專利名稱：通過抑制成纖維細(xì)胞生長因子21(fgf21)的天然反義轉(zhuǎn)錄物而治療fgf21相關(guān)疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)要求2010年4月9日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 61/322352的優(yōu)先權(quán)，其通過引用整體并入本文。本發(fā)明的實(shí)施方案包括調(diào)節(jié)FGF21和相關(guān)分子的表達(dá)和/或功能的寡核苷酸。背景DNA-RNA和RNA-RNA雜交對(duì)于核酸功能的許多方面是重要的，包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。雜交對(duì)于檢測特定核酸或改變其表達(dá)的多種技術(shù)也是關(guān)鍵的。反義核苷酸，例如通過與靶RNA雜交從而干擾RNA剪接、轉(zhuǎn)錄、翻譯和復(fù)制來破壞基因表達(dá)。反義DNA具有額外的特性，即DNA-RNA雜交物作被核糖核酸酶H消化的底物，這是在大多數(shù)細(xì)胞類型中存在 的活性。反義分子可被遞送到細(xì)胞中，如寡脫氧核苷酸(ODN)的情形，或反義分子可從內(nèi)源基因表達(dá)為RNA分子。FDA最近批準(zhǔn)了一種反義藥物VITRAVENE (用于治療巨細(xì)胞病毒視網(wǎng)膜炎)，反映了反義藥物具有治療效用。概述提供本概述以展示本發(fā)明的概述，以簡要地指出本發(fā)明的性質(zhì)和實(shí)質(zhì)。提交本概述應(yīng)理解的是，其不會(huì)用來解釋或限制權(quán)利要求書的范圍或含義。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過利用靶向天然反義轉(zhuǎn)錄物任何區(qū)域的反義寡核苷酸而導(dǎo)致相應(yīng)有義基因的上調(diào)來抑制天然反義轉(zhuǎn)錄物作用的方法。本文還預(yù)期，天然反義轉(zhuǎn)錄物的抑制可由siRNA、核酶和小分子實(shí)現(xiàn)，認(rèn)為這些在本發(fā)明的范圍中。一個(gè)實(shí)施方案提供體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中FGF21多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，包括將所述細(xì)胞或組織與長度為5至30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與包括SEQID NO:2的核苷酸I至4246中的5至30個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸的反向互補(bǔ)序列具有至少50%序列同一性，從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中FGF21多核苷酸的功能和/或表達(dá)。在實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向FGF21多核苷酸的天然反義序列，例如，SEQ ID NO: 2所列的核苷酸及其任何變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段及其互補(bǔ)序列。反義寡核苷酸的實(shí)例如SEQ ID N0:3至9所列。另一實(shí)施方案提供體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中FGF21多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，包括將所述細(xì)胞或組織與長度為5至30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與FGF21多核苷酸的反義的反向互補(bǔ)序列具有至少50%序列同一'丨生;從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中FGF21多核苷酸的功能和/或表達(dá)。另一實(shí)施方案提供體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中FGF21多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，包括將所述細(xì)胞或組織與長度為5至30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與FGF21反義多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%序列同一性；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中FGF21多核苷酸的功能和/或表達(dá)。在實(shí)施方案中，組合物包括一種或多種結(jié)合有義和/或反義FGF21多核苷酸的反義寡核苷酸。在實(shí)施方案中，寡核苷酸包括一種或多種修飾或取代的核苷酸。在實(shí)施方案中，寡核苷酸包括一種或多種修飾的鍵。在又一實(shí)施方案中，修飾的核苷酸包括包含硫代磷酸酯、膦酸甲酯、肽核酸、2’ -O-甲基、氟代-或碳、亞甲基或其它鎖核酸(LNA)分子的修飾的堿基。優(yōu)選地，修飾的核苷酸是鎖核酸分子，包括a-L-LNA。在實(shí)施方案中，將寡核苷酸皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用給患者。在實(shí)施方案中，寡核苷酸以藥物組合物施用。治療方案包括向患者施用反義化合物至少一次；然而，可修改該治療以包括經(jīng)一段時(shí)間的多個(gè)劑量。該治療可與一種或多種其它類型的治療聯(lián)合。 在實(shí)施方案中，將寡核苷酸封裝在脂質(zhì)體中或連接于載體分子(例如，膽固醇、TAT 肽)。其它方面在以下描述。附圖
簡述圖I是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖，顯示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理MCF-7細(xì)胞后與對(duì)照相比FGF21mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。標(biāo)為⑶R-1469至⑶R-1475的條柱分別對(duì)應(yīng)用SEQ ID N0:3至9處理的樣品。圖2是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖，顯示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理IfepG2細(xì)胞后與對(duì)照相比FGF2ImRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。標(biāo)為⑶R-1469至⑶R-1475的條柱分別對(duì)應(yīng)用SEQ IDN0:3至9處理的樣品。序列表描述-SEQ ID NO: I :智人成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)、mRNA(NCBI登記號(hào)NM 019113) ；SEQ ID NO:2 :天然 FGF21 反義序列(Hs. 69747) ；SEQ ID N0:3 至 9:反義寡核苷酸。*指示硫代磷酸酯鍵。詳述下面參考用于示例的實(shí)例應(yīng)用來描述本發(fā)明的多個(gè)方面。應(yīng)理解的是，列出許多具體細(xì)節(jié)、關(guān)聯(lián)和方法以提供對(duì)本發(fā)明的完全理解。然而，相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易認(rèn)識(shí)到，可沒有一種或多種具體細(xì)節(jié)地實(shí)踐本發(fā)明或以其它方法實(shí)踐本發(fā)明。本發(fā)明不限于行為或事件的順序，因?yàn)橐恍┬袨榭梢圆煌樞蜻M(jìn)行和/或與其它行為或事件同時(shí)進(jìn)行。而且，并非所有列舉的行為或事件都是實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法所需的。本文公開的所有基因、基因名稱和基因產(chǎn)物預(yù)期對(duì)應(yīng)來自本文公開的組合物和方法可適用的任何物種的同系物。因此，這些術(shù)語包括但不限于來自人和小鼠的基因和基因產(chǎn)物。應(yīng)理解的是，當(dāng)公開來自具體物種的基因或基因產(chǎn)物時(shí)，這一公開僅旨在示例，不應(yīng)解釋為限制，除非在其存在的上下文清楚地指明。因此，例如，對(duì)于本文公開的基因，其在一些實(shí)施方案中涉及哺乳動(dòng)物核酸和氨基酸序列，預(yù)期涵蓋來自其它動(dòng)物的同源和/或直系同源基因和基因產(chǎn)物，所述其它動(dòng)物包括但不限于其它哺乳動(dòng)物、魚、兩棲類、爬行動(dòng)物和鳥類。在實(shí)施方案中，基因或核酸序列是人的。定義本文所用的術(shù)語僅是為了描述具體實(shí)施方案的目的，并不旨在限制本發(fā)明。除非上下文另外清楚地指明，否則本文所用的單數(shù)形式〃一個(gè)/ 一種(a)〃、〃一個(gè)/ 一種(an)〃和〃該(the)"預(yù)期包括復(fù)數(shù)形式。而且，就詳述和/或權(quán)利要求書中使用術(shù)語〃包括(including) 〃、〃 包括(includes) 〃、〃 具有(having) 〃、〃 具有(has)"、〃帶有(with) 〃或其變化形式來說，這些術(shù)語預(yù)期以類似于術(shù)語〃包含(comprising) 〃的方式被包括。術(shù)語〃約〃或〃大約〃是指在由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定的特定數(shù)值的可接受誤差范圍內(nèi)，其將部分地取決于如何測量或確定該數(shù)值，即，測量系統(tǒng)的限度。例如，按照本領(lǐng)域中的實(shí)踐，〃約〃可表示在I個(gè)或多于I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)?？蛇x地，〃約〃可表示給定數(shù)值的達(dá)20%、優(yōu)選地達(dá)10%、更優(yōu)選地達(dá)5%、仍更優(yōu)選地達(dá)1%的范圍?？蛇x地，尤其是有關(guān)生物系統(tǒng)或方法，術(shù)語可表示在數(shù)值的數(shù)量級(jí)內(nèi)，優(yōu)選地在5倍內(nèi)，更優(yōu)選地在2倍內(nèi)。當(dāng)在本申請(qǐng)和權(quán)利要求書中描述特定數(shù)值時(shí)，除非另外指明，否則應(yīng)假設(shè)術(shù)語"約"表示在特定數(shù)值可接受的誤差范圍內(nèi)。本文所用的術(shù)語〃mRNA〃是指靶基因的目前已知的mRNA轉(zhuǎn)錄物和可能說明的任何 進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄物?！ǚ戳x寡核苷酸〃或〃反義化合物〃是指結(jié)合另一 RNA或DNA (靶RNA、DNA)的RNA或DNA分子。例如，如果其是RNA寡核苷酸，其借助于RNA-RNA相互作用結(jié)合另一 RNA靶并且改變靶RNA的活性。反義寡核苷酸可上調(diào)或下調(diào)特定多核苷酸的表達(dá)和/或功能。該定義意為包括從治療、診斷或其它觀點(diǎn)來說有用的任何外來RNA或DNA分子。這種分子包括，例如，反義RNA或DNA分子、干擾RNA(RNAi)、微RNA、誘餌RNA分子、siRNA、酶促RNA、治療性編輯RNA和激動(dòng)劑與拮抗劑RNA、反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、可選剪接體、引物、探針以及與靶核酸的至少一部分雜交的其它寡聚化合物。因此，這些化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明的范疇中，術(shù)語"寡核苷酸"是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其模擬物的寡聚物或聚合物。術(shù)語"寡核苷酸"還包括天然和/或修飾的單體或鍵合的線性或環(huán)狀寡聚物，包括脫氧核糖核苷、核糖核苷、其取代形式和其α -異頭形式、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、硫代磷酸酯、膦酸甲酯和類似物。寡核苷酸能夠經(jīng)由規(guī)則方式的單體與單體間的相互作用，例如Watson-Crick型堿基配對(duì)、Hodgsteen或逆H_gsteen型堿基配對(duì)或類似物特異性結(jié)合靶多核苷酸。寡核苷酸可以是〃嵌合的"，即，包括不同區(qū)域。在本發(fā)明的范疇中，"嵌合〃化合物是寡核苷酸，其包含兩個(gè)或更多個(gè)化學(xué)區(qū)域，例如，DNA區(qū)域、RNA區(qū)域、PNA區(qū)域等等。每個(gè)化學(xué)區(qū)域由至少一個(gè)單體單位構(gòu)成，在寡核苷酸化合物的情形中所述單體單位即為核苷酸。這些寡核苷酸通常包括至少一個(gè)區(qū)域，其中寡核苷酸經(jīng)修飾以表現(xiàn)一種或多種期望特性。寡核苷酸的期望特性包括但不限于，例如，對(duì)核酸酶降解增加的耐受性、增加的細(xì)胞攝取和/或?qū)Π泻怂嵩黾拥慕Y(jié)合親和力。因此，寡核苷酸的不同區(qū)域可具有不同特性。如上所述，本發(fā)明的嵌合寡核苷酸可形成為兩種或更多種寡核苷酸的混合結(jié)構(gòu)、修飾的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸類似物。寡核苷酸可由可被〃成行〃地連接(即當(dāng)單體被連續(xù)地連接時(shí)，如在天然DNA中)的區(qū)域或經(jīng)由間隔物連接的區(qū)域構(gòu)成。預(yù)期間隔物構(gòu)成區(qū)域之間的共價(jià)"橋"，在優(yōu)選情形中具有不超過約100個(gè)碳原子的長度。間隔物可攜帶不同功能性，例如，具有正電荷或負(fù)電荷，攜帶特殊的核酸結(jié)合特性(嵌入劑、槽溝結(jié)合物、毒素、熒光團(tuán)等等)，為親脂性的，誘導(dǎo)特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如例如，誘導(dǎo)α -螺旋的含丙氨酸的肽。
本文所用的"FGF21"和〃成纖維細(xì)胞生長因子21〃包括所有家族成員、突變體、等位基因、片段、種類(species)、編碼和非編碼序列、有義和反義多核苷酸鏈等等。本文所用的詞語’成纖維細(xì)胞生長因子21’、FGF21、FGF-21、UNQ3115和PR010196被認(rèn)為在文獻(xiàn)中是相同的，且在本申請(qǐng)中可交換地使用。本文所用的術(shù)語〃對(duì)…有特異性的寡核苷酸〃或〃靶向…的寡核苷酸〃是指具有
(i)能夠與靶基因的一部分形成穩(wěn)定 復(fù)合體，或(ii)能夠與靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的一部分形成穩(wěn)定雙鏈體的序列的寡核苷酸。復(fù)合體和雙鏈體的穩(wěn)定性可通過理論計(jì)算和/或體外測定來確定。用于確定雜交復(fù)合體和雙鏈體的穩(wěn)定性的示例性測定在以下實(shí)施例中描述。本文所用的術(shù)語〃靶核酸〃涵蓋DNA、從這種DNA轉(zhuǎn)錄的RNA (包括前體mRNA和mRNA)、還有從這種RNA衍生的cDNA、編碼序列、非編碼序列、有義或反義多核苷酸。寡聚化合物與其靶核酸的特異性雜交干擾核酸的正常功能。特異性地與靶核酸雜交的化合物對(duì)靶核酸功能的這一調(diào)節(jié)通常稱為〃反義〃。待干擾的DNA功能包括，例如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。待干擾的RNA功能包括所有重要功能，例如，RNA向蛋白翻譯位置的移位，從RNA翻譯為蛋白，剪接RNA以產(chǎn)生一種或多種mRNA種類以及可能由RNA參與或促進(jìn)的催化活性。這種干擾靶核酸功能的總效果是調(diào)節(jié)編碼的產(chǎn)物或寡核苷酸的表達(dá)。RNA干擾"RNAi "由對(duì)其〃靶〃核酸序列具有序列特異性的同源性的雙鏈RNA(dsRNA)分子介導(dǎo)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，介導(dǎo)物是5-25個(gè)核苷酸的〃小干擾"RNA雙鏈體(siRNA)。siRNA來源于稱為Dicer的RNA酶對(duì)dsRNA的加工。siRNA雙鏈體產(chǎn)物被募集到稱為RISC (RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體)的多蛋白siRNA復(fù)合體中。不希望受任何特定理論束縛，認(rèn)為隨后RISC被引導(dǎo)至靶核酸(適當(dāng)?shù)貫閙RNA)，在那里siRNA雙鏈體以序列特異性方式相互作用來以催化方式介導(dǎo)裂解。根據(jù)本發(fā)明可使用的小干擾RNA可根據(jù)本領(lǐng)域公知并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的方案合成和使用。用于本發(fā)明方法的小干擾RNA適當(dāng)?shù)匕sI至約50個(gè)核苷酸(nt)。在非限制性實(shí)施方案的實(shí)例中，siRNA可包括約5至約40nt、約5至約30nt、約10至約30nt、約15至約25nt或約20-25個(gè)核苷酸。通過利用自動(dòng)比對(duì)核酸序列并指明同一性或同源性的區(qū)域的計(jì)算機(jī)程序來便于選擇適當(dāng)?shù)墓押塑账帷＿@種程序用來比較獲得的核酸序列，例如通過搜尋數(shù)據(jù)庫例如GenBank或通過對(duì)PCR產(chǎn)物測序。比較來自一系列物種的核酸序列允許選擇在物種之間展示適當(dāng)?shù)耐恍猿潭鹊暮怂嵝蛄?。在未被測序的基因的情形中，進(jìn)行DNA印跡以允許確定靶物種與其它物種的基因之間的同一性程度。如本領(lǐng)域所熟知的，通過以不同的嚴(yán)格性程度進(jìn)行DNA印跡，可能獲得近似的同一性測量。這些方案允許選擇展現(xiàn)與待控制的受治療者中的靶核酸序列的高程度互補(bǔ)性和與其它物種中的相應(yīng)核酸序列的較低程度互補(bǔ)性的寡核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在選擇用于本發(fā)明的基因的適當(dāng)區(qū)域方面存在相當(dāng)大的自由?！?酶促 RNA"是指具有酶促活性的 RNA 分子(Cech, (1988) J. American. Med.Assoc. 260，3030-3035)。酶促核酸(核酶)通過首先結(jié)合靶RNA來作用。這種結(jié)合經(jīng)由被保持在鄰近用于裂解靶RNA的分子的酶促部分處的酶促核酸的靶結(jié)合部分來進(jìn)行。因此，酶促核酸首先識(shí)別靶RNA然后經(jīng)由堿基配對(duì)結(jié)合靶RNA，結(jié)合到正確位置時(shí)，酶促地作用以切割靶RNA?！ㄕT餌RNA〃是指模擬配體的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RNA分子。因此，誘餌RNA與天然結(jié)合靶競爭結(jié)合特定配體。例如，已經(jīng)顯示HIV反式激活響應(yīng)(TAR)RNA的過表達(dá)可作為〃誘餌〃起作用并有效地結(jié)合HIV tat蛋白，從而阻止其結(jié)合HIV RNA中編碼的TAR序列。這表示一個(gè)特定的實(shí)例。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，這僅是一個(gè)實(shí)例，利用本領(lǐng)域通常已知的技術(shù)可容易地產(chǎn)生其它實(shí)施方案。本文所用的術(shù)語〃單體〃通常是指由磷酸二酯鍵或其類似物連接以形成大小從數(shù)個(gè)單體單位例如約3-4個(gè)至約數(shù)百個(gè)單體單位范圍的寡核苷酸的單體。磷酸二酯鍵合的類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯和類似物，如以下更充分地描述。術(shù)語“核苷酸”涵蓋天然存在的核苷酸以及非天然存在的核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)清楚的是，此前被認(rèn)為是"非天然存在的"各種核苷酸后來已在自然界中發(fā)現(xiàn)。因此，"核苷酸"不僅包括已知的含嘌呤和嘧啶雜環(huán)的分子，還包括其雜環(huán)類似物和互變異構(gòu)體。其它類型的核苷酸的示例性實(shí)例是含腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脫氮雜黃嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、N4，N4-橋亞乙基胞嘧啶、N6, N6-橋亞乙基-2，6- 二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、肌苷的分子以及Benner等，美國專利No. 5，432，272中描述的〃非天然存在的〃核苷酸。術(shù)語"核苷酸"預(yù)期涵蓋這些實(shí)例的每一種和所有以及其類似物和互變異構(gòu)體。尤其關(guān)注的核苷酸是包含腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的那些，它們被認(rèn)為是與在人的治療和診斷應(yīng)用有關(guān)的天然存在的核苷酸。核苷酸包括天然2’ -脫氧糖和2’ -羥基糖，例如在Kornberg和 Baker, DNA Replication,第 2 版· (Freeman, San Francisco, 1992)中描述的，以及它們的類似物。提及核苷酸的"類似物"包括具有修飾的堿基部分和/或修飾的糖部分的合成的核苷酸(參見例如，通常描述于Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980 ；Freier&Altmann, (1997) Nucl. Acid. Res.，25 (22)，4429-4443, Toulme, J. J. , (2001)Nature Biotechnology 19:17-18 ；Manoharan M., (1999)Biochemica et BiophysicaActal489:117-139 ；Freier S.M. , (1997)Nucleic Acid Research, 25:4429-4443，Uhlman,E., (2000)Drug Discovery&Development, 3:203-213, Herdewin P. , (2000)Antisense&Nucleic Acid Drug Dev. ,10:297-310) ;2’-0，3'-C-連接的[3. 2. 0] 二環(huán)阿拉伯糖核苷。這種類似物包括經(jīng)設(shè)計(jì)以增強(qiáng)結(jié)合特性，例如，雙鏈體或三鏈體穩(wěn)定性、特異性或類似特性的合成的核苷酸。本文所用的〃雜交〃是指寡聚化合物的大致互補(bǔ)鏈的配對(duì)。配對(duì)的一種機(jī)制包括寡聚化合物的鏈的互補(bǔ)核苷或核苷酸堿基(核苷酸)之間的氫鍵合，其可以是Watson-Crick、Hodgsteen或逆Hoegsteen氫鍵合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是經(jīng)由氫鍵形成而配對(duì)的互補(bǔ)核苷酸。雜交可在不同情況下發(fā)生。當(dāng)反義化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能以導(dǎo)致功能和/或活性的調(diào)節(jié)時(shí)，該化合物是"可特異性雜交的"，且在期望特異性結(jié)合的條件下(即，在體內(nèi)測定或治療性治療的情形中的生理?xiàng)l件下和在體外測定的情形中進(jìn)行測定的條件下)存在足夠程度的互補(bǔ)性以避免反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合。本文所用的短語"嚴(yán)格雜交條件"或"嚴(yán)格條件"是指本發(fā)明化合物將與其靶序列雜交，但與最小數(shù)目的其它序列雜交的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的且在不同情況中將是不同的，并且在本發(fā)明范疇中，寡聚化合物與靶序列雜交的"嚴(yán)格條件"由寡聚化合物的性質(zhì)和組成以及研究它們的測定決定。通常，嚴(yán)格雜交條件包括低濃度(〈O. 15M)的帶有無機(jī)陽離子例如Na++或K++的鹽(即，低離子強(qiáng)度)、高于20°C _25°C低于寡聚化合物靶序列復(fù)合體的Tm的溫度、和存在變性劑例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲亞砜或去垢劑十二烷基硫酸鈉(SDS)。例如，對(duì)于每種1%甲酰胺，雜交率降低I. 1%。高嚴(yán)格雜交條件的實(shí)例是在60°C下O. IX氯化鈉-檸檬酸鈉緩沖液(SSC)/0. l%(w / V) SDS進(jìn)行30分鐘。本文所用的〃互補(bǔ)〃是指一條或兩條寡聚鏈上的兩個(gè)核苷酸之間準(zhǔn)確配對(duì)的能力。例如，如果在反義化合物某一位置的核堿基能夠與在靶核酸某一位置的核堿基氫鍵結(jié)合，所述靶核酸為DNA、RNA或寡核苷酸分子，則認(rèn)為寡核苷酸與靶核酸之間的氫鍵結(jié)合位置是互補(bǔ)位置。當(dāng)每個(gè)分子的足夠數(shù)目的互補(bǔ)位置由可彼此成氫鍵的核苷酸占據(jù)時(shí)，寡聚化合物和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子是彼此互補(bǔ)的。因此，〃可特異性雜交〃和〃互補(bǔ)"是用來表示經(jīng)足夠數(shù)目的核苷酸足夠程度的準(zhǔn)確配對(duì)或互補(bǔ)性，從而在寡聚化合物和 靶核酸之間發(fā)生穩(wěn)定和特異性結(jié)合的術(shù)語。
本領(lǐng)域應(yīng)理解的是，寡聚化合物的序列不必與待可特異性雜交的其靶核酸的序列100%互補(bǔ)。而且，寡核苷酸可經(jīng)一個(gè)或多個(gè)區(qū)段雜交，從而其間的或相鄰區(qū)段不牽涉在雜交事件中(例如，環(huán)結(jié)構(gòu)、錯(cuò)配或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。本發(fā)明的寡聚化合物包括與其所靶向的靶核酸序列中靶區(qū)域具有至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約99%序列互補(bǔ)性。例如,其中反義化合物的20個(gè)核苷酸中的18個(gè)與靶區(qū)域互補(bǔ)從而將特異性雜交的反義化合物將表示90%互補(bǔ)性。在這一實(shí)例中，其余非互補(bǔ)核苷酸可成串或散布于互補(bǔ)核苷酸，不必彼此連續(xù)或與互補(bǔ)核苷酸連續(xù)。因此，具有側(cè)翼為與靶核酸具有完全互補(bǔ)性的兩個(gè)區(qū)域的4 (四)個(gè)非互補(bǔ)核苷酸的長度為18個(gè)核苷酸的反義化合物將與靶核酸具有77. 8%總互補(bǔ)性，因此屬于本發(fā)明的范圍中。反義化合物與靶核酸的區(qū)域的互補(bǔ)性百分比可常規(guī)地利用本領(lǐng)域已知的BLAST程序(基本局部比對(duì)搜索工具)和PowerBLAST程序來確定。同源性、序列同一性或互補(bǔ)性的百分比可通過例如使用Smith 和 Waterman 的算法(Adv. Appl. Math. , (1981) 2, 482-489)的 Gap 程序(Wisconsin序列分析軟件包，用于 Unix 的版本 8，Genetics Computer Group, University ResearchPark, Madison ffis.)確定，并使用默認(rèn)設(shè)置。本文所用的術(shù)語"熱熔點(diǎn)(Tm)"是指在指定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下，與靶序列互補(bǔ)的寡核苷酸的50%平衡地與靶序列雜交的溫度。通常，嚴(yán)格條件將是其中鹽濃度為至少約O. 01至I. OM Na離子濃度(或其它鹽)、pH 7. O至8. 3，且對(duì)于短寡核苷酸(例如，10至50個(gè)核苷酸)溫度為至少約30°C的條件。嚴(yán)格條件還可通過加入去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來實(shí)現(xiàn)。本文所用的〃調(diào)節(jié)〃是指基因表達(dá)的增加(刺激)或減少(抑制)。術(shù)語〃變體〃當(dāng)在多核苷酸序列的上下文中使用時(shí)，可涵蓋與野生型基因相關(guān)的多核苷酸序列。這一定義還可包括，例如，〃等位〃、〃剪接〃、〃物種〃或〃多態(tài)〃變體。剪接變體可與參考分子具有顯著的同一性，但由于在mRNA加工期間外顯子的可選剪接通常將具有更大數(shù)目或更小數(shù)目的多核苷酸。相應(yīng)的多肽可具有另外的功能結(jié)構(gòu)域或缺少結(jié)構(gòu)域。物種變體是在物種之間不同的多核苷酸序列。本發(fā)明中特別有用的是野生型基因產(chǎn)物的變體。變體可來源于核酸序列中至少一種突變，并可產(chǎn)生改變的mRNA或產(chǎn)生結(jié)構(gòu)或功能可能改變或可能不改變的多肽。任何給定的天然或重組基因可具有O種、一種或多種等位基因形式。產(chǎn)生變體的常見突變改變通常歸因于核苷酸的天然缺失、添加或取代。在給定序列中，這些類型改變的每一種可單獨(dú)發(fā)生，或組合其它類型改變發(fā)生一次或多次。所得的多肽通常將具有相對(duì)于彼此顯著的氨基酸同一性。多態(tài)變體是給定物種的個(gè)體之間特定基因的多核苷酸序列的變化。多態(tài)變體還可涵蓋"單核苷酸多態(tài)性"(SNP)或其中多核苷酸序列差異為一個(gè)堿基的單堿基突變。SNP的存在可指示，例如，具有疾病狀態(tài)的傾向的某一群體，所述傾向相比于耐受性為易感性。衍生的多核苷酸包括經(jīng)受化學(xué)修飾(例如以烷基、酰基或氨基代替氫)的核酸。衍生物例如，衍生物寡核苷酸，可包括非天然存在的部分，例如改變的糖部分或糖間鍵合。其中示例的有硫代磷酸酯和本領(lǐng)域已知的其它含硫物質(zhì)。衍生的核酸還可包含標(biāo)記，包括放射性核苷酸、酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、顯色劑、底物、輔因子、抑制劑、磁性粒子和類似物?！ㄑ苌铩ǘ嚯幕螂氖抢缤ㄟ^糖基化、聚乙二醇化、磷酸化、硫酸化、還原/烷基 化、?；?、化學(xué)偶合或適度福爾馬林處理修飾的多肽或肽。還可修飾衍生物以直接或間接包含可檢測的標(biāo)記，包括但不限于，放射性同位素、熒光和酶標(biāo)記。本文所用的術(shù)語〃動(dòng)物〃或〃患者〃意為包括，例如人、綿羊、麋鹿、鹿、長耳鹿、貂、哺乳動(dòng)物、猴、馬、牛、豬、山羊、犬、貓、大鼠、小鼠、鳥類、雞、爬行動(dòng)物、魚、昆蟲和蛛形綱動(dòng)物?！ú溉閯?dòng)物〃涵蓋通常處于醫(yī)療護(hù)理下的溫血哺乳動(dòng)物(例如，人和馴養(yǎng)的動(dòng)物)。實(shí)例包括貓科動(dòng)物、犬科動(dòng)物、馬科動(dòng)物、牛科動(dòng)物和人，以及僅僅人?！ㄖ委?Treating) 〃或〃治療(treatment) 〃涵蓋治療哺乳動(dòng)物的疾病狀態(tài),并包括(a)防止疾病狀態(tài)在哺乳動(dòng)物中發(fā)生，尤其是當(dāng)所述哺乳動(dòng)物傾向于疾病狀態(tài)但還未被診斷為患有其的時(shí)候；(b)抑制疾病狀態(tài)，例如阻止其發(fā)展；和/或(C)緩解疾病狀態(tài)，例如導(dǎo)致疾病狀態(tài)消退，直到達(dá)到期望端點(diǎn)。治療還包括疾病癥狀的改善(例如，減輕疼痛或不適)，其中所述改善可或不可直接影響疾病(例如起因、傳染、表達(dá)等等)。本文所用的〃癌癥〃是指在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的所有類型的癌癥或贅生物或惡性腫瘤，包括但不限于白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤。癌癥本身表現(xiàn)為〃腫瘤〃或包括癌癥惡性細(xì)胞的組織。腫瘤的實(shí)例包括肉瘤和癌，例如但不限于纖維肉瘤、粘液肉瘤、月旨肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、腎母細(xì)胞瘤、宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤?？捎酶鶕?jù)本發(fā)明公開的組合物治療的其它癌癥包括但不限于，例如霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、橫紋肌肉瘤、原發(fā)性血小板增多癥、原發(fā)性巨球蛋白血癥、小細(xì)胞肺腫瘤、原發(fā)性腦瘤、胃癌、結(jié)腸癌、惡性胰島腫瘤、惡性類癌瘤、膀胱癌、胃癌、惡變前皮膚損傷、睪丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、惡性高鈣血癥、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎上腺皮質(zhì)癌和前列腺癌。本文所用的術(shù)語〃血管疾病或病癥〃是指循環(huán)系統(tǒng)的疾病。血管疾病包括動(dòng)脈疾病、例如冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)、周圍動(dòng)脈疾病(PAD)、腹主動(dòng)脈瘤和靜脈疾病，例如血凝塊、深部靜脈血栓形成、靜脈停滯疾病、靜脈炎、靜脈曲張。動(dòng)脈粥樣硬化是大多數(shù)血管疾病的潛在病因，并且由此患有動(dòng)脈粥樣硬化的受試者是利用本文所述的組合物和方法的治療的候選者。心血管疾病或病癥包括可導(dǎo)致缺血或由心臟再灌注引起的那些病癥。實(shí)例包括但不限于，動(dòng)脈硬化、冠狀動(dòng)脈病、巨細(xì)胞性心肌炎、慢性心肌炎(非肉芽腫性)、原發(fā)性肥大型心肌病、外周動(dòng)脈病(PAD)、外周血管病、靜脈血栓栓塞癥、肺栓塞、中風(fēng)、心絞痛、心肌梗塞、心搏停止造成的心血管組織損傷、心臟旁路造成的心血管組織損傷、心源性休克、和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的相關(guān)疾患或包括心臟或脈管系統(tǒng)的功能障礙或組織損傷的相關(guān)疾患，尤其是但不限于，ADAM活化相關(guān)的組織損傷。CVS疾病包括但不限于，動(dòng)脈硬化、肉芽腫性 心肌炎、心肌梗塞、瓣膜性心臟病繼發(fā)性心肌纖維化、無梗塞的心肌纖維化、原發(fā)性肥大性心肌病和慢性心肌炎(非肉芽腫性)。本文所用的“心肌病”是指心肌層(心肌)的任何疾病或機(jī)能障礙，其中心臟被異常擴(kuò)大、增厚和/或變硬。作為結(jié)果，心肌泵送血液的能力通常變?nèi)?。疾病或病癥可以是例如炎性的、代謝性的、毒性的、浸潤性的、纖維形成性的、血液的、遺傳性的或起因未知的。此類心肌病可由缺氧而產(chǎn)生。其它疾病包括由心肌損傷(包括由于疾病或創(chuàng)傷引起的心壁中肌肉或心肌層的損害)引起的疾病。心肌損傷可歸因于很多因素，例如但不限于心肌病、心肌梗塞、或先天性心臟病。待治療的具體心臟病癥還包括充血性心力衰竭、心室或房中隔缺損、充血性心臟缺損或心室壁瘤。心臟病癥可以是兒科來源的。心肌病包括但不限于心肌病(擴(kuò)張型心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病、致心律失常型心肌病和未分類型心肌病)、急性和慢性心力衰竭、右心衰竭、左心衰竭、兩心室性心力衰竭、先天性心力衰竭、二尖瓣狹窄、二尖瓣閉鎖不全、肺動(dòng)脈瓣狹窄、肺動(dòng)脈瓣閉鎖不全、組合型瓣膜缺損、心肌炎、急性心肌炎、慢性心肌炎、病毒性心肌炎、舒張性心力衰竭、收縮性心力衰竭、糖尿病性心力衰竭和貯積病。"代謝疾病或病癥"是指寬范圍的內(nèi)分泌系統(tǒng)的疾病和病癥，例如胰島素抵抗、糖尿病、肥胖癥、葡萄糖耐受性受損、高血膽固醇、高血糖癥、高胰島素血癥和高脂血癥。多核苷酸和寡核苷酸組合物和分子靶在一個(gè)實(shí)施方案中，靶包括成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)的核酸序列，包括但不限于FGF21相關(guān)的有義和/或反義的非編碼和/或編碼序列。FGF21是屬于成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)的亞族的分泌型多肽，包括FGF19、FGF21和FGF23。FGF21是非典型FGF，因?yàn)槠涫歉嗡匾蕾囆缘那以谄咸烟?、脂質(zhì)和能量代謝的調(diào)節(jié)中起激素的作用。從肝cDNA文庫分離作為肝分泌因子的FGF21。它在肝和胰臟中高度表達(dá)并且是FGF家族中主要在肝中表達(dá)的唯一成員。過表達(dá)FGF21的轉(zhuǎn)基因小鼠顯示緩慢生長速率、低血糖和甘油三酯水平的代謝表型，以及顯示缺少年齡相關(guān)的2型糖尿病、胰島細(xì)胞增生和肥胖癥。成纖維細(xì)胞生長因子21成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)基于cDNA序列與其它FGF的同源性被鑒定。系統(tǒng)發(fā)育和結(jié)構(gòu)分析已指定FGF21至FGF19亞族，其包括FGF15(人FGF19的直向同源物)、FGF19、FGF21和FGF23。FGF19亞族成員與其它15個(gè)FGF的區(qū)別在于，它們以內(nèi)分泌方式起作用。FGF23主要從骨中分泌并且作用于腎臟以抑制磷酸重吸收和維生素D生物合成。FGF 15由腸上皮表達(dá)并且與肝中的膽汁酸合成的負(fù)反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。FGF21主要在肝中表達(dá)并且在尋找具有治療糖尿病的治療潛力的新型活性劑期間作為葡萄糖攝取的代謝調(diào)節(jié)劑在脂肪細(xì)胞中出現(xiàn)。重組FGF21的施用降低肥胖小鼠和糖尿病小鼠兩者中的血糖水平。而且，過表達(dá)FGF21的轉(zhuǎn)基因小鼠是降血糖的，對(duì)胰島素敏感的且對(duì)飲食誘導(dǎo)的肥胖癥有抗性。在實(shí)施方案中，反義寡核苷酸用來預(yù)防或治療FGF21家族成員相關(guān)的疾病或病癥。可用從利用反義化合物獲得 的干細(xì)胞再生的細(xì)胞/組織治療的示例性成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)介導(dǎo)的疾病和病癥包括與FGF21的異常功能和/或表達(dá)相關(guān)的疾病或病癥、代謝疾病或病癥(例如糖尿病、肥胖癥、血脂障礙、高血糖癥、高胰島素血癥、高血壓、脂肪性肝炎如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)等)、癌癥、與脂質(zhì)代謝受損相關(guān)的疾病或病癥、與腎功能受損相關(guān)的疾病或病癥、與肝功能受損相關(guān)的疾病或病癥、異常細(xì)胞增殖、血管疾病或病癥(例如冠狀動(dòng)脈疾病、周圍動(dòng)脈疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、腹主動(dòng)脈瘤、血凝塊、深部靜脈血栓形成、靜脈停滯疾病、靜脈炎、靜脈曲張等)、血管發(fā)生、動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病或病癥、與血管形成受損相關(guān)的疾病或病癥、與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)受損相關(guān)的疾病或病癥、與激酶活性受損相關(guān)的疾病或病癥、與至脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取受損相關(guān)的疾病或病癥、與FGF21和FGFR-I或FGFR-2中的一者或兩者之間的相互作用受損相關(guān)的疾病或病癥、與FGFR-I或FGFR-2蛋白的磷酸化受損相關(guān)的疾病或病癥、和細(xì)胞凋亡。在實(shí)施方案中，將一種或多種反義寡核苷酸對(duì)FGF21的調(diào)節(jié)向需要其的患者施用以預(yù)防或治療與正常對(duì)照相比的FGF21異常表達(dá)、功能、活性相關(guān)的任何疾病或病癥。在實(shí)施方案中，寡核苷酸是對(duì)FGF21多核苷酸有特異性，該多核苷酸包括但不限于非編碼區(qū)。FGF21靶包括FGF21的變體；FGF21的突變體，包括SNP ；FGF21的非編碼序列；等位基因、片段和類似物。優(yōu)選地寡核苷酸是反義RNA分子。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，靶核酸分子不限于僅FGF21多核苷酸，還延伸到FGF21的任何同種型、受體、同系物、非編碼區(qū)和類似物。在實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向FGF21靶的天然反義序列(與編碼區(qū)和非編碼區(qū)天然反義)，包括但不限于，其變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段及其互補(bǔ)序列。優(yōu)選地寡核苷酸是反義RNA或DNA分子。在實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物還包括變體，其中在化合物中一個(gè)或多個(gè)核苷酸位置存在不同堿基。例如，如果第一個(gè)核苷酸是腺嘌呤，可產(chǎn)生在這一位置包含胸苷、鳥苷、胞苷或其它天然或非天然核苷酸的變體。這可在反義化合物的任何位置進(jìn)行。隨后利用本文所述的方法測定這些化合物以確定它們抑制靶核酸表達(dá)的能力。在一些實(shí)施方案中，反義化合物與靶之間的同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是從約50%至約60%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是從約60%至約70%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是從約70%至約80%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是從約80%至約90%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。當(dāng)反義化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能以導(dǎo)致活性的喪失時(shí)，該化合物是可特異性雜交的，且在期望特異性結(jié)合的條件下存在足夠程度的互補(bǔ)性以避免反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合。這種條件包括，即，在體內(nèi)測定或治療性治療的情形中的生理?xiàng)l件以及在體外測定的情形中進(jìn)行測定的條件。當(dāng)反義化合物(無論是DNA、RNA、嵌合、取代的等等)與靶DNA或RNA分子的結(jié)合干擾靶DNA或RNA的正常功能以導(dǎo)致效用的喪失時(shí)，該化合物是可特異性雜交的，且在期望特異性結(jié)合的條件下(即，在體內(nèi)測定或治療性治療的情形中的生理?xiàng)l件下以及在體外測定的情形中進(jìn)行測定的條件下)存在足夠程度的互補(bǔ)性以避免反義化合物與非靶序列的非特異性結(jié)合。在實(shí)施方案中，F(xiàn)GF21的靶向包括但不限于，利用例如PCR、雜交等鑒定和擴(kuò)展的反義序列、一種或多種如SEQ ID NO:2所列的序列和調(diào)節(jié)FGF21表達(dá)或功能的類似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，與對(duì)照相比表達(dá)或功能 被上調(diào)。在實(shí)施方案中，與對(duì)照相比表達(dá)或功能被下調(diào)。在實(shí)施方案中，寡核苷酸包括如SEQ ID NO: 3至9所列的核酸序列，包括利用例如PCR、雜交等鑒定和擴(kuò)展的反義序列。這些寡核苷酸可包括一種或多種修飾的核苷酸、更短或更長的片段、修飾的鍵和類似物。修飾的鍵或核苷酸間鍵合的實(shí)例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或類似物。在實(shí)施方案中，核苷酸包括磷衍生物?？筛郊佑诒景l(fā)明的修飾的寡核苷酸中的糖或糖類似物部分的磷衍生物(或修飾的磷酸酯基團(tuán))可以是單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、磷酸烷烴酯、硫代磷酸酯和類似物。上述磷酸酯類似物的制備和將其向核苷酸、修飾的核苷酸和寡核苷酸的并入本身是已知的，不必在此描述。反義的特異性和靈敏性還由本領(lǐng)域技術(shù)人員利用以用于治療用途。反義寡核苷酸已在動(dòng)物和人的疾病狀態(tài)的治療中用作治療部分。反義寡核苷酸已經(jīng)安全且有效地施用于人，目前正在進(jìn)行許多臨床試驗(yàn)。因此已經(jīng)確定，寡核苷酸可以是有用的治療形態(tài)，可被配置以用于治療細(xì)胞、組織和動(dòng)物(尤其是人)的治療方案。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，寡聚反義化合物，尤其是寡核苷酸，結(jié)合靶核酸分子并調(diào)節(jié)靶基因編碼的分子的表達(dá)和/或功能。待干擾的DNA的功能包括，例如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。待干擾的RNA功能包括所有重要功能，例如RNA向蛋白翻譯位置的移位，從RNA翻譯為蛋白，剪接RNA以產(chǎn)生一種或多種mRNA種類以及可由RNA參與或促進(jìn)的催化活性。取決于期望的功能，功能可被上調(diào)或抑制。反義化合物包括反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、可選剪接體、引物、探針以及與靶核酸的至少一部分雜交的其它寡聚化合物。因此，這些化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明范疇中，將反義化合物靶向特定核酸分子可以是多步驟的過程。該過程通常開始于鑒定待調(diào)節(jié)其功能的靶核酸。這一靶核酸可以是，例如，其表達(dá)與特定病癥或疾病狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞基因(或從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)或來自感染物的核酸分子。在本發(fā)明中，靶核酸編碼性激素集合球蛋白成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)。靶向過程通常還包括確定靶核酸中發(fā)生反義相互作用從而產(chǎn)生期望作用例如調(diào)節(jié)表達(dá)的至少一個(gè)靶區(qū)域、區(qū)段或位置。在本發(fā)明范疇中，術(shù)語〃區(qū)域〃定義為具有至少一種可鑒定結(jié)構(gòu)、功能或特征的靶核酸的一部分。靶核酸區(qū)域中是區(qū)段。"區(qū)段"定義為靶核酸中較小區(qū)域或區(qū)域的亞部分。本發(fā)明中使用的"位置"定義為靶核酸中的位置。在實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)的天然反義序列并調(diào)節(jié)FGF21(SEQ ID NO: I)的表達(dá)和/或功能。反義序列的實(shí)例包括SEQ ID NO:2至9。在實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)區(qū)并調(diào)節(jié)FGF21的表達(dá)和/或功能。區(qū)段包括FGF21的有義或反義多核苷酸的至少五個(gè)連續(xù)核苷酸。在實(shí)施方案中，反義寡核苷酸是對(duì)FGF21的天然反義序列有特異性，其中寡核苷酸對(duì)FGF21的天然反義序列的結(jié)合調(diào)節(jié)FGF21的表達(dá)和/或功能。在實(shí)施方案中，寡核苷酸化合物包括如SEQ ID N0:3至9所列的序列、利用例如PCR、雜交等鑒定和擴(kuò)展的反義序列。這些寡核苷酸可包括一種或多種修飾的核苷酸、更短或更長的片段、修飾的鍵和類似物。修飾的鍵或核苷酸間鍵合的實(shí)例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或類似物。在實(shí)施方案中，核苷酸包括磷衍生物?？筛郊佑诒景l(fā)明的修飾的寡核苷酸中的糖或糖類似物部分的磷衍生物(或修飾的磷酸酯基團(tuán))可以是單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、磷酸烷烴酯、硫代磷酸酯和類似物。上述磷酸酯類似物的制備和 將其向核苷酸、修飾的核苷酸和寡核苷酸的并入本身是已知的，不必在此描述。如本領(lǐng)域已知的，因?yàn)榉g起始密碼子通常是5’ -AUG(在轉(zhuǎn)錄的mRNA分子中；在相應(yīng)DNA分子中是5’ -ATG)，翻譯起始密碼子也稱為"AUG密碼子〃、〃起始密碼子〃或"AUG起始密碼子"。少數(shù)基因具有具有RNA序列5’ -GUG、5’ -UUG或5’ -CUG的翻譯起始密碼子；且5’ -AUA、5’ -ACG和5’ -CUG已顯示在體內(nèi)起作用。因此，術(shù)語〃翻譯起始密碼子〃和〃起始密碼子"可涵蓋許多密碼子序列，盡管每種情形中的起始氨基酸通常是甲硫氨酸(真核細(xì)胞中)或甲酰甲硫氨酸(原核細(xì)胞中)。真核基因和原核基因可具有兩個(gè)或更多個(gè)替代性起始密碼子，其中的任何一個(gè)可在特定細(xì)胞類型或組織中或在特定條件設(shè)置下優(yōu)先地用于翻譯起始。在本發(fā)明范疇中，"起始密碼子"和"翻譯起始密碼子"是指體內(nèi)用于起始從編碼成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的翻譯的一種或多種密碼子，而不論這種密碼子的序列?；虻姆g終止密碼子(或〃終止密碼子〃)可具有三種序列即5’ -UAA、5’ -UAG 和 5’ -UGA 之一(相應(yīng)的 DNA 序列分別是 5’ _TAA、5’ -TAG 和 5’ -TGA)。術(shù)語〃起始密碼子區(qū)〃和〃翻譯起始密碼子區(qū)〃是指這種mRNA或基因的一部分，涵蓋以任一方向(即，5’或3’)從翻譯起始密碼子的約25至約50個(gè)連續(xù)核苷酸。類似地，術(shù)語〃終止密碼子區(qū)〃和〃翻譯終止密碼子區(qū)〃是指這種mRNA或基因的一部分，涵蓋以任一方向(即，5’或3’)從翻譯終止密碼子的約25至約50個(gè)連續(xù)核苷酸。因此，〃起始密碼子區(qū)〃(或"翻譯起始密碼子區(qū)〃)和"終止密碼子區(qū)〃(或"翻譯終止密碼子區(qū)〃)都是可用本發(fā)明的反義化合物有效地靶向的區(qū)域。本領(lǐng)域已知開放讀碼框(ORF)或〃編碼區(qū)〃是指翻譯起始密碼子與翻譯終止密碼子之間的區(qū)域，也是可被有效地靶向的區(qū)域。在本發(fā)明范疇中，靶向的區(qū)域是涵蓋基因開放讀碼框(ORF)的翻譯起始或終止密碼子的基因內(nèi)區(qū)域。另一靶區(qū)域包括5’非翻譯區(qū)(5’ UTR)，本領(lǐng)域已知是指mRNA以5’方向從翻譯起始密碼子的部分，因此包括mRNA的5’帽位置與翻譯起始密碼子之間的核苷酸(或基因上相應(yīng)的核苷酸)。又一靶區(qū)域包括3’非翻譯區(qū)(3’UTR)，本領(lǐng)域已知是指mRNA以3’方向從翻譯終止密碼子的部分，因此包括mRNA的翻譯終止密碼子與3’端之間的核苷酸(或基因上相應(yīng)的核苷酸)。mRNA的5^帽位置包括經(jīng)由5’ -5’三磷酸酯鍵合與mRNA的最5’殘基連接的N7-甲基化鳥苷殘基。認(rèn)為mRNA的5’帽區(qū)域包括5’帽結(jié)構(gòu)本身以及與帽位置相鄰的前50個(gè)核苷酸。本發(fā)明的另一靶區(qū)域是5’帽區(qū)域。盡管一些真核mRNA轉(zhuǎn)錄物被直接翻譯，但是許多包含一個(gè)或多個(gè)稱為〃內(nèi)含子〃的區(qū)域，在翻譯前從轉(zhuǎn)錄物切除。其余(因此被翻譯的)區(qū)域稱為"外顯子"，被剪接在一起以形成連續(xù)的mRNA序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向剪接位置，即，內(nèi)含子-外顯子結(jié)點(diǎn)或外顯子-內(nèi)含子結(jié)點(diǎn)在其中疾病中牽涉異常剪接的情形或其中疾病中牽涉特定剪接產(chǎn)物的過度產(chǎn)生的情形尤其有用。由于重排或缺失的異常融合結(jié)點(diǎn)是靶位置的另一形式。由剪接來自不同基因來源的兩個(gè)(或更多個(gè))mRNA的過程產(chǎn)生的mRNA轉(zhuǎn)錄物稱為"融合轉(zhuǎn)錄物"。利用靶向例如DNA或前體mRNA的反義化合物可有效地靶向內(nèi)含子。在實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合靶多核苷酸的編碼區(qū)和/或非編碼區(qū)并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。在實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合天然反義多核苷酸并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或 功能。在實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合有義多核苷酸并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功倉泛?？蓮腄NA的相同基因組區(qū)域產(chǎn)生可選RNA轉(zhuǎn)錄物。這些可選轉(zhuǎn)錄物通常稱為〃變體"。更具體地，〃前體mRNA變體〃是從相同基因組DNA產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物，在其起始或終止位置與從相同基因組DNA產(chǎn)生的其它轉(zhuǎn)錄物不同，并包含內(nèi)含子序列和外顯子序列兩者。在剪接期間切除一個(gè)或多個(gè)外顯子或內(nèi)含子區(qū)域或其部分后，前體mRNA變體產(chǎn)生更小的"mRNA變體〃。因此，mRNA變體是加工的前體mRNA變體，且每個(gè)獨(dú)特的前體mRNA變體必定因?yàn)榧艚佣a(chǎn)生獨(dú)特的mRNA變體。這些mRNA變體還稱為〃可選剪接變體〃。如果不進(jìn)行前體mRNA變體的剪接，則前體mRNA變體與mRNA變體相同。變體可經(jīng)由使用可選信號(hào)產(chǎn)生以起始或終止轉(zhuǎn)錄。前體mRNA和mRNA可具有多于一個(gè)起始密碼子或終止密碼子。來源于使用可選起始密碼子的前體mRNA或mRNA的變體稱為該前體mRNA或mRNA的"可選起始變體"。使用可選終止密碼子的那些轉(zhuǎn)錄物稱為該前體mRNA或mRNA的〃可選終止變體"。一種特定類型的可選終止變體是〃聚腺苷酸變體"，其中產(chǎn)生的多個(gè)轉(zhuǎn)錄物由"聚腺苷酸終止信號(hào)"之一被轉(zhuǎn)錄機(jī)制可選選擇所致，從而產(chǎn)生在獨(dú)特聚腺苷酸位點(diǎn)終止的轉(zhuǎn)錄物。在本發(fā)明范疇中，本文所述的變體類型也是靶核酸的實(shí)施方案。靶核酸上與反義化合物雜交的位置定義為活性反義化合物靶向的靶區(qū)域的至少5-核苷酸長的部分。盡管本文列出了某些示例性靶區(qū)段的具體序列，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解這些用于闡釋和描述于本發(fā)明范圍中的具體實(shí)施方案。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員考慮到本公開內(nèi)容可容易地鑒定另外的靶區(qū)段。認(rèn)為包括選自示例性優(yōu)選的靶區(qū)段中的至少五(5)個(gè)連續(xù)核苷酸的段的長度為5-100個(gè)核苷酸的靶區(qū)段也適合于靶向。靶區(qū)段可包括包括從示例性優(yōu)選的靶區(qū)段之一的5’ -末端的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸的DNA或RNA序列(其余核苷酸為從靶區(qū)段5’ -末端的緊鄰上游開始的相同DNA或RNA的連續(xù)段并延伸直到DNA或RNA包含約5至約100個(gè)核苷酸)。類似地優(yōu)選的靶區(qū)段由包括從示例性優(yōu)選的靶區(qū)段之一的3’ -末端的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸的DNA或RNA序列代表(其余核苷酸為從靶區(qū)段3’ -末端的緊鄰下游開始的相同DNA或RNA的連續(xù)段并延伸直到DNA或RNA包含約5至約100個(gè)核苷酸)。借助本文所示例的靶區(qū)段的本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠鑒定另外的優(yōu)選的靶區(qū)段而不需過度試驗(yàn)。已經(jīng)鑒定出一種或多種靶區(qū)域、區(qū)段或位置后，選擇與靶足夠地互補(bǔ)，S卩，充分良好并以足夠特異性雜交的反義化合物以獲得期望作用。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，寡核苷酸結(jié)合特定靶的反義鏈。寡核苷酸長度為至少5個(gè)核苷酸并可合成以使每個(gè)寡核苷酸靶向重疊序列，從而寡核苷酸被合成以覆蓋靶多核苷酸的整個(gè)長度。靶還包括編碼區(qū)以及非編碼區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將反義寡核苷酸靶向特定核酸是優(yōu)選的。將反義化合物靶向特定核酸是多步驟的過程。該過程通常開始于鑒定待調(diào)節(jié)其功能的核酸序列。這一核酸序列可以是，例如，其表達(dá)與特定病癥或疾病狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞基因(或從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)、或非編碼多核苷酸，例如非編碼RNA(ncRNA)。 RNA可分為(I)信使RNA(mRNA)，其被翻譯為蛋白，和(2)非蛋白編碼RNA(ncRNA)。ncRNA包括微RNA、反義轉(zhuǎn)錄物和包含高密度終止密碼子和缺少任何廣泛的〃開放讀碼框〃的其它轉(zhuǎn)錄單位(TU)。許多ncRNA表現(xiàn)為從蛋白-編碼基因座的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)中的起始位點(diǎn)開始。ncRNA通常是罕見的，已被FANTOM財(cái)團(tuán)測序的ncRNA的至少一半似乎不是多腺苷酸化的。出于明顯的原因，大多數(shù)研究者集中于被加工并輸出到細(xì)胞質(zhì)的多腺苷酸化mRNA。最近，顯示非多腺苷酸化的核RNA的組可能是非常大的，且許多這樣的轉(zhuǎn)錄物來源于所謂的基因間區(qū)。ncRNA可調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制是通過與靶轉(zhuǎn)錄物的堿基配對(duì)。通過堿基配對(duì)起作用的RNA可分為(I)順式編碼的RNA，其在它們所作用的RNA的相同遺傳位置但在相對(duì)鏈上被編碼，因此與其靶展示極佳的互補(bǔ)性，和(2)反式編碼的RNA，其在不同于它們所作用的RNA的染色體位置被編碼，通常不與其靶展示極佳的堿基-配對(duì)可能。不希望受限于理論，反義多核苷酸被本文所述的反義寡核苷酸的擾動(dòng)可改變相應(yīng)有義信使RNA的表達(dá)。然而，這一調(diào)節(jié)可以是不一致的(反義敲低導(dǎo)致信使RNA升高)或一致的(反義敲低導(dǎo)致相伴的信使RNA減少)。在這些情形中，反義寡核苷酸可靶向于反義轉(zhuǎn)錄物的重疊或非重疊部分，導(dǎo)致其敲低或隔離。編碼以及非編碼反義可以相同方式靶向，任一種類能夠調(diào)節(jié)相應(yīng)的有義轉(zhuǎn)錄物-以一致的或不一致的方式。鑒定針對(duì)靶使用的新寡核苷酸中采用的策略可基于反義RNA轉(zhuǎn)錄物被反義寡核苷酸的敲低或調(diào)節(jié)期望靶的任何其它手段。策略I :在不一致調(diào)節(jié)的情形下，敲低反義轉(zhuǎn)錄物升高常規(guī)(有義)基因的表達(dá)。如果后者基因編碼已知或推測的藥物靶，則其反義對(duì)應(yīng)物的敲低能夠可設(shè)想地模擬受體激動(dòng)劑或酶刺激劑的作用。策略2 :在一致調(diào)節(jié)的情形下，人們可以協(xié)同地敲低反義轉(zhuǎn)錄物和有義轉(zhuǎn)錄物兩者，從而實(shí)現(xiàn)常規(guī)(有義)基因表達(dá)的協(xié)同減少。例如，如果反義寡核苷酸用來實(shí)現(xiàn)敲低，則這一策略可用來施加靶向有義轉(zhuǎn)錄物的一種反義寡核苷酸和靶向相應(yīng)反義轉(zhuǎn)錄物的另一反義寡核苷酸，或同時(shí)靶向重疊的有義轉(zhuǎn)錄物和反義轉(zhuǎn)錄物的單個(gè)有力地對(duì)稱的反義寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，反義化合物包括反義寡核苷酸、核酶、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單鏈或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物例如siRNA化合物以及雜交于靶核酸的至少一部分并調(diào)節(jié)其功能的其它寡聚化合物。因此，它們可以是DNA、RNA、DNA-樣、RNA-樣或其混合物，或可以是一種或多種這些的模擬物。這些化合物可以是單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化合物，并可包含結(jié)構(gòu)元件，例如內(nèi)部凸出或末端凸出、錯(cuò)配或環(huán)。常規(guī)線性地制備反義化合物，但可被連接或以其它方式制備為環(huán)狀和/或分支的。反義化合物可包括構(gòu)建體，例如，兩條鏈雜交以形成完全或部分雙鏈的化合物或者具有足夠自互補(bǔ)性的單鏈以允許雜交和形成完全或部分雙鏈的化合物。兩條鏈可在內(nèi)部被連接，留下游離的3’或5’末端，或可被連接以形成連續(xù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可包含在5’或3’末端的突出，產(chǎn)生單鏈特征的延伸段。雙鏈化合物任選地可包括在末端的突出。進(jìn)一步的修飾可包括附加于末端之一、所選的核苷酸位置、糖位置或核苷間鍵合之一的綴合物基團(tuán)。可選地，兩條鏈可經(jīng)由非核酸部分或接頭基團(tuán)連接。當(dāng)僅由一條鏈形成時(shí)，dsRNA可采取自互補(bǔ)發(fā)夾型分子的形式，其與自身對(duì)折以形成雙鏈體。因此，dsRNA可以是完全或部分雙鏈的?；虮磉_(dá)的特異性調(diào)節(jié)可通過在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)dsRNA發(fā)夾來實(shí)現(xiàn),然而,在一些實(shí)施 方案中，基因表達(dá)或功能被上調(diào)。當(dāng)由兩條鏈或采取與自身對(duì)折以形成雙鏈體的自互補(bǔ)發(fā)夾型分子形式的單鏈形成時(shí)，兩條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區(qū))是以Watson-Crick方式堿基配對(duì)的互補(bǔ)RNA鏈。被引入系統(tǒng)中后，本發(fā)明的化合物可引發(fā)一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用以實(shí)現(xiàn)靶核酸的裂解或其它修飾，或可經(jīng)由基于占位性的機(jī)制作用。通常，核酸(包括寡核苷酸)可描述為"DNA-樣〃(S卩，通常具有一個(gè)或多個(gè)2’ -脫氧糖，且通常具有T而不是U堿基)或〃RNA-樣〃(即，通常具有一個(gè)或多個(gè)2’ -羥基或2’ -修飾的糖，且通常具有U而不是T堿基)。核酸螺旋可采用多于一種類型的結(jié)構(gòu)，最通常是A-和B-形式。通常認(rèn)為，具有B-形式-樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸是"DNA-樣〃，且具有A-形式樣結(jié)構(gòu)的是"RNA-樣〃。在一些(嵌合)實(shí)施方案中，反義化合物可包含A-形式區(qū)域和B-形式區(qū)域兩者。在實(shí)施方案中，期望寡核苷酸或反義化合物包括以下至少一種反義RNA、反義DNA、嵌合反義寡核苷酸、包括修飾的鍵合的反義寡核苷酸、干擾RNA(RNAi)、短干擾RNA (siRNA)、微干擾 RNA (miRNA)、時(shí)序調(diào)節(jié)小 RNA (stRNA)或短發(fā)夾 RNA (shRNA)、小 RNA-誘導(dǎo)的基因活化(RNAa)、小活化RNA(saRNA)或其組合。dsRNA還可活化基因表達(dá)，這是已被稱為"小RNA-誘導(dǎo)的基因活化〃或RNAa的機(jī)制。dsRNA靶向基因啟動(dòng)子誘導(dǎo)相關(guān)基因的有效的轉(zhuǎn)錄活化。RNAa在人細(xì)胞中利用合成的dsRNA證實(shí)，稱為"小活化RNA" (saRNA)。目前未知RNAa在其它生物體中是否是保守的。已發(fā)現(xiàn)小雙鏈RNA (dsRNA)，例如小干擾RNA (siRNA)和微RNA (miRNA)是稱為RNA干擾(RNAi)的進(jìn)化保守機(jī)制的觸發(fā)物。RNAi不變性經(jīng)由重建染色質(zhì)導(dǎo)致基因沉默，從而阻遏轉(zhuǎn)錄、降解互補(bǔ)mRNA或阻斷蛋白翻譯。然而在以下實(shí)施例部分詳細(xì)描述的情況中，寡核苷酸顯示增加成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)多核苷酸和其編碼的產(chǎn)物的表達(dá)和/或功能。dsRNA還可作為小活化RNA(saRNA)作用。不希望受理論束縛，通過靶向基因啟動(dòng)子中的序列，saRNA將以稱為dsRNA-誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活化(RNAa)的現(xiàn)象誘導(dǎo)靶基因表達(dá)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本文鑒定的〃優(yōu)選的靶區(qū)段〃可用于篩選調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)多核苷酸表達(dá)的另外的化合物?！ㄕ{(diào)節(jié)劑〃是減少或增加編碼FGF21的核酸分子表達(dá)的那些化合物，且包括與優(yōu)選的靶區(qū)段互補(bǔ)的至少5-核苷酸部分。篩選方法包括以下步驟將編碼FGF21的有義或天然反義多核苷酸的核酸分子的優(yōu)選的靶區(qū)段與一種或多種候選調(diào)節(jié)劑接觸，并選擇減少或增加編碼FGF21多核苷酸的核酸分子(例如SEQID NO: 3至9)的表達(dá)的一種或多種候選調(diào)節(jié)劑。顯示一種或多種候選調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)節(jié)(例如，減少或增加)編碼FGF21多核苷酸的核酸分子的表達(dá)后，隨后調(diào)節(jié)劑可用于FGF21多核苷酸功能的進(jìn)一步研究性研究，或用作根據(jù)本發(fā)明的研究劑、診斷劑或治療劑。靶向天然反 義序列優(yōu)選地調(diào)節(jié)靶基因的功能。例如，F(xiàn)GF21基因(例如，登錄號(hào)匪019113)。在實(shí)施方案中，靶是FGF21基因的反義多核苷酸。在實(shí)施方案中，反義寡核苷酸靶向FGF21多核苷酸(例如，登錄號(hào)NM_019113)的有義和/或天然反義序列、變體、等位基因、同種型、同系物、突變體、衍生物、片段及其互補(bǔ)序列。優(yōu)選地寡核苷酸是反義分子且靶包括反義和/或有義FGF21多核苷酸的編碼區(qū)和非編碼區(qū)。本發(fā)明優(yōu)選的靶區(qū)段還可與本發(fā)明的其各自的互補(bǔ)反義化合物組合以形成穩(wěn)定的雙鏈(雙鏈體)寡核苷酸。在本領(lǐng)域中，這種雙鏈寡核苷酸部分已顯示經(jīng)由反義機(jī)制調(diào)節(jié)靶表達(dá)和調(diào)節(jié)翻譯以及RNA加工。而且，可對(duì)雙鏈部分進(jìn)行化學(xué)修飾。例如，這種雙鏈部分已經(jīng)顯示通過雙鏈體的反義鏈與靶經(jīng)典雜交，從而觸發(fā)靶的酶促降解來抑制靶。在實(shí)施方案中，反義寡核苷酸靶向成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)多核苷酸(例如，登錄號(hào)NM_019113)、變體、等位基因、同種型、同系物、突變體、衍生物、片段及其互補(bǔ)序列。優(yōu)選地寡核苷酸是反義分子。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，靶核酸分子不限于僅FGF21，還延伸到FGF21分子的同種型、受體、同系物和類似物的任一種。在實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向FGF21多核苷酸的天然反義序列，例如，如SEQ IDN0:2所列的多核苷酸，和任何變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段及其互補(bǔ)序列。反義寡核苷酸的實(shí)例列在SEQ ID N0:3至9。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸與FGF21反義的核酸序列互補(bǔ)或結(jié)合，包括但不限于FGF21多核苷酸相關(guān)的非編碼有義和/或反義序列，并調(diào)節(jié)FGF21分子的表達(dá)和/或功倉泛。在實(shí)施方案中，寡核苷酸與如SEQ ID NO:2所列的FGF21天然反義的核酸序列互補(bǔ)或結(jié)合，并調(diào)節(jié)FGF21分子的表達(dá)和/或功能。在實(shí)施方案中，寡核苷酸包括SEQ ID NO: 3至9的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，并調(diào)節(jié)FGF21分子的表達(dá)和/或功能。多核苷酸靶包括FGF21，包括其家族成員、FGF21的變體；FGF21的突變體，包括SNP ；FGF21的非編碼序列；FGF21的等位基因；物種變體、片段和類似物。優(yōu)選地寡核苷酸是反義分子。在實(shí)施方案中，靶向FGF21多核苷酸的寡核苷酸包括反義RNA、干擾RNA(RNAi)、短干擾RNA(siRNA);微干擾RNA(miRNA);時(shí)序調(diào)節(jié)小RNA (stRNA);或短發(fā)夾RNA (shRNA)；小RNA誘導(dǎo)的基因活化(RNAa);或小活化RNA(saRNA)。在實(shí)施方案中，靶向成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)多核苷酸(例如SEQ IDNO:2)調(diào)節(jié)這些靶的表達(dá)或功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，與對(duì)照相比表達(dá)或功能被上調(diào)。在實(shí)施方案中，與對(duì)照相比表達(dá)或功能被下調(diào)。
在實(shí)施方案中，反義化合物包括如SEQ ID N0:3至9所列的序列。這些寡核苷酸可包括一種或多種修飾的核苷酸、更短或更長片段、修飾的鍵和類似物。在實(shí)施方案中，SEQ ID NO: 3至9包括一種或多種LNA核苷酸。表I示出本發(fā)明方法中有用的示例性反義寡核苷酸。表I:
權(quán)利要求
1.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與長度為5至30個(gè)核苷酸的至少一種反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種寡核苷酸與包括SEQ ID NO:2的核苷酸I至4246中的5至30個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸的反向互補(bǔ)序列具有至少50%序列同一'丨生；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
2.—種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與長度為5至30個(gè)核苷酸的至少一種反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種寡核苷酸與成纖維細(xì)胞生長因子2KFGF21)多核苷酸的天然反義的反向互補(bǔ)序列具有至少50%序列同一性；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
3.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與長度為5至30個(gè)核苷酸的·至少一種反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%序列同一性；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
4.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與靶向成纖維細(xì)胞生長因子2KFGF21)多核苷酸的天然反義寡核苷酸的區(qū)域的至少一種反義寡核苷酸接觸；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)的功能和/或表達(dá)相對(duì)于對(duì)照體內(nèi)或體外增加。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)多核苷酸的天然反義序列。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向包括成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)多核苷酸的編碼核酸序列和/或非編碼核酸序列的核酸序列。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)多核苷酸的重疊序列和/或非重疊序列。
9.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸包括選自以下的一種或多種修飾至少一種修飾的糖部分、至少一種修飾的核苷間鍵合、至少一種修飾的核苷酸及其組合。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾的糖部分2’ -O-甲氧基乙基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -O-烷基修飾的糖部分、二環(huán)的糖部分及其組合。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾的核苷間鍵合硫代磷酸酯、2’-O甲氧基乙基(MOE)、2’ -氟代、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其組合。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾的核苷酸肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、阿拉伯糖-核酸(FANA)、類似物、衍生物及其組
13.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述至少一種寡核苷酸包括如SEQID N0:3至9所列的至少一種寡核苷酸序列。
14.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)基因的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與長度為5至30個(gè)核苷酸的至少一種短干擾RNA (SiRNA)寡核苷酸接觸，所述至少一種SiRNA寡核苷酸對(duì)成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)多核苷酸的反義多核苷酸有特異性，其中所述至少一種siRNA寡核苷酸與成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)多核苷酸的反義核酸分子和/或有義核酸分子的至少約五個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少50%序列同一性；以及體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)的功能和/或表達(dá)。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述寡核苷酸與成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)多核苷酸的反義核酸分子和/或有義核酸分子互補(bǔ)的至少約五個(gè)連續(xù)核酸的序列具有至少80%序列同一1丨生。
16.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與長度為約5至30個(gè)核苷酸的至少一種反義寡核苷酸接觸，所述至少一種反義寡核苷酸對(duì)成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)多核苷酸的有義和/或天然反義鏈的非編碼序列和/或編碼序列有特異性，其中所述至少一種反義寡核苷酸與如SEQ ID NO: I和2所列的至少一種核酸序列具有至少50%序列同一性；以及體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)的功能和/或表達(dá)。
17.一種合成的、修飾的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括至少一種修飾，其中所述至少一種修飾選自至少一種修飾的糖部分；至少一種修飾的核苷酸間鍵合；至少一種修飾的核苷酸及其組合；其中所述寡核苷酸是與成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)基因雜交并與正常對(duì)照相比體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)其功能和/或表達(dá)的反義化合物。
18.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述至少一種修飾包括選自由以下組成的組的核苷酸間鍵合硫代磷酸酯、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其組合。
19.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一種硫代磷酸酯核苷酸間鍵合。
20.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括硫代磷酸酯核苷酸間鍵合的主鏈。
21.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸包括至少一種修飾的核苷酸，所述修飾的核苷酸選自肽核酸、鎖核酸(LNA)、類似物、衍生物及其組合。
22.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的修飾的核苷酸硫代磷酸酯、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其組合。
23.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的修飾的核苷酸肽核酸、鎖核酸(LNA)、類似物、衍生物及其組合。
24.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括選自以下的至少一種修飾的糖部分2’ -O-甲氧基乙基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -O-烷基修飾的糖部分、二環(huán)的糖部分及其組合。
25.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的修飾的糖部分2’-0_甲氧基乙基修飾的糖部分、2’-甲氧基修飾的糖部分、2’ -O-烷基修飾的糖部分、二環(huán)的糖部分及其組合。
26.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸長度為至少約5至30個(gè)核苷酸并與成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)多核苷酸的反義和/或有義鏈雜交，其中所述寡核苷酸與成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少約20%序列同一性。
27.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與成纖維細(xì)胞生長因子 21 (FGF21)多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少約80%序列同一性。
28.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與至少一種成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)多核苷酸雜交并與正常對(duì)照相比體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)其表達(dá)和/或功能。
29.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括如SEQID NO:3至9所列的序列。
30.一種組合物，所述組合物包括對(duì)一種或多種成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)多核苷酸有特異性的一種或多種寡核苷酸，所述多核苷酸包括反義序列、互補(bǔ)序列、等位基因、同系物、同種型、變體、衍生物、突變體、片段或其組合。
31.如權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述寡核苷酸與如SEQID NO:3至9所列的任一種核苷酸序列相比具有至少約40%序列同一性。
32.如權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述寡核苷酸包括如SEQID NO:3至9所列的核苷酸序列。
33.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中如SEQID NO:3至9所列的寡核苷酸包括一種或多種修飾或取代。
34.如權(quán)利要求33所述的組合物，其中所述一種或多種修飾選自硫代磷酸酯、膦酸甲酯、肽核酸、鎖核酸(LNA)分子及其組合。
35.一種預(yù)防或治療與至少一種成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)多核苷酸和/或至少一種其編碼的產(chǎn)物相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括向患者施用治療有效劑量的結(jié)合所述至少一種成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)多核苷酸的天然反義序列并調(diào)節(jié)所述至少一種成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)多核苷酸的表達(dá)的至少一種反義寡核苷酸；從而預(yù)防或治療與至少一種成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)多核苷酸和/或至少一種其編碼的產(chǎn)物相關(guān)的疾病。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中與至少一種成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)多核苷酸相關(guān)的疾病選自與FGF21的異常功能和/或表達(dá)相關(guān)的疾病或病癥、代謝疾病或病癥(例如糖尿病、肥胖癥、血脂障礙、高血糖癥、高胰島素血癥、高血壓、脂肪性肝炎如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)等)、癌癥、與脂質(zhì)代謝受損相關(guān)的疾病或病癥、與腎功能受損相關(guān)的疾病或病癥、與肝功能受損相關(guān)的疾病或病癥、異常細(xì)胞增殖、血管疾病或病癥(例如冠狀動(dòng)脈疾病、周圍動(dòng)脈疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、腹主動(dòng)脈瘤、血凝塊、深部靜脈血栓形成、靜脈停滯疾病、靜脈炎、靜脈曲張等)、血管發(fā)生、動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病或病癥、與血管形成受損相關(guān)的疾病或病癥、與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)受損相關(guān)的疾病或病癥、與激酶活性受損相關(guān)的疾病或病癥、與至脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取受損相關(guān)的疾病或病癥、與FGF21和FGFR-I或FGFR-2中的一者或兩者之間的相互作用受損相關(guān)的疾病或病癥、與FGFR-I或FGFR-2蛋白的磷酸化受損相關(guān)的疾病或病癥、和細(xì)胞凋亡。
37.一種鑒定和選擇用于體內(nèi)施用的至少一種寡核苷酸的方法，所述方法包括選擇與疾病狀態(tài)相關(guān)的靶多核苷酸；鑒定包括與所選靶多核苷酸或與所選靶多核苷酸的反義的多核苷酸互補(bǔ)的至少五個(gè)連續(xù)核苷酸的至少一種寡核苷酸；測量反義寡核苷酸和所述靶多核苷酸或與所選靶多核苷酸反義的多核苷酸在嚴(yán)格雜交條件下的雜合體的熱熔點(diǎn)；和基于所獲得的信息選擇用于體內(nèi)施用的至少一種寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)的表達(dá)和/或功能的反義寡核苷酸，尤其是通過靶向成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)的天然反義多核苷酸。本發(fā)明還涉及這些反義寡核苷酸的鑒定和它們?cè)谥委熍cFGF21表達(dá)相關(guān)的疾病和病癥中的用途。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102858979SQ201180018360
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2011年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月9日
發(fā)明者J·克拉德, O·霍克瓦舍曼 申請(qǐng)人:庫爾納公司