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一種基于稀土納米材料熒光放大的microRNA檢測方法與流程

文檔序號:11613176閱讀:542來源:國知局
一種基于稀土納米材料熒光放大的microRNA檢測方法與流程

本發(fā)明涉及納米熒光檢測技術(shù)領(lǐng)域,更具體地說是一種基于水溶性稀土熒光標(biāo)記材料的熒光放大,以實(shí)現(xiàn)對microrna的超靈敏檢測方法。



背景技術(shù):

microrna(mirna)是一種長度約為22個核苷酸的非編碼的單鏈小分子rna,具有高度保守性,它們廣泛存在于病毒、植物和高等哺乳動物的細(xì)胞中。研究表明,mirna在動植物的發(fā)育、細(xì)胞生長分化和凋亡、脂肪代謝等生命活動過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。人類疾病特別是腫瘤疾病常伴隨多種mirna表達(dá)量的變化,mirna作為一種新興的疾病標(biāo)志物在腫瘤疾病的診斷、治療、預(yù)后判斷具有重要意義?,F(xiàn)如今許多常規(guī)的核酸檢測技術(shù)如:rna印跡法、微陣列芯片、實(shí)時定量pcr等被應(yīng)用于mirna的檢測。但是由于mirna本身具有生物體內(nèi)含量低、家族序列同源性強(qiáng)、核酸鏈短的特征,使得這些方法往往存在檢測靈敏度不高、重現(xiàn)性不好、檢測特異性不強(qiáng)及輔助探針設(shè)計復(fù)雜等問題。針對于mirna本身的這些特征,許多新型的基于酶放大(rollingcircleamplification滾環(huán)放大,exponentialamplificationreaction指數(shù)放大反應(yīng)等)或者基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的放大技術(shù),被提出并應(yīng)用于mirna的檢測。但是這些技術(shù)手段往往需要工具酶的參與以及復(fù)雜的信號放大設(shè)計,這就要求了特殊的反應(yīng)條件和多步、耗時、復(fù)雜難懂的實(shí)驗(yàn)步驟,這些要求限制了其在復(fù)雜體系中mirna超靈敏檢測方面的推廣和應(yīng)用。因此發(fā)展一種既能特異性識別,又能利用簡便的信號放大技術(shù)實(shí)現(xiàn)低濃度mirna的檢測方法具有重要意義。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足,本發(fā)明的目的是提出一種基于稀土納米材料熒光放大的mirna超靈敏檢測的方法,所述方法是通過簡單、方便的信號放大策略,利用了具有分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)的捕獲探針實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物(待測mirna樣品)的特異性識別,再結(jié)合稀土納米材料熒光放大技術(shù)實(shí)現(xiàn)信號放大。所建立的方法具有很高的靈敏度,而且可用于復(fù)雜體系中mirna的直接檢測。

本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案:

一種基于稀土納米材料熒光放大的mirna檢測方法,所述方法包括以下步驟:

(1)提供捕獲探針,所述捕獲探針為分子信標(biāo)結(jié)構(gòu),序列結(jié)構(gòu)為:5’-自由鏈段1-莖部1-環(huán)部-莖部2-自由鏈段2-3’,所述環(huán)部為能特異性識別目標(biāo)mirna的序列,所述莖部1和莖部2互補(bǔ)形成莖桿結(jié)構(gòu),所述自由鏈段1和自由鏈段2均不與環(huán)部、莖部1和莖部2互補(bǔ);

(2)加入含有待測mirna的樣品;

(3)加入生物素標(biāo)記的檢測探針,所述檢測探針與捕獲探針的莖部2和自由鏈段2互補(bǔ);

(4)加入稀土納米材料標(biāo)記的親和素;或者,先加入親和素,之后再加入稀土納米材料標(biāo)記的生物素;

(5)加入增強(qiáng)液;

(6)采用時間分辨檢測熒光信號。

根據(jù)本發(fā)明,所述步驟(1)中的捕獲探針可以共價偶聯(lián)的方式固定于固相載體上提供,也可以分散于液體中的自由形式提供。為后續(xù)儀器檢測方便,優(yōu)選捕獲探針以共價偶聯(lián)的方式固定于固相載體上。

將捕獲探針共價偶聯(lián)到固相載體上的方法,可采用本領(lǐng)域中已知的各種方法,包括但不限于,通過在捕獲探針5’端連接上化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán),例如氨基、羧基、酰胺基等,經(jīng)由這些基團(tuán)將捕獲探針共價偶聯(lián)到固相載體上。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式中,所述捕獲探針為5’端氨基標(biāo)記的分子信標(biāo)結(jié)構(gòu),通過5’端氨基將其共價偶聯(lián)到固相載體上。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式中,采用ph9.6的碳酸緩沖溶液作為包被液,將5’端氨基標(biāo)記的捕獲探針固定于固相載體上。

如果采用將捕獲探針共價偶聯(lián)到固相載體的方式提供捕獲探針,那么,在將捕獲探針包被到固相載體上之后,優(yōu)選進(jìn)一步用封閉液封閉掉捕獲探針上未反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán),降低后續(xù)檢測中可能出現(xiàn)的假陽性。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式中,所用的封閉液為乙醇胺溶液,例如為用0.05mol/l的碳酸鹽緩沖液配制的0.1%乙醇胺溶液。

所述固相載體可以是檢測領(lǐng)域中常用和已知的各種固相載體,包括但不限于微孔板、磁性微球、金箔、高分子微球等。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式中,所述固相載體為微孔板,例如常用的96孔板。

根據(jù)本發(fā)明,在捕獲探針的5’端設(shè)計自由鏈段1序列,可以使莖部和固相載體有一段距離,減小位阻效應(yīng),降低將捕獲探針結(jié)合到固相載體上的結(jié)合難度。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式中,所述自由鏈段1序列為aagctgacctct。

根據(jù)本發(fā)明,在捕獲探針的3’端設(shè)計自由鏈段2序列,是為了在莖部2序列之外,再提供一段可與檢測探針互補(bǔ)的序列,提高檢測探針與捕獲探針結(jié)合的特異性和穩(wěn)定性;同時控制自由鏈段2序列的長度,防止檢測探針在捕獲探針莖環(huán)結(jié)構(gòu)還未打開時,就結(jié)合到捕獲探針上,導(dǎo)致檢測假陽性的出現(xiàn)。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式中,所述捕獲探針中的自由鏈段2序列為ttttttt。

根據(jù)本發(fā)明,莖部1和莖部2序列中要控制適當(dāng)?shù)腸g含量,以免過高的cg含量使莖環(huán)結(jié)構(gòu)過于穩(wěn)定,目標(biāo)mirna無法將捕獲探針的莖環(huán)打開,造成假陰性;也要避免過低的cg含量使莖環(huán)結(jié)構(gòu)過于松散,造成假陽性。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式中,所述捕獲探針中的莖部1序列為tggaca,莖部2序列為tgtcca。

根據(jù)本發(fā)明,優(yōu)選上述檢測方法用于檢測mirna-21,在這種情況下,所述捕捉探針中的環(huán)部序列為:tcaacatcagtctgataagcta,該序列能特異性識別mirna-21。

根據(jù)本發(fā)明,檢測探針的序列要能與捕獲探針上的莖部2序列和自由鏈段2序列互補(bǔ),這樣能提高檢測探針與捕獲探針結(jié)合的特異性和穩(wěn)定性,降低檢測的假陽性和假陰性。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式中,所述檢測探針的序列為:aaaaaaatggaca。

根據(jù)本發(fā)明,優(yōu)選所述步驟(4)中的稀土納米材料為xyf4納米晶,所述x選自鋰、鈉、鉀等中的一種或多種,所述y選自銪、釤、鋱、鏑中的一種或多種。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式中,所述稀土納米材料為naeuf4納米晶。

稀土納米材料標(biāo)記生物素或親和素的方法可以采用本領(lǐng)域已知的各種方法,包括但不限于脂質(zhì)體包覆法,化學(xué)配位法。

所述脂質(zhì)體包覆法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式中,以naeuf4納米晶脂質(zhì)體包覆法標(biāo)記生物素,包括如下步驟:

1)稱取油溶性naeuf4納米晶和生物素標(biāo)記的磷脂質(zhì)溶于氯仿溶液中,超聲后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑;

2)加入超純水進(jìn)行超聲,經(jīng)過半小時的反應(yīng),離心收集,最后溶于超純水即可。

所述化學(xué)配位法也為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式中,以naeuf4納米晶化學(xué)配位法標(biāo)記生物素,包括如下步驟:

1)稱取油溶性naeuf4納米晶溶于鹽酸乙醇溶液中,超聲,離心收集納米顆粒,再用無水乙醇洗滌,除去納米晶表面的油酸,加入去離子水溶解,得水溶性納米晶;

2)取步驟1)合成的水溶性納米晶,加入生物素和氨水,超聲,用去離子水離心洗滌,最后溶于去離子水中即可。

根據(jù)本發(fā)明,優(yōu)選所述步驟(5)中的增強(qiáng)液含有tritonx-100、萘甲酸三氟丙酮、三正辛基氧膦和水。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式中,所述增強(qiáng)液的組成為:每升增強(qiáng)液中含有1gtritonx-100,26.6mg萘甲酰三氟丙酮,193mg三正辛基氧膦,ph2.3。

根據(jù)本發(fā)明,上述步驟(6)中的時間分辨檢測熒光信號中,所述信號放大的原理是,當(dāng)含有稀土納米材料標(biāo)記的親和素或生物素,與體系中已經(jīng)存在的生物素或親和素,形成親和素-生物素、或者生物素-親和素-生物素復(fù)合物后,加入增強(qiáng)液,使稀土納米材料溶解成稀土離子,并與增強(qiáng)液中的配體形成螯合物,生成新的信號分子,產(chǎn)生分子內(nèi)和分子間能量傳遞,使得熒光信號的強(qiáng)度增強(qiáng)近百萬倍,從而被檢測到。

根據(jù)本發(fā)明,由于mirna存在于病毒、植物和高等哺乳動物的細(xì)胞中,在動植物的發(fā)育、細(xì)胞生長分化和凋亡、脂肪代謝等生命活動過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。因此本發(fā)明檢測mirna的方法,可用于各種用途的mirna檢測,包括非診斷目的和診斷目的的mirna檢測。

在本發(fā)明中,如無特殊說明,所述核酸序列均為5’端到3’端的順序表示。

本發(fā)明的有益效果在于:

本發(fā)明提供了一種基于稀土納米材料熒光放大的mirna超靈敏檢測方法和應(yīng)用,所述檢測方法具有如下優(yōu)點(diǎn):1)采用分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)的捕獲探針可以有效地進(jìn)行特異性識別,對于目標(biāo)mirna的單堿基錯配也具有良好的識別能力;2)不需要各種工具酶以及多步、復(fù)雜難懂的放大步驟;采用稀土納米材料作為標(biāo)記物標(biāo)記生物分子,無需提前做任何處理,在實(shí)驗(yàn)最后加入增強(qiáng)液便可使熒光增強(qiáng)近百萬倍,極大地提高了檢測靈敏度且操作十分簡便;3)由于所述稀土納米材料的性質(zhì)穩(wěn)定、比表面積大、可修飾性強(qiáng)、成本低廉且每個納米顆粒含有數(shù)千個稀土離子,極大提高了稀土離子的標(biāo)記比率,受外源稀土離子的影響小,且不受抗凝劑的影響,適用性更廣。

附圖說明

圖1為本發(fā)明一個優(yōu)選實(shí)施方式中所述的mirna的檢測原理圖。

圖2為實(shí)施例1制備得到的naeuf4納米晶的透射電鏡圖。

圖3為實(shí)施例1制備得到的mirna-21的濃度與熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖4為實(shí)施例2所述的識別mirna-21靶標(biāo)的選擇性的考察結(jié)果。

圖5為實(shí)施例3所述的對于復(fù)雜體系樣品中mirna-21回收率的考察結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員了解,本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于以下實(shí)施例。根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容,本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案所給出的技術(shù)特征和范圍的情況下,對以上所述實(shí)施例做出許多變化和修改都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

以下實(shí)施例中,檢測所述的透射電鏡圖的儀器型號為jem-2010,廠家為jeol。

以下實(shí)施例中,檢測所述熒光信號分子的儀器為熒光酶標(biāo)儀,型號為synergy4,廠家為biotek。

以下實(shí)施例中,pbst洗滌緩沖液的組成為10mm的磷酸鹽緩沖液、150mm的氯化鈉和0.05%(v/v)的吐溫20。

以下實(shí)施例中,pbs緩沖液的組成為:每升緩沖液中含有kcl0.2g,kh2po40.2g,nacl8g,na2hpo4·12h2o3.14g,ph7.4-7.6。

實(shí)施例1

對mirna-21檢測靈敏度的考察

1.naeuf4納米晶脂質(zhì)體包覆法標(biāo)記生物素的制備方法:

1)稱取naeuf4納米晶10mg和生物素標(biāo)記的磷脂質(zhì)20mg溶于5ml氯仿溶劑中,超聲混勻后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑;

2)取步驟1)干燥產(chǎn)物加入4ml超純水進(jìn)行超聲,經(jīng)過半小時的反應(yīng),離心收集,最后溶于0.5ml超純水中即可。

圖2給出了本實(shí)施例制備得到的naeuf4納米晶的透射電鏡圖。

由圖可知,所制得的納米晶尺寸分布均一(粒徑為13.5±1nm),且結(jié)晶性良好。

2.配制增強(qiáng)液

稱取1gtritonx-100,26.6mg萘甲酰三氟丙酮,193mg三正辛基氧膦,加入蒸餾水定容至1l,用稀hcl調(diào)節(jié)ph2.3,備用。

3.實(shí)驗(yàn)所需的探針序列

4.考察naeuf4納米晶熒光放大體系測定mirna-21標(biāo)準(zhǔn)溶液的靈敏度,包括如下步驟:

1)包被:用0.05mol/l的碳酸鹽緩沖液將捕獲探針cp稀釋至100nm,在96孔聚苯乙烯板中,每孔加入100μl,37℃孵育1h,棄去孔內(nèi)液體,用pbst洗滌緩沖液洗3次。

2)封閉:用0.05mol/l的碳酸鹽緩沖液配制0.1%的乙醇胺,每孔加入300μl,37℃孵育1h,去孔內(nèi)液體,用pbst洗滌緩沖液洗3次。

3)加樣:用pbs緩沖液配制含有20u核糖核酸酶抑制劑的10fm-100nmmirna-21標(biāo)準(zhǔn)溶液,使其濃度分別為:0fm,10fm,100fm,1pm,10pm,100pm,1nm,10nm,100nm的標(biāo)準(zhǔn)品,每孔加入100μl的標(biāo)準(zhǔn)溶液,37℃孵育1小時,棄去孔內(nèi)液體,用pbst洗滌緩沖液洗3次。

4)加入檢測探針dp:用pbs緩沖液配制10nm的dp溶液,每孔加入100μl,37℃孵育0.5h,棄去孔內(nèi)液體,用pbst洗滌緩沖液洗3次。

5)加入親和素:用pbs緩沖液配制5μg/ml的親和素溶液,每孔加入100μl,37℃孵育0.5h,棄去孔內(nèi)液體,用pbst洗滌緩沖液洗3次。

6)加入naeuf4納米晶標(biāo)記的生物素:用pbs緩沖液配制10μg/ml的naeuf4納米晶標(biāo)記的生物素,每孔加入100μl,37℃孵育0.5h,棄去孔內(nèi)液體,用pbst洗滌緩沖液洗6次。

7)加增強(qiáng)液:每孔加入200μl增強(qiáng)液,采用時間分辨檢測熒光信號,具體參數(shù)為:激發(fā)波長340nm,發(fā)射波長617nm,延遲時間100μs。

8)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:以mirna-21標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),以每一濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的對應(yīng)的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3給出了本實(shí)施例mirna-21的濃度與熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

由圖可知,在10fm-100pm范圍內(nèi),mirna-21的濃度與熒光強(qiáng)度成線性相關(guān),以空白平均值加3倍sd計,最低檢測限為1.38fm。

實(shí)施例2

對識別mirna-21靶標(biāo)的選擇性的考察

1.實(shí)驗(yàn)所需試劑和儀器與實(shí)施例1相同,實(shí)驗(yàn)所需naeuf4納米晶標(biāo)記的生物素與實(shí)施例1一致。

2.實(shí)驗(yàn)所需的探針序列(所述堿基右上角標(biāo)注有*的,代表為錯配堿基)

3.考察naeuf4納米晶熒光放大體系測定mirna-21及錯配序列的選擇性,包括如下步驟:

1)包被:用0.05mol/l的碳酸鹽緩沖液將捕獲探針cp稀釋至100nm,在96孔聚苯乙烯板中,每孔加入100μl,37℃孵育1h,棄去孔內(nèi)液體,用pbst洗滌緩沖液洗3次。

2)封閉:用0.05mol/l的碳酸鹽緩沖液配制0.1%的乙醇胺,每孔加入300μl,37℃孵育1h,去孔內(nèi)液體,用pbst洗滌緩沖液洗3次。

3)加樣:用pbs緩沖液配制含有20u核糖核酸酶抑制劑的1nm的pm、sm、tm、random標(biāo)準(zhǔn)溶液,每孔加入100μl的標(biāo)準(zhǔn)溶液,37℃孵育1h,棄去孔內(nèi)液體,用pbst洗滌緩沖液洗3次。

4)加入檢測探針dp:用pbs緩沖液配制10nm的dp溶液,每孔加入100μl,37℃孵育0.5h,棄去孔內(nèi)液體,用pbst洗滌緩沖液洗3次。

5)加入親和素:用pbs緩沖液配制5μg/ml的親和素溶液,每孔加入100μl,37℃孵育0.5h,棄去孔內(nèi)液體,用pbst洗滌緩沖液洗3次。

6)加入naeuf4納米晶標(biāo)記的生物素:用pbs緩沖液配制10μg/ml的naeuf4納米晶標(biāo)記的生物素,每孔加入100μl,37℃孵育0.5h,棄去孔內(nèi)液體,用pbst洗滌緩沖液洗6次。

7)加增強(qiáng)液:每孔加入200μl增強(qiáng)液,采用時間分辨檢測熒光信號,具體參數(shù)為:激發(fā)波長340nm,發(fā)射波長617nm,延遲時間100μs。

8)繪制熒光比率(f-f0)/f0柱狀圖,其是以每種靶標(biāo)的名稱為橫坐標(biāo),以每種靶標(biāo)所得的熒光比率為縱坐標(biāo),其中,f是靶標(biāo)熒光測定值,f0是背景熒光值,熒光比率(f-f0)/f0用來反應(yīng)不同靶標(biāo)熒光值和背景值的變化,繪制柱狀圖。

圖4給出了本實(shí)施例所述的識別mirna-21靶標(biāo)的選擇性的考察結(jié)果。

由圖4可知,單堿基錯配(sm)和三堿基錯配(tm)與mirna-21(pm)的熒光比率相比,二者的熒光比率分別下降到48%和20%,而隨機(jī)序列(random)的熒光比率接近于零,說明隨機(jī)序列(random)無法有效地將捕獲探針打開;上述結(jié)果也證明了本實(shí)施例所述的檢測體系具有良好的選擇性。

實(shí)施例3

本實(shí)施例所述的方法對于復(fù)雜體系樣品中mirna-21回收率的考察

1.實(shí)驗(yàn)所需序列和儀器與實(shí)施例1相同,實(shí)驗(yàn)所需naeuf4納米晶標(biāo)記的生物素與實(shí)施例1一致。

2.復(fù)雜體系實(shí)驗(yàn)所使用的模型基質(zhì)為10%胎牛血清。

3.實(shí)驗(yàn)所使用的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)方法一致。

4.考察naeuf4納米晶熒光放大體系測定復(fù)雜體系樣本中mirna-21的回收率,包括如下步驟:

1)包被:用0.05mol/l的碳酸鹽緩沖液將捕獲探針cp稀釋至100nm,在96孔聚苯乙烯板中,每孔加入100μl,37℃孵育1h,棄去孔內(nèi)液體,用pbst洗滌緩沖液洗3次。

2)封閉:用0.05mol/l的碳酸鹽緩沖液配制0.1%的乙醇胺,每孔加入300μl,37℃孵育1h,去孔內(nèi)液體,用pbst洗滌緩沖液洗3次。

3)加樣:用10%胎牛血清緩沖液配制濃度由低到高,含有20u核糖核酸酶抑制劑的100fm,1pm,10pm的mirna-21模擬血清溶液,每孔加入100μl的模擬血清溶液,37℃孵育1小時,棄去孔內(nèi)液體,用pbst洗滌緩沖液洗3次。

4)加入檢測探針dp:用pbs緩沖液配制10nm的dp溶液,每孔加入100μl,37℃孵育0.5h,棄去孔內(nèi)液體,用pbst洗滌緩沖液洗3次。

5)加入親和素:用pbs緩沖液配制5μg/ml的親和素溶液,每孔加入100μl,37℃孵育0.5h,棄去孔內(nèi)液體,用pbst洗滌緩沖液洗3次。

6)加入naeuf4納米晶標(biāo)記的生物素:用pbs緩沖液配制10μg/ml的naeuf4納米晶標(biāo)記的生物素,每孔加入100μl,37℃孵育0.5h,棄去孔內(nèi)液體,用pbst洗滌緩沖液洗6次。

7)加增強(qiáng)液:每孔加入200μl增強(qiáng)液,采用時間分辨檢測熒光信號,具體參數(shù)為:激發(fā)波長340nm,發(fā)射波長617nm,延遲時間100μs。

8)測定回收率:以實(shí)施例1所得的工作曲線為標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算血清實(shí)驗(yàn)所對應(yīng)的回收率。

所述計算方法為:將已知濃度為c0的血清樣品的測定熒光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合公式求出測量濃度c,將濃度c代入公式c/c0×100%,即得到回收率。

圖5給出了實(shí)施例3所述的對于復(fù)雜體系樣品中mirna-21回收率的考察結(jié)果。

經(jīng)計算可知,所述回收率在90.2-108%之間,變異系數(shù)小于10.1%,結(jié)果表明,本實(shí)施例檢測體系可以有效地屏蔽復(fù)雜體系的背景干擾,檢測方法具有良好的精密度和重現(xiàn)性。

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