專利名稱：用于檢測真菌性病原體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測和鑒定真菌性病原體的通用引物組。在本研究中開發(fā)的病原體檢測系統(tǒng)可以用于辨別真菌性病原體，甚至在無癥狀階段期間檢測果園中存在的真菌性病原體，確定需要的殺真菌劑基礎(chǔ)噴霧量，以及在各種真菌性疾病引起嚴(yán)重產(chǎn)量損失時預(yù)測作物產(chǎn)量的估計(jì)值。此外，它可以用于檢疫部門對進(jìn)出口樣品進(jìn)行常規(guī)監(jiān)測。
背景技術(shù)：
存在幾種可用于檢測植物和動物真菌性病原體的方法。這些方法大多數(shù)使用 真菌rDNA序列的保守性以及變異性用來檢測病原體。該rDNA包括編碼的18S、5. 8S以及28S RNA ;分散有稱為ITSl以及ITS2的兩個非編碼ITS序列(White et al. 1990 ；PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications. Academic Press,Inc.，San DiegoPages 315-322)。靶向ITS區(qū)的特異性引物對已經(jīng)用于檢測特定的病原體并且這類引物與屬特異性通用引物相結(jié)合已經(jīng)用于辨別有限組的病原體。參考美國專利6080543，該專利使用在ITS區(qū)中的這種變異性用來辨別葡萄孢聚殼菌(Eutypella vitis)、葡萄藤猝倒病菌(Eutypa lata)、葡萄生擬莖點(diǎn)霉(Phomopsis viticola)以及棉色二孢菌(Diplodiagossypina)這些葡萄植物的真菌性病原體。特異性引物已經(jīng)用于辨別小麥匍匍核腔菌(Pvrenophora tritici-repentis)和圓核腔菌(Pyrenophora teres)(美國專利 6358680)以及核果鏈核盤菌(Monilinia Iaxa)和果生鏈核盤菌(Monilinia fructicola)(美國專利6221595)的存在。美國專利申請20030099975說明了用于檢測鏈格孢屬(Alternariaspp.)、嗜果枝抱霉(Cladosporium carpophilum)以及尖銳刺盤抱(Colletotrichumacutatum)的PCR檢測法，其中使用特異性引物來辨別這些病原體。通過使用特異性引物來檢測病原體還用來檢測食品中的污染。例如，WIPO專利申請W0/2000/046397說明了用于特異性檢測食品中鏈格孢(Alternaria)的技術(shù)。美國專利6858387說明了使用種屬特異性引物和通用引物的組合來檢測幾種真菌物種。在美國專利申請20080227108中，發(fā)明人通過計(jì)算出ITS區(qū)的PCR擴(kuò)增區(qū)的序列變異性辨別出樣品中存在的不同種類的曲霉菌(Aspergillus)。上述技術(shù)的缺點(diǎn)是它們依賴于用于鑒別病原體的病原體特異性引物。一些研究已經(jīng)專注于設(shè)計(jì)病原體特異性探針并且將它們用在基于雜交和微陣列的檢測中，用來檢測和辨別樣品中存在的各種真菌性病原體。在此方面，可以參考以下專利美國專利 6372430、EP0422872A2、EP0422873B1、W0/1998/055649AU W0/1996/021741AU 美國專利 5519127、美國專利 5707802、美國專利 5426027 等。Sholberg et al. 2005 (PlantDis. 89:1143-1150)開發(fā)了一種DNA宏陣列，其中在尼龍膜上固定與蘋果真菌性病原體擴(kuò)展青霉菌(Penicillium expansum)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、白叉絲單囊殼(Podosphaera leucotricha)、蘋果黑星病菌(Venturia inaequalis)以及解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)(一種細(xì)菌病原體)的ITS序列間隔區(qū)相應(yīng)的寡核苷酸。作者已經(jīng)成功地檢測這些病原體并且將它們與緊密相關(guān)的種類區(qū)分開。雖然基于雜交和微陣列的技術(shù)允許使用者一次檢測幾種病原體，然而主要的缺點(diǎn)是這些技術(shù)是技術(shù)敏感的、耗時的、昂貴的并且依賴于針對有待檢測的每種病原體特異性探針的可用性。除了這些方法，PCR-PFLP的穩(wěn)健性還用于辨別真菌性病原體的各種研究中。ITS特異性PCR緊接著RFLP分析已經(jīng)顯示將膠孢炭疽菌(Colletotrichem gloeosporioides)與辣椒炭疽菌 C. capsici (Tapia-TusselI et al. 2008 ；Mol Biotechnol. 40:293-8.)以及將納雪梨黑星病菌(Venturia nashicola)與梨黑星病菌(V. pirina) (Le Cam etal.2001 ;Phytopathology91:900-904)精確地區(qū)分開。使用ITS特異性通用引物和擔(dān)子菌(basiodiomycete)特異性引物的組合得到的PCR產(chǎn)物的RFLP分析可以區(qū)別引起云杉木白腐病和掠腐病的擔(dān)子菌(basiodiomycete) (Jasalavich et al. 2000 ；Applied andenvironmental microbiology. 4725-4734)。PCR-PFLP分析可以將葡萄藤粹倒病菌(Eutypa lata)(維管癌病原體)與葡萄藤樹干病原菌(葡萄生擬莖點(diǎn)霉(Phomopsis viticola)、球二抱屬(Botryodiplodia sp.)、暗色支丁頁抱 aleophilum (Phaeoacremonium aleophilum)以及暗色支頂抱chlamydospora (Phaeomoniella chlamydospora)以及幾種其他的葡萄病菌屬種(Eutypa sp)區(qū)別開(Rolshausen et al. 2004 ；Plant Dis. 88:925-929)。該技術(shù)還用于區(qū)別導(dǎo)致洋蔥莖腐病的葡萄孢屬種(Botrytis species) (Nielsen et al. 2002 ；PlantDis. 86:682-686)，區(qū)別引起的按樹(Eucalyptus)葉病的小球殼屬種(Mycoshaerellaspecies) (Kularatne et al. 2004 ;Mycol. Res. 108:1476-1493)，在按樹(Eucalyptus)相關(guān)的外生菌根的真菌中鑒別變異(種間和種內(nèi))(Glen et al. 2001 ；MycologicalresearcA. 105:843-858)，以及檢測六種醫(yī)學(xué)上重要的假絲酵母屬種(Mirhendi etal. 2006;. J. Med. Mycol. 47:225-229)?？梢詤⒖济绹鴮＠?780271，該專利說明了使用PCR-RFLP來區(qū)別疫霉屬種。600bp PCR擴(kuò)增子指示樣品中存在疫霉屬種，當(dāng)用HaeIII限制酶消化時，該擴(kuò)增子產(chǎn)生多態(tài)性從而將惡疫霉(P. cactorum)與致病疫霉(P. infestans)區(qū)別開。使用真菌ITS特異性通用引物連同SBFS (蘋果煤污病與蠅糞病復(fù)合病)引物一起，Duttweiler et al. 2008 (Plant Dis. 92:794-799)可以得到 PCR 擴(kuò)增子，當(dāng)用 HaeIII 限制酶消化時，該擴(kuò)增子可以將與SBSF相關(guān)的致病性真菌區(qū)別到種的水平。類似地，ITS區(qū)PCR擴(kuò)增緊接著RFLP分析可以辨別引起蘋果藍(lán)霉病的青霉菌屬種(Pianzzola et al. 2004 ；Plant Dis. 88:23-28)?？晒┦褂玫幕赑CR-RFLP的技術(shù)主要存在的缺點(diǎn)是它們主要檢測有限數(shù)量/組的病原體。專利文獻(xiàn)EP0422872A2 Nucleic acid probes and Apr, 2006Weisburg et al.methods for detecting fungiEP0422873B1 Nucleic acid probes and May, 2000Weisburg et al.methods for detecting
Cryptococcus neoformansUS 6858387 Nucleic acid probes and Feb, 2005Smith et al.methods for detectingclinically important fungal
pathogensUS 5426027 Nucle ic acid probes and June, 1995Lott et al.methods for detecting CandidaDNA cells in bloodUS 5519127 Nucleic acid probes for the May, 1996Shah et al.detection of PneumocystisCarniiUS 5707802 Nucleic acid probes for the detec Jan, 1998Sandhu et al.and identification of fungiUS 5780271 PCR assays for Phytophthora Julj 1998RistainospeciesUS 6080543 Detection of fungal pathogens Junj2000Engel et al.US 6221595 Detection of Moniliniaspp.Apr, 2001Beck et al.Using polymerase chain reactionUS 6358680 Detection of wheat and barley Mar, 2002Beck et al.fungal pathogens using thePCRUS 6372430 Nucleic acids for detecting Apr, 2002Morrison et al.Aspergillus species and otherfilamentous fungiUS application Detection of fungal pathogens May, 2003Barnett et al.20030099975 using the polymerase chainreactionUS application Molecular identification of20080227108 Aspergillus speciesW0/1996/021741AlNucleic acid probes for the Julj 1996Sandhu et al.detection and identification offungiW0/1998/055649AlNucleic acid probes for the Dec,1998Sandhu et al.detection and identification offungiW0/2000/046397 Nucleic acid based assay and Aug，2000Kashi et al.kit for the detection ofalternaria contamination infood products

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是設(shè)計(jì)并且提供通用引物組，該引物組擴(kuò)增用于檢測真菌性病原體的真菌rDNA序列的ITS區(qū)。本發(fā)明的另一個目的是提供用于檢測以及鑒別真菌性病原體的方法，包括從一個或多個真菌菌絲體和/或一個或多個感染的組織中分離DNA，使用設(shè)計(jì)的通用引物對PCR擴(kuò)增它們的ITS2區(qū),適當(dāng)?shù)南拗泼赶?通過凝膠電泳分辨(解析，resolution)多態(tài)性條帶以及通過PathDec工具分析得到的RFLP條帶，該工具將得到的RFLP條帶圖案與通過計(jì)算機(jī)(insilico)分析得到的預(yù)先存儲的病原體特異性條帶圖案進(jìn)行比較用來檢測和區(qū)別各種真菌性病原體。相對于現(xiàn)有技術(shù)本發(fā)明的一個或多個新穎性和創(chuàng)造性步驟已經(jīng)設(shè)計(jì)出許多基于PCR的方法用來檢測植物和動物的多種真菌性病原體。這些技術(shù)大多數(shù)已經(jīng)被開發(fā)用來一次性檢測一種特定的病原菌或有限數(shù)量的病原體。靶向病原體ITS區(qū)的特異性引物對已經(jīng)用于檢測特定的病原體并且這類引物與屬特異性通用引物結(jié)合已經(jīng)用于區(qū)別少量的病原體。我們創(chuàng)新地設(shè)計(jì)了 ITRRFl以及ITRRFl通用引物，使用 這些引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用HinFI酶限制性消化PCR產(chǎn)物，將凝膠顯影，以及通過基于PERL的工具PathDec，來分析這些限制性片段，使得在小于6小時時間內(nèi)甚至在可見地出現(xiàn)病癥之前可以鑒別和檢測大多數(shù)真菌性病原體。甚至在不使用專用的圖像處理工具/儀器的情況下，PathDec幫助使用者分析復(fù)雜的RFLP條帶圖案以便鑒別和區(qū)分樣品中存在的真菌性病原體。


圖I表示使用ITRRFl以及ITRRRl通用型真菌引物的PCR擴(kuò)增。泳道I :鏈格孢(Alternaria alternata);泳道 2 :蘋果黑星病菌(Venturia inaequalis);泳道 3 :圍小叢殼菌(Glomerella cingulata);泳道4 :尖銳刺盤抱(Colletotrichum acutatum);泳道 5 灰葡萄孢(Botrytis cinerea);泳道 6 :內(nèi)寄生真菌(Endophytic fungus);泳道 7 IOObp梯。圖2表示使用HinFI限制酶的PCR-RFLP分析。泳道I :20bp梯；泳道2 :鏈格孢(Alternaria alternata);泳道 3 :蘋果黑星病菌(Venturiainaequalis);泳道 4 :圍小叢殼菌(Glomerrella cingulata);泳道 5 :尖銳刺盤抱(Colletotrichum acutatum);泳道 6 :灰葡萄抱(Botrytis cinerea)。圖3表示用來區(qū)別三種不同蘋果真菌性病原體混合物的PCR-RFLP分析。泳道I :20bp梯；泳道2 :鏈格抱(Alternaria alternata),蘋果黑星病菌(Venturia inaequalis),小叢殼屬葉斑病原體(Glomerella leaf spot pathogen)的混合物。圖4表示用來區(qū)別四種不同蘋果真菌性病原體混合物的PCR-RFLP分析。泳道I :20bp梯；泳道2 :鏈格抱(Alternaria alternata),蘋果黑星病菌(Venturia inaequalis),小叢殼屬葉斑病原體(Glomerella leaf spot pathogen)以及灰葡萄孢(Botrytiscinerea)的混合物。圖5表示在無癥狀階段鏈格孢(Alternaria alternata)感染的葉片的PCR-RFLP分析。泳道I : IOObp梯；泳道2 :模擬感染的蘋果葉片；泳道3 :鏈格孢(Alternariaalternata)感染的蘋果葉片。圖6PathDec VI. 0 的流程圖
表I表示使用HinFI酶的蘋果真菌性病原體的ITRRFl和ITRRRl引物可擴(kuò)增的rDNA序列的計(jì)算機(jī)(Insilico)限制性酶切分析。表2表示用于證實(shí)本研究中開發(fā)的方法有效性的真菌性病原體。發(fā)明綜沭因此，本發(fā)明提供了用于檢測和鑒別真菌性病原體的通用引物組以及方法。所述方法包括從真菌菌絲體或有癥狀的/無癥狀的組織中分離DNA，通過通用型真菌特異性ITRRFl以及ITRRRl引物PCR擴(kuò)增真菌rDNA，通過適當(dāng)?shù)拿赶拗菩韵疨CR產(chǎn)物，通過凝膠電泳分辨(解析)得到的條帶，將凝膠顯影并且通過PathDec工具(但不限于它)來解釋結(jié)果，用來顯示樣品中存在/缺少病原體以及提供它們的百分比概率。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，提供了用于檢測真菌性病原體具有SeqID No. I和SeqID No. 2的通用引物組?！?br> 在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，引物組具有如下特征i.所述正向引物長度為21鏈節(jié)，而反向引物為23鏈節(jié)，ii.G+C含量在43-48%的范圍內(nèi)，iii.Tm 在 53。C 的范圍內(nèi)，iv 退火溫度優(yōu)選在50-60° C的范圍內(nèi)，最佳為54° C。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，提供了引物組，其中通過在引物對的5 ’或3 ’方向上在正向引物和反向引物兩者中添加或缺失5個核苷酸來改變它們的長度。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，提供了用于鑒別不可培養(yǎng)型真菌的引物組。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，提供了用于鑒別真菌性病原體的方法，包括以下步驟a.設(shè)計(jì)具有SeqID No. I和SeqID No. 2的通用引物，b.通過使用在步驟a中得到的引物來PCR擴(kuò)增真菌rDNA，c.使用選自包括 Rsal、EcoRI、HindIII、HaeII、HaeIII、HinFI、PhoI、MspI、TaqI等的組的限制酶來限制性消化在步驟b中得到的PCR產(chǎn)物從而產(chǎn)生限制性片段長度多態(tài)性，d.通過凝膠電泳分辨在步驟c中得到的條帶，e.將在步驟d中得到的PCR-RFLP條帶信息輸入到PathDec工具中，f.將在步驟e中得到的輸入的條帶信息與使用算法針對每個病原體計(jì)算機(jī)(insilico)得到的條帶圖案進(jìn)行比較，其中所述數(shù)據(jù)庫存儲針對真菌性病原體的標(biāo)準(zhǔn)條帶圖案。g.鑒別樣品中存在的真菌性病原體。在本發(fā)明的又另一個實(shí)施方式中，提供了用于鑒別蘋果真菌性病原體的方法。在本發(fā)明的又另一個實(shí)施方式中，提供了用于檢測真菌性病原體的試劑盒，其中所述試劑盒包括a.具有 Seq. ID I 和 Seq. ID 2 的引物組，b.適合用于PCR的試劑，c.適當(dāng)?shù)南拗菩悦?，d. PathDec 工具，
e.指導(dǎo)手冊(操作手冊)。
具體實(shí)施例方式已經(jīng)設(shè)計(jì)了多種基于PCR的方法用來檢測植物和動物的各種真菌性病原體。這些方法大多數(shù)已經(jīng)被開發(fā)用于檢測一種特定的病原菌或有限數(shù)量的病原體。我們創(chuàng)新性地設(shè)計(jì)通用引物用于PCR擴(kuò)增真菌rDNA序列的高度多態(tài)性區(qū)域，用HinFI酶限制性消化PCR產(chǎn)物并且通過PathDec工具分析這些限制性片段，該工具將得到的RFLP條帶圖案與通過計(jì)算機(jī)(insilico)分析得到的預(yù)先存儲的病原體特異性條帶圖案進(jìn)行比較使得甚至在可見地出現(xiàn)病癥之前在小于6小時內(nèi)可以鑒別和檢測幾乎所有蘋果真菌性病原體。由于本研究中設(shè)計(jì)的引物在本質(zhì)上是通用的，因此，可以預(yù)期的是該方法將能夠檢查和區(qū)別其他植物/動物種類的真菌性病原體。然而，必須鑒別出可能產(chǎn)生多態(tài)性的適當(dāng)?shù)南拗泼覆⑶倚枰夅槍ζ渌参?動物病原體的PathDec數(shù)據(jù)庫。本發(fā)明中涉及的多個處理步驟如下DNA分離通過下面常用的CTAB方法(DoyleJJ, Doyle JL(1987)A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull 19:11-15)或使用任何商品化的DNA分離試劑盒來分離來自蘋果組織和真菌菌絲體的DNA。設(shè)計(jì)通用PCR引物所有可供使用的蘋果真菌性病原體的rDNA 序列都是從 NCBI(http ://www. ncbi. nlm. nih. gov)下載的。使用 CLUSTALW2(http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/index, html)進(jìn)行多序列比對用來尋找這些序列中的保守區(qū)。5. 8S rDNA區(qū)中的一個保守序列段(conserved stretch)用于設(shè)計(jì)正向引物(ITRRFI ；5' CGATGAAGAACGCAGCGAAAT)同時以這樣一種方式由第二保守序列段來設(shè)計(jì)反向引物(ITRRRl:TATGCTTAAGTTCAGCGGGTATC),即這些引物結(jié)合位點(diǎn)位于真菌rDNA序列ITS2區(qū)的側(cè)翼。計(jì)算機(jī)(insilico)限制性消化分析用來鑒別蘋果真菌性病原體間的多態(tài)性在下載的蘋果真菌性病原體rDNA序列中區(qū)別rDNA序列的PCR可擴(kuò)增區(qū)。使用在線工具(NEB cutterV2. O (http://tools. neb. com/NEBcutter2))對這些區(qū)域的序列進(jìn)行計(jì)算機(jī)(insilico)限制性消化分析。使用幾種常用的限制性酶(Rsal、EcoRI、HindIII, HaeII, HinFI, PhoI,MspI, TaqI)(表I)對這些序列的每一個進(jìn)行常規(guī)消化。此外，HinFI消化可以顯示19種蘋果真菌性病原體中13種的條帶圖案的多態(tài)性(它們的序列可在NCBI中得到(表I))。然而，由于rDNA序列的高度保守特性,鏈格孢(Alternaria alternata),貝倫格葡萄座腔菌(Botryosphaeria berengeriana)和蘋果盤二抱菌(Marssonina mali )(具有類似的 RFLP圖案150、116、53、8)以及還有富克葡萄孢盤菌(Bottyotinia f iickeliana),果產(chǎn)鏈核盤菌(Monilinia fructicola)和核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)(具有類似的 RFLP 圖案165、89、53、8)不能通過本發(fā)明中開發(fā)的方法區(qū)分開。為了證實(shí)株特異性變異未改變特定病原體的RFLP圖案，從NCBI下載相應(yīng)于這些病原體每一種的不同菌株的至少4-5種rDNA序列，區(qū)分出PCR可擴(kuò)增區(qū)并且進(jìn)行計(jì)算機(jī)(insilico)限制性消化分析。分析顯示在所有特定病原體菌株中條帶圖案是相同的并且未檢測出株特異性變異。通過設(shè)計(jì)的通用引物PCR擴(kuò)增使用ITRRFl以及ITRRRl引物對由按照上述方法分離的從MTCC，Chandigarh (印度)得到的來自四種不同蘋果真菌性病原體培養(yǎng)物的DNA (表2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過混合5 μ I IOXPCR緩沖液，5 μ I IOXMgCl2,4μ I dNTP 混合物，O. 4μ I Taq 酶(5U/μ I)以及 ITRRFl 和 ITRRRl 引物各 I μ I (3pm)，通過添加高壓滅菌去離子水來調(diào)節(jié)最終體積，來建立50 μ I PCR反應(yīng)。在95°C下初始變性5分鐘之后，樣品進(jìn)行94°C I分鐘，54°C 30秒以及72°C 30秒的35個熱循環(huán)。最后的延伸在72°C下進(jìn)行持續(xù)10分鐘。圖I說明了在所有這些實(shí)例中都產(chǎn)生了約320bp的PCR擴(kuò)增子。PCR產(chǎn)物的RFLP分析通過按照制造商的說明書用Iyg快速消化HinFI (FermentasInternational Inc, Ontario, Canada)在37。C下消化15分鐘對從上述不同蘋果真菌性病原體得到的I μ g PCR產(chǎn)物進(jìn)行RFLP分析。在3%瓊脂糖凝膠上通過在60V下運(yùn)行90分鐘通過凝膠電泳來分辨消化的條帶，并且通過Gel Documentation系統(tǒng)來成像(圖2)。發(fā)現(xiàn)條帶圖案與通過計(jì)算機(jī)(insilico)限制性分析得到的圖案相類似。此外，我們對本發(fā)明是否能夠區(qū)別以混合物形式一起提供的多種病原體進(jìn)行了評估。為了對此進(jìn)行分析，制造了相同比例的三和四種不同病原體的基因組DNA混合物并且進(jìn)行上述的PCR-RFLP分析。如圖3和圖4中所示，PCR-RFLP可以區(qū)別所有這些病原體。此外為了檢查甚至在出現(xiàn)可見癥狀之前本發(fā)明檢測病原體的效率，按照本發(fā)明中提供的方法對用10 μ I鏈格孢(Alternariaalternata)分生孢子感染的蘋果葉片進(jìn)行監(jiān)測。如圖5中所示，本發(fā)明方法可以在無可見癥狀的樣品中檢測出病原體的存在。通過PathDec工具來解釋RFLP條帶圖案可以通過使用基于PERL的工具，PathDec來解釋RFLP圖案用來檢測和區(qū)別樣品中存在的多種病原體。 一旦將得到的PCR-RFLP條帶尺寸(如圖4中所示)作為輸入提供給PathDec工具，該工具可以成功地區(qū)別蘋果真菌性病原體的混合物。用于區(qū)別病原體的RFLP條帶分析是勞動量大的，尤其是當(dāng)樣品中存在大量病原體時。在本發(fā)明中已經(jīng)開發(fā)出基于PERL的軟件PathDec用來解釋PCR-RFLP條帶圖案并且用來幫助使用者鑒別樣品中存在的真菌性病原體。本研究中開發(fā)的整個檢測系統(tǒng)已經(jīng)成功地驗(yàn)證能夠區(qū)別單個形式或混合物形式的幾種蘋果病原體。流程圖輸入PCR-RFLP條帶信息I算法將輸入的條帶信息與針對每種病原體計(jì)算機(jī)(insilico)得到的條帶圖案進(jìn)行比較。I提供病原體名稱連同它們在樣品中存在的百分比概率一起。通過舉例說明方式給出下面實(shí)施例，并且因此不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例-I培養(yǎng)本研究中使用的真菌性病原體下面是用于培養(yǎng)蘋果真菌性病原體的生長條件。鏈格抱(Alternariaalternata)生長培養(yǎng)基-PDA (馬鈴薯葡萄糖瓊脂；Himedia);生長條件-需氧溫度28°C ;培養(yǎng)時間5天圍小叢殼菌(Glomerellacingulata)生長培養(yǎng)基-PDA (馬鈴薯葡萄糖瓊脂；Himedia);生長條件-需氧溫度25°C ;培養(yǎng)時間5天尖銳刺盤抱(Colletotrichumacutatum)
生長培養(yǎng)基-PDA (馬鈴薯葡萄糖瓊脂；Himedia);生長條件-需氧溫度25°C ;培養(yǎng)時間5天灰葡萄抱(Botrytiscinerea)生長培養(yǎng)基-PDA (馬鈴薯葡萄糖瓊脂；Himedia);生長條件-需氧溫度25°C ;培養(yǎng)時間5天蘋果黑星病菌(Venturiainaequalis)生長培養(yǎng)基-M-98 (麥芽汁10gm/L ;蛋白胨3gm/L以及瓊脂15gm/L ;Himedia);生 長條件-需氧；溫度20°C ;培養(yǎng)時間14天實(shí)施例-2設(shè)計(jì)通用的真菌特異性引物從NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)下載各種蘋果真菌性病原體的rDNA序列。為了取得這些序列中的保守區(qū)，使用CLUSTALW2(http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/index, html)進(jìn)行多序列比對。由真菌 rDNA 序列的ITS2區(qū)側(cè)翼的保守區(qū)來設(shè)計(jì)正向引物(ITRRF1 :5’CGATGAAGAACGCAGCGAAAT)以及反向引物(ITRRRI TATGCTTAAGTTCAGCGGGTATC)兩者。實(shí)施例-3分析所設(shè)計(jì)引物的通用性為了發(fā)現(xiàn)本研究中設(shè)計(jì)的引物是否能夠擴(kuò)增其他真菌的rDNA序列，我們下載了多種隨機(jī)選擇的真菌的rDNA序列[漢遜德巴利酵母菌(Debaryomyces hansenii )株W4682(GQ913348);內(nèi)生真菌(Fungal endophyte)分離物 5724(DQ979775);枝狀枝抱菌(Cladosporium cladosporioides)株 STE-U (AY251074);枝狀枝抱菌(Cladosporium cladosporioides)分離物 GG6 (EF 104249)；Athelia bombacina 分離物 AFT0L-ID347 (DQ449026);球毛殼菌(Chaetomium globosum)分離物 B221 (GQ365152)；小球殼抱菌(Microsphaeropsis sp. ) HLS303 (FJ770074 ；小球殼抱菌 arundinis(Microsphaeropsis arundinis)株 PMBMDF049 (FJ798603);座囊菌(Dothideomycetessp. ) 11313 (GQ153229);黃曲霉菌(Aspergillus fIavus)株 ATCCl 1497 (⑶256760)；土曲霉菌(Aspergillus terreus)株 ATCC20542 (GU256759);黑曲霉菌(Aspergillusniger)株 ATCC64973 (⑶256750);雜色曲霉菌(Aspergillus versicolor)株 ATCC26644(⑶256744)；漢遜德巴利酵母菌(Debaryomyces hansenii )株 W4682 (GQ913348)；粗糙鏈孢霉菌(Neurospora crassa)株 ATCC MYA_4619 (GU327635);鏈抱霉菌 discreta(Neurosporadiscreta)株 ATCC MYA-4616 (GU327632);四抱鏈抱菌(Neurospora tetrasperma)株 ATCCMYA-4615 (⑶327631);好食鏈孢霉菌(Neurospora sitophila)(⑶ 192459);粗糙鏈孢霉菌(Neurospora crassa)株 ATCC MYA-4614 (GU327630);青霉菌(Penicillium sp. )GG_2009a(GQ418173);稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)株 ATCC MYA-4617 (⑶327633);葡萄座腔菌obtusa (Botryosphaeria obtusa)株 SDAU07159 (FJ171717);擴(kuò)展青霉菌(Penicilliumexpansum)株NRRL 6069(DQ339562);草本支抱霉菌(Cladosporium herbarum)分離物wb317(AF455479);仁果裂盾菌(Schizothyrium pomi )(FJ425206);球腔菌 pyri (Mycosphaerellapyri)株 CBS 100.86 (EU167606);梨黑星病菌(Venturia pirina)株 ICMP (AF333439)；白叉絲單囊殼菌(Podosphaera leucotricha)voucher BPI878262 (EU148597)],并且尋找正向和反向引物結(jié)合位點(diǎn)的存在。引物結(jié)合位點(diǎn)存在于所有這些序列中表明這些引物的真菌特異性通用性。
實(shí)施例-4用于辨別各種真菌性病原體的計(jì)算機(jī)(Insilico)方法從NCBI (http://www.ncbi. nlm. nih. gov)下載所有可供使用的蘋果真菌性病原體的rDNA序列。使用在線工具進(jìn)行計(jì)算機(jī)(Insilico)限制性消化分析；使用 NEB cutter V2. O (http://tools. neb. corn/NEBcutter2)來研究蘋果真菌性病原體間的多態(tài)性。在下載的蘋果真菌性病原體的rDNA序列中區(qū)別rDNA序列的PCR可擴(kuò)增區(qū)并且使用幾種常用限制性酶(RsaI、EcoRI、Hindi 11、HaeII、HinFI、PhoI、MspI、TaqI)進(jìn)行常規(guī)消化分析。分析顯示在不同的蘋果病原體的PCR擴(kuò)增子中HinFI消化可以提供長度多態(tài)性(表I)。表I表示使用HinFI酶消化的蘋果真菌性病原體的可擴(kuò)增的rDNA序列的ITRRFl和ITRRRl引物的計(jì)算機(jī)(Insilico)限制性分析。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測真菌性病原體的通用引物組，具有SeqID No. I以及 SeqID No. 2。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的引物組，其中所述引物具有以下特征 i.所述正向引物的長度為21鏈節(jié)，并且反向引物為23鏈節(jié)， ii.G+C含量在43-48%的范圍內(nèi)， iii.Tm在53°C的范圍內(nèi)， iv.退火溫度優(yōu)選在50-60°C的范圍內(nèi)，最佳為54° C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的引物組，其中通過在所述引物對的5’或3’方向上在正向引物和反向引物兩者中添加或缺失5個核苷酸來改變所述引物的長度。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的引物用于鑒別不可培養(yǎng)型真菌的應(yīng)用。
5.一種用于鑒別真菌性病原體的方法，包括以下步驟 a.設(shè)計(jì)具有SeqIDNo. I以及SeqID No. 2的通用引物， b.通過使用在步驟a中得到的引物來PCR擴(kuò)增真菌rDNA， c.使用選自包括Rsal、EcoRI、HindIII, Hae IK HaeIII, HinFI, PhoI, MspI, TaqI 等的組中的限制性酶來限制性消化在步驟b中得到的PCR產(chǎn)物從而產(chǎn)生限制性片段長度多態(tài)性， d.通過凝膠電泳來分辨在步驟c中得到的條帶， e.將在步驟d中得到的PCR-RFLP條帶信息輸入到PathDec工具中， f.提供具有針對真菌性病原體存儲的標(biāo)準(zhǔn)條帶圖案的數(shù)據(jù)庫， g.將在步驟e中得到的輸入條帶信息與在步驟f 中得到的計(jì)算機(jī)得到的條帶圖案進(jìn)行比較， h.鑒別樣品中存在的真菌性病原體。
6.一種用于鑒別根據(jù)權(quán)利要求5所述的真菌性病原體的方法，其中所述病原體為蘋果真菌性病原體。
7.一種用于檢測真菌性病原體的試劑盒，其中所述試劑盒包括 a.具有Seq.IDl以及2的引物組， b.適合用于PCR的試劑， c.適當(dāng)?shù)南拗菩悦?，d.PathDec 工具， e.指導(dǎo)手冊。
全文摘要
無癥狀階段期間病原體的早期檢測可以用于基于采用可用于防止形成疾病以及相關(guān)產(chǎn)量損失的方法的及時需要。此外，它可以用于預(yù)測作物生產(chǎn)量以及由檢疫部門來監(jiān)測待進(jìn)行國際貿(mào)易的樣品中病原體的存在。我們創(chuàng)新地設(shè)計(jì)了用于PCR擴(kuò)增真菌rDNA序列的通用引物，用HinFI酶限制性消化PCR產(chǎn)物并且通過PathDec工具分析限制性片段，使得在小于6小時內(nèi)甚至在可見地出現(xiàn)病癥之前就可以鑒定和檢測幾乎所有蘋果的真菌性病原體。
文檔編號C12Q1/68GK102971436SQ201180018261
公開日2013年3月13日 申請日期2011年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月15日
發(fā)明者卡尼卡·塔庫爾, 戈帕爾吉·杰哈 申請人:科學(xué)與工業(yè)研究委員會