/s)，1cycle。

如圖1、2所示，根據(jù)待測樣品中目的基因的拷貝數(shù)，便可以推導(dǎo)出所檢測養(yǎng)殖場環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的濃度(copies/m³air)。

5、靈敏性檢測

按照上述步驟4建立的taqman實(shí)時熒光定量pcr方法進(jìn)行靈敏性試驗(yàn)，如圖1所示，每個擴(kuò)增曲線模板為4.0×10⁸-4.0×10⁰拷貝數(shù)/反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，曲線10為陰性對照，最低檢測限為4.0拷貝。常規(guī)pcr(引物同定量引物)的電泳檢測結(jié)果如圖3所示，最低可以觀察到4.0×10¹拷貝數(shù)/反應(yīng)的模板量的電泳條帶，表明taqman實(shí)時熒光定量pcr比普通pcr的靈敏性高10倍。

6、特異性檢測

按照上述步驟4建立的taqman實(shí)時熒光定量pcr方法進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示，1和2號曲線分別是以4.0×10⁴拷貝數(shù)/反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品和牛支原體dna為模板的擴(kuò)增曲線，3-11分別為無乳支原體、絲狀支原體絲狀亞種sc型、絲狀支原體山羊亞種、綿羊肺炎支原體、山羊支原體山羊肺炎亞種、溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、睡眠嗜組織菌和陰性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，均沒有特異性熒光曲線。證實(shí)所設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增牛支原體特異性好，與其它菌株無交叉反應(yīng)。因此，步驟4用mb-f、mb-r和mb-probe建立的taqman實(shí)時熒光定量pcr檢測方法可用于鑒定未知樣本是否有牛支原體核酸的存在。

需要說明的是，本發(fā)明的牛支原體檢測方法之所以具有靈敏性高(檢測限達(dá)4.0拷貝/反應(yīng))、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢，是基于特殊的靶標(biāo)(uvrc基因)設(shè)計(jì)引物，并對引物進(jìn)行優(yōu)化篩選而實(shí)現(xiàn)的。目前已報(bào)道的涉及牛支原體分型診斷的保守基因序列有多個，但如何從眾多的保守基因序列中選擇靶標(biāo)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)是方案設(shè)計(jì)的難點(diǎn)所在。

本申請?jiān)趯?shí)驗(yàn)過程中以不同的保守基因作為靶標(biāo)區(qū)域，設(shè)計(jì)了多組引物，但在檢測過程中有出現(xiàn)與其他細(xì)菌之間的交叉反應(yīng)，檢測的特異性不如以uvrc基因作為靶標(biāo)設(shè)計(jì)的引物。

本申請還以uvrc基因作為靶標(biāo)設(shè)計(jì)了多組引物和不同的探針序列，通過不同的引物和探針的組合，考察檢測的靈敏度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同引物和探針的組合，其檢測的靈敏度相差較大，以seqidno.1、2和3所示的引物和探針組合的檢測靈敏度最優(yōu)，能夠適用于針對氣溶膠樣本的痕量檢測的要求；而其他的引物和探針組合的檢測靈敏度則達(dá)不到氣溶膠痕量檢測的要求。

實(shí)施例3：用于牛支原體檢測的試劑盒

試劑盒的組成：實(shí)施例1設(shè)計(jì)的引物和探針組合(seqidno.1、2和3所示)，陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、陰性對照和實(shí)時熒光定量pcr(qpcr)試劑。

所述陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒由含有如seqidno.4所示(141個堿基)的核苷酸片段構(gòu)成的peasy-t3重組質(zhì)粒組成；具體如下：

5'-gacttagttatagctgatggcggtatacaacaagttaatgaagctaaaaaaacgcttaaaacgcttaatataaacatccctgttattggattagtaaaaaatgagtttcacaaaaccaaagccttaattgacctagatatg-3'；(seqidno.4)

所述陰性對照為peasy-y3空載質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

實(shí)施例4：檢測氣溶膠樣品中牛支原體試劑盒的應(yīng)用

1、牛支原體氣溶膠樣品的制備

在奶牛場的不同環(huán)境中(奶牛舍、運(yùn)動場、擠奶廳、產(chǎn)房等)，應(yīng)用ms-ⅰ型空氣微生物采樣箱，通過國際標(biāo)準(zhǔn)的agi采樣器采集牛支原體氣溶膠樣本。采樣器放置高度為距地面1.5m，然后將30ml含0.01％(v/v)牛血清白蛋白的pbs(ph7.0)注入proton采樣器，同時滴加一滴橄欖油。將porton沖擊式穩(wěn)流器的一端接到主機(jī)入氣口上，另一端用橡膠管連接到proton采樣器的出氣口上。采樣流量為12.5l/min，采樣時間為30min。采樣結(jié)束后將采樣器內(nèi)的采集液收集到50ml離心管后低溫保存。

2、氣溶膠模板dna制備

將氣溶膠收集液12000r/min離心10min，棄上清，采用細(xì)菌基因組dna提取試劑盒制備dna模板。以30μlddh2o溶解模板，-20℃存儲備用。

3、taqman實(shí)時熒光定量pcr檢測

對采自10個奶牛養(yǎng)殖場的10份dna氣溶膠樣本進(jìn)行檢測，反應(yīng)體系與反應(yīng)條件同實(shí)施例1中的步驟4，數(shù)據(jù)的收集和擴(kuò)增曲線的生成由定量pcr儀器自帶軟件完成。結(jié)果如表2所示，同時將上述樣本進(jìn)行常規(guī)pcr檢測(引物為mb-184-f：5'-taatttagaagctttaaatgagcgc-3'，mb-184-r：5'-aataacagggatgtttatattaagc-3')，結(jié)果如表2所示。

表2不同樣本牛支原體檢測結(jié)果

上述結(jié)果說明本方法能靈敏地檢測出奶牛場不同環(huán)境氣溶膠中的牛支原體濃度。

以上所述僅為本申請的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本申請，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本申請可以有各種更改和變化。凡在本申請的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>山東師范大學(xué)

<120>一種檢測環(huán)境氣溶膠樣本中牛支原體的試劑盒及用途

<130>2017

<160>4

<170>patentinversion3.5

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

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<211>141

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<213>人工序列

<400>4

gacttagttatagctgatggcggtatacaacaagttaatgaagctaaaaaaacgcttaaa60

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