【
技術(shù)領(lǐng)域：
】本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增的精度管理方法、精度管理用試劑及其試劑盒。
背景技術(shù)：
：在核酸擴(kuò)增法中，有由聚合酶的擴(kuò)增錯(cuò)誤、由混雜物質(zhì)等的擴(kuò)增抑制、樣品調(diào)制時(shí)的誤操作等，由各種要因得不到適宜的結(jié)果的情況。因此，有對(duì)核酸擴(kuò)增適宜地進(jìn)行與否進(jìn)行精度管理的必要。在appl.environ.mocrobiol.2001.67,3985-3993中公開(kāi)有，有與目標(biāo)核酸結(jié)合相同的引物組的區(qū)域，與檢測(cè)目標(biāo)核酸的檢測(cè)用探針有結(jié)合不同的探針的區(qū)域的，對(duì)照多核苷酸。通過(guò)用檢測(cè)目標(biāo)核酸的檢測(cè)用探針和檢測(cè)對(duì)照多核苷酸的探針標(biāo)記不同的熒光染料，可在相同反應(yīng)槽中同時(shí)區(qū)別檢測(cè)各自的擴(kuò)增產(chǎn)物(第3986頁(yè)、右欄“primes,probes,andpcrassay”的項(xiàng)、及第3990頁(yè)、圖2)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：【發(fā)明要解決的技術(shù)課題】近年，作為檢測(cè)樣品中的成為目標(biāo)的核酸分子(以下也稱(chēng)為“目標(biāo)核酸”)的方法，開(kāi)發(fā)有數(shù)字核酸檢測(cè)。具體而言，在微孔或液滴等的隔區(qū)化的區(qū)域(以下也簡(jiǎn)稱(chēng)為“隔區(qū)”)中收容各1分子目標(biāo)核酸，通過(guò)在各隔區(qū)中進(jìn)行核酸擴(kuò)增，高靈敏度地檢測(cè)核酸分子的方法。非專(zhuān)利文獻(xiàn)1中記載的方法被認(rèn)為也能在數(shù)字核酸檢測(cè)法中應(yīng)用，但為了在目標(biāo)核酸和對(duì)照多核苷酸中使用不同的探針，難以評(píng)價(jià)用于檢測(cè)目標(biāo)核酸的探針正常發(fā)揮功能與否。本發(fā)明人完成了在數(shù)字核酸檢測(cè)中適宜地使用的精度管理方法。即，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在數(shù)字核酸檢測(cè)中，在能結(jié)合與目標(biāo)核酸相同的引物組的區(qū)域、能結(jié)合上述引物組的區(qū)域間，通過(guò)使用有與目標(biāo)核酸不同的個(gè)數(shù)的寡核苷酸，可對(duì)能結(jié)合目標(biāo)核酸檢測(cè)用探針的區(qū)域進(jìn)行精度管理?！窘鉀Q課題的技術(shù)方案】本發(fā)明的第1實(shí)施方式是核酸擴(kuò)增的精度管理方法，其包括核酸檢測(cè)工序和判斷工序。上述核酸檢測(cè)工序包括：調(diào)制核酸樣品的工序，所述核酸樣品含目標(biāo)核酸和精度管理用多核苷酸、調(diào)制含上述目標(biāo)核酸一分子的隔區(qū)和含上述精度管理用多核苷酸一分子的隔區(qū)的工序、在上述各隔區(qū)中進(jìn)行上述核酸樣品中所含的上述目標(biāo)核酸或上述精度管理用多核苷酸的核酸擴(kuò)增，使用檢測(cè)用探針檢測(cè)上述檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)的工序。在判斷工序中，基于上述信號(hào)檢測(cè)工序的結(jié)果，判斷上述核酸檢測(cè)工序適宜或不適宜。含上述目標(biāo)核酸檢測(cè)序列。上述精度管理用多核苷酸是以下的(1)、(2)或(3)。(1)含以下第1區(qū)域、第2區(qū)域及第3區(qū)域的單鏈多核苷酸：上述第1區(qū)域含能結(jié)合目標(biāo)核酸擴(kuò)增用的第1引物的序列；上述第2區(qū)域含與能結(jié)合目標(biāo)核酸擴(kuò)增用的第2引物的序列互補(bǔ)的序列；及上述第3區(qū)域含檢測(cè)序列及與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的任一方或兩方、(2)含與上述(1)的序列互補(bǔ)的序列的單鏈多核苷酸、(3)含上述(1)的多核苷酸和上述(2)的多核苷酸的雙鏈多核苷酸上述檢測(cè)用探針含與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列。上述(1)的精度管理用多核苷酸中的檢測(cè)序列和與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的合計(jì)數(shù)與上述目標(biāo)核酸中的檢測(cè)序列的數(shù)不同?！景l(fā)明效果】由本發(fā)明提供數(shù)字核酸檢測(cè)法中的精度管理方法?！靖綀D說(shuō)明】【圖1】顯示實(shí)施方式1涉及的核酸檢測(cè)工序的模式圖?！緢D2】顯示實(shí)施方式2涉及的核酸擴(kuò)增的種類(lèi)(b)及檢測(cè)信號(hào)的2d散點(diǎn)圖(a)的模式圖?！緢D3】顯示實(shí)施方式3涉及的核酸檢測(cè)工序的模式圖?！緢D4】顯示實(shí)施方式4涉及的核酸檢測(cè)工序的模式圖?！緢D5】顯示人kras基因的核酸擴(kuò)增中的例示的精度管理方法的結(jié)果的2d散點(diǎn)圖。2d散點(diǎn)圖，在x軸顯示有精度管理用多核苷酸(wt,n＝5)(+)的情況(a)及無(wú)(-)的情況(b)的反映變異型(mut)的kras基因來(lái)源的擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)，在y軸顯示反映野生型(wt)的kras基因來(lái)源的擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)。【圖6】在x軸顯示有精度管理用多核苷酸(mut,n＝5)(+)的情況(a)及無(wú)(-)的情況(b)的反映變異型(mut)的kras基因來(lái)源的擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)，在y軸顯示反映野生型(wt)的kras基因來(lái)源的擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)的2d散點(diǎn)圖?！緢D7】顯示向核酸擴(kuò)增反應(yīng)液中添加的精度管理用多核苷酸(a：wt,n＝5、b：mut,n＝5)的拷貝數(shù)和檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度的相關(guān)關(guān)系的分布圖?！緢D8】顯示精度管理用多核苷酸中的檢測(cè)序列的數(shù)和檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度的相關(guān)關(guān)系的箱形圖?！緢D9】在x軸顯示有精度管理用多核苷酸(wt,n＝6)(+)的情況(a)及無(wú)(-)的情況(b)的反映變異型(mut)的kras基因來(lái)源的擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)，在y軸顯示反映野生型(wt)的kras基因來(lái)源的擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)的2d散點(diǎn)圖?！緢D10】顯示1個(gè)實(shí)施方式涉及的精度管理用試劑盒的模式圖。【圖11】顯示1個(gè)實(shí)施方式涉及的目標(biāo)核酸(a)及精度管理用多核苷酸(b)的模式圖?！緦?shí)施方式】[精度管理方法]本發(fā)明的第1實(shí)施方式涉及包括核酸檢測(cè)工序和判斷工序的核酸擴(kuò)增的精度管理方法。在第1實(shí)施方式的核酸檢測(cè)工序中，調(diào)制含目標(biāo)核酸和精度管理用多核苷酸的核酸樣品。在1個(gè)實(shí)施方式中，核酸樣品調(diào)制工序通過(guò)將含目標(biāo)核酸的樣品和含精度管理用多核苷酸的樣品混合，調(diào)制核酸樣品。在本說(shuō)明書(shū)中，“核酸”是指dna或rna。核酸只要可核酸擴(kuò)增，就不特別限定，可一部分或全部是核苷酸衍生物。作為核苷酸衍生物，可例示lockednucleicacid(lna),bridgednucleicacid(bna)等?！昂怂針悠贰敝灰怂岬臉悠?，就不特別限定。作為核酸樣品，例如，可例示血液、淋巴細(xì)胞等的生物體樣品、尿、便等的排泄物、河川水、海水、土壤等的環(huán)境樣品等。核酸樣品由于通常是液狀，在樣品不是液狀時(shí)通過(guò)進(jìn)行適宜預(yù)處理，優(yōu)選作為液狀。其中，“液狀”的樣品不限于溶質(zhì)完全地溶解的溶液，也含懸浮了細(xì)胞或細(xì)胞的碎片等的微細(xì)的固體物的懸浮液、溶膠等。預(yù)處理的方法選擇適宜公知的方法。例如，樣品是從生物體采集的組織時(shí)，通過(guò)在預(yù)處理液中破碎組織中的細(xì)胞、用離心分離等分離－除去破碎物，可調(diào)制核酸樣品。在本說(shuō)明書(shū)中，“目標(biāo)核酸”是有興趣對(duì)象的序列(以下也稱(chēng)為“檢測(cè)序列”)。目標(biāo)核酸不僅是核酸樣品中所含的核酸，也含擴(kuò)增核酸樣品中的dna或rna的擴(kuò)增產(chǎn)物(擴(kuò)增子)或，從核酸樣品中的rna由逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的cdna等。目標(biāo)核酸通常是生物來(lái)源或病毒來(lái)源的。本發(fā)明涉及的精度管理用多核苷酸可使用與可擴(kuò)增含目標(biāo)核酸中的檢測(cè)序列的區(qū)域的引物(以下也稱(chēng)為“目標(biāo)核酸擴(kuò)增用引物”)相同的引物擴(kuò)增。目標(biāo)核酸擴(kuò)增用引物組含第1目標(biāo)核酸擴(kuò)增用引物(以下也稱(chēng)為“第1引物”)及第2目標(biāo)核酸擴(kuò)增用引物(以下也稱(chēng)為“第2引物”)。在精度管理用多核苷酸中，將含能結(jié)合第1引物的序列的區(qū)域稱(chēng)為第1區(qū)域，將含與能結(jié)合第2引物的序列互補(bǔ)的序列的區(qū)域稱(chēng)為第2區(qū)域。在由上述目標(biāo)核酸擴(kuò)增用引物擴(kuò)增的精度管理用多核苷酸的區(qū)域中，含檢測(cè)序列及與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的任一方或其兩方。在精度管理用多核苷酸中，將含檢測(cè)序列及與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的任一方或其兩方的區(qū)域稱(chēng)為第3區(qū)域。精度管理用多核苷酸的第3區(qū)域中存在的檢測(cè)序列和與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的合計(jì)數(shù)與由上述目標(biāo)核酸擴(kuò)增用引物擴(kuò)增的上述目標(biāo)核酸的區(qū)域中的檢測(cè)序列的數(shù)不同。由此，與精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的檢測(cè)用探針的數(shù)和與目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的檢測(cè)用探針的數(shù)變得不同。例如，含精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的隔區(qū)或從珠發(fā)生的檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)的強(qiáng)度與含目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的隔區(qū)或從珠發(fā)生的檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)強(qiáng)度變得不同?？蓞^(qū)別含精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的隔區(qū)或珠和含目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的隔區(qū)或珠。當(dāng)作為含上述第1區(qū)域、第2區(qū)域及第3區(qū)域的單鏈多核苷酸的精度管理用多核苷酸中的檢測(cè)序列和與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的合計(jì)數(shù)比目標(biāo)核酸中的檢測(cè)序列的數(shù)多時(shí)，含精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的隔區(qū)或珠發(fā)生比含目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的隔區(qū)或珠強(qiáng)的信號(hào)。當(dāng)目標(biāo)核酸中的檢測(cè)序列的數(shù)比上述精度管理用多核苷酸中的檢測(cè)序列和與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的合計(jì)數(shù)更多時(shí)，含目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的隔區(qū)或珠發(fā)生比含精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的隔區(qū)或珠強(qiáng)的信號(hào)。以下，“檢測(cè)序列和與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的合計(jì)數(shù)”是指作為含第1區(qū)域、第2區(qū)域及第3區(qū)域的單鏈多核苷酸的精度管理用多核苷酸中的檢測(cè)序列和與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的合計(jì)數(shù)。精度管理用多核苷酸中的檢測(cè)序列和與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的合計(jì)數(shù)不限定，但優(yōu)選為比目標(biāo)核酸中的檢測(cè)序列的數(shù)多至少1個(gè)。通常，由于目標(biāo)核酸中的檢測(cè)序列的數(shù)是1，精度管理用多核苷酸中的檢測(cè)序列和與檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的合計(jì)數(shù)可設(shè)定為2以上。精度管理用多核苷酸中的檢測(cè)序列和與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的合計(jì)數(shù)不限定，但可為20個(gè)以下，10個(gè)以下，優(yōu)選為6個(gè)以下，也可為例如1個(gè)～10個(gè)、2個(gè)～10個(gè)、2個(gè)～6個(gè)。精度管理用多核苷酸不限定，但含至少2個(gè)檢測(cè)序列。精度管理用多核苷酸可為單鏈，也可為雙鏈。單鏈多核苷酸有容易制造，可廉價(jià)并且高純度地制造的益處。雙鏈多核苷酸可顯示比單鏈多核苷酸物理上穩(wěn)定的傾向。本發(fā)明涉及的精度管理用多核苷酸可根據(jù)目的以單鏈形式提供，也可以雙鏈形式提供。精度管理用多核苷酸的鏈長(zhǎng)不限定，但從調(diào)制的容易的觀點(diǎn)來(lái)看，可為1000bp以下，500bp以下，200bp以下。在1個(gè)實(shí)施方式中，精度管理用多核苷酸的鏈長(zhǎng)是50bp以上200bp以下，80bp以上170bp以下，更優(yōu)選為90bp以上160bp以下。精度管理用多核苷酸的鏈長(zhǎng)和目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)的差，例如，優(yōu)選為在核酸擴(kuò)增中有同等的擴(kuò)增效率的范圍。在1個(gè)實(shí)施方式中，精度管理用多核苷酸在第3區(qū)域的上游含第1間隔子序列，在第3區(qū)域的下游含第2間隔子序列。在1個(gè)實(shí)施方式中，上述第1間隔子序列和上述第2間隔子序列是互相不同的序列，上述第1間隔子序列和上述第2間隔子序列不互補(bǔ)。其中，“第1間隔子序列和第2間隔子序列互相不同”是指與一方的序列完全地互補(bǔ)的序列在嚴(yán)格的條件下不與另一方的序列雜交。另外，“第1間隔子序列和第2間隔子序列不互補(bǔ)”是指這些序列不在嚴(yán)格的條件下雜交。當(dāng)精度管理用多核苷酸中的檢測(cè)序列和與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的合計(jì)數(shù)是2個(gè)以上時(shí)，精度管理用多核苷酸，例如在1個(gè)檢測(cè)序列和其他檢測(cè)序列之間，含進(jìn)一步的間隔子序列?！斑M(jìn)一步的間隔子序列”是與上述第1間隔子序列及上述第2間隔子序列各自不同的序列，上述第1間隔子序列及上述第2間隔子序列的各不互補(bǔ)。其中，進(jìn)一步的關(guān)于間隔子序列的“序列互相不同的”及“序列不互補(bǔ)的”是與在上述的第1間隔子序列及第2間隔子序列中言及的“序列互相不同的”及“序列不互補(bǔ)的”同意義。進(jìn)一步的間隔子序列的數(shù)可隨精度管理用多核苷酸的第3區(qū)域中存在的檢測(cè)序列及與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的合計(jì)數(shù)增減。關(guān)于上述的“進(jìn)一步的間隔子序列”的“序列互相不同”及“序列不互補(bǔ)”也適用于進(jìn)一步的間隔子序列之間。各間隔子序列是相同或互補(bǔ)時(shí)，特別是，在核酸擴(kuò)增反應(yīng)的后半有間隔子序列與間隔子序列的互補(bǔ)鏈的雜交，或間隔子序列之間的雜交發(fā)生的可能性。為了降低此可能性，優(yōu)選第1間隔子序列和第2間隔子序列互相不同，并且第1間隔子序列和第2間隔子序列不互補(bǔ)。對(duì)于進(jìn)一步的間隔子序列也同樣。在1個(gè)實(shí)施方式中，上述間隔子序列的長(zhǎng)度可為，例如，1bp以上20bp以下，1bp以上10bp以下，2bp以上10bp以下，3bp以上10bp以下，或者4bp以上10bp以下。為例示目的，1個(gè)實(shí)施方式涉及的精度管理用多核苷酸及目標(biāo)核酸的模式圖示于圖11。圖11(a)顯示，擴(kuò)增區(qū)域中的檢測(cè)序列的數(shù)是1的目標(biāo)核酸。圖11(b)顯示雙鏈的精度管理用多核苷酸，上述精度管理用多核苷酸中的檢測(cè)序列和與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的合計(jì)數(shù)是4。具體而言，上述精度管理用多核苷酸由含有含能結(jié)合第1引物的序列的第1區(qū)域；含與能結(jié)合第2引物的序列互補(bǔ)的序列的第2區(qū)域；及含2個(gè)檢測(cè)序列、含2個(gè)與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的第3區(qū)域的多核苷酸和含與上述多核苷酸的序列互補(bǔ)的序列的多核苷酸構(gòu)成。上述第3區(qū)域在第3區(qū)域的上游含第1間隔子序列，在第3區(qū)域的下游含第2間隔子序列。由于第3區(qū)域中的檢測(cè)序列和與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的合計(jì)數(shù)是2以上，在檢測(cè)序列之間、在檢測(cè)序列和與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列之間、在與檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列們之間含進(jìn)一步的間隔子序列。在本說(shuō)明書(shū)中，“雜交(hybridize)”或“雜交(hybridization)”是指堿基由氫鍵形成堿基對(duì)，形成雙鏈的核酸分子。檢測(cè)用探針和目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交，在序列和與其互補(bǔ)的序列之間有不形成堿基對(duì)的錯(cuò)配時(shí)，以抑制或防止檢測(cè)用探針與具有有錯(cuò)配的序列的核酸的雙鏈形成的程度在嚴(yán)格的條件下進(jìn)行。在本說(shuō)明書(shū)中，“嚴(yán)格的條件”是指進(jìn)行多核苷酸的雜交時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員一般使用的條件。嚴(yán)格的條件是某一單鏈多核苷酸和與所述單鏈多核苷酸有一定的互補(bǔ)性的別的單鏈多核苷酸雜交，基本上不與無(wú)互補(bǔ)性的單鏈多核苷酸雜交的條件。已知雜交時(shí)的嚴(yán)格度與溫度、鹽濃度、多核苷酸的鏈長(zhǎng)、多核苷酸的gc含量、雜交緩沖液中的離液劑的濃度等相關(guān)。作為嚴(yán)格的條件，例如，參考sambrook,j.etal.(1998)molecularcloning：alaboratorymanual(2nded.),coldspringharborlaboratorypress,newyork中記載的條件，本領(lǐng)域技術(shù)人員可適宜設(shè)定。在核酸檢測(cè)工序中，在后述的隔區(qū)調(diào)制工序之前，也可進(jìn)行樣品中的核酸的擴(kuò)增(以下，此工序也稱(chēng)為“預(yù)擴(kuò)增工序”)。在樣品中的目標(biāo)核酸是低濃度時(shí)等，通過(guò)在隔區(qū)調(diào)制工序之前擴(kuò)增目標(biāo)核酸，目標(biāo)核酸的檢測(cè)可變得容易。預(yù)擴(kuò)增工序中的核酸擴(kuò)增的方法不特別限定。例如，可例示polymerasechainreaction(pcr)法、rt-pcr法、nucleicacidsequencebasedamplification(nasba)法、transcription-mediatedamplification(tma)法等。預(yù)擴(kuò)增工序可在樣品調(diào)制工序前及/或樣品調(diào)制工序后進(jìn)行。當(dāng)預(yù)擴(kuò)增工序在樣品調(diào)制工序后進(jìn)行時(shí)，也由預(yù)擴(kuò)增擴(kuò)增了精度管理用多核苷酸。在第1實(shí)施方式的核酸檢測(cè)工序中，進(jìn)行隔區(qū)調(diào)制工序。“隔區(qū)”，例如，可例示基板上的微孔或油相中的水性液滴等。具體而言，例示使用美國(guó)專(zhuān)利7842457號(hào)說(shuō)明書(shū)或美國(guó)專(zhuān)利8048627號(hào)說(shuō)明書(shū)中記載的方法調(diào)制的隔區(qū)。另外，也可為使用quantstudio(商標(biāo))3d數(shù)字pcr系統(tǒng)(thermofisherscientific公司)、q×200(商標(biāo))dropletdigital(商標(biāo))pcr解析系統(tǒng)(bio-rad公司)、biomark(商標(biāo))hdmx/hx系統(tǒng)(fluidigm公司)、raindrop系統(tǒng)(raindance公司)等市售的數(shù)字pcr裝置調(diào)制的隔區(qū)。通常使用比目標(biāo)核酸或精度管理用多核苷酸的分子數(shù)大多數(shù)的隔區(qū)。由此，調(diào)制多個(gè)理論上每1隔區(qū)僅含一分子目標(biāo)核酸或精度管理用多核苷酸的隔區(qū)。再者，目標(biāo)核酸及精度管理用多核苷酸中的哪個(gè)都不含的隔區(qū)也調(diào)制多個(gè)。各隔區(qū)含有對(duì)于后述的核酸擴(kuò)增必要的試劑。此試劑能由本領(lǐng)域技術(shù)人員適宜選擇通常含核酸擴(kuò)增用的引物、dntps(datp、dctp、dgtp、及dttp或dutp)、聚合酶、緩沖劑等。引物也可固定在基板或珠等的固相載體上。在第1實(shí)施方式的核酸檢測(cè)工序中，在各隔區(qū)中進(jìn)行核酸樣品中所含的核酸的核酸擴(kuò)增。在隔區(qū)中存在目標(biāo)核酸時(shí)，生成目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。在隔區(qū)中存在精度管理用多核苷酸時(shí)，生成精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。在該隔區(qū)內(nèi)生成該擴(kuò)增產(chǎn)物(本說(shuō)明書(shū)中，也稱(chēng)為“數(shù)字核酸擴(kuò)增”)。核酸擴(kuò)增的方法不限定，但可舉出pcr法、rt-pcr法、nasba法、tma法。在1個(gè)實(shí)施方式中，核酸擴(kuò)增法是pcr。在核酸一分子水平的pcr也稱(chēng)為數(shù)字pcr。作為數(shù)字pcr，可為例如，作為上述隔區(qū)使用液滴(droplets)的乳液pcr(以下也稱(chēng)為“液滴型的數(shù)字pcr”)、或者使用反應(yīng)孔的數(shù)字pcr(以下也稱(chēng)為“孔型的數(shù)字pcr”)。pcr可進(jìn)行例如(1)熱變性、(2)退火、(3)延伸的3步驟，也可以(2)在相同的溫度條件下進(jìn)行退火或雜交和(3)延伸，(1)熱變性、(2’)退火和延伸的2步驟進(jìn)行。各工序的條件適宜設(shè)定。各步驟的溫度變化，例如，可使用veriti熱循環(huán)儀(appliedbiosystems公司)等的熱循環(huán)儀自動(dòng)控制。在第1實(shí)施方式的核酸檢測(cè)工序中，進(jìn)行使用檢測(cè)用探針的信號(hào)檢測(cè)工序。在1個(gè)實(shí)施方式涉及的信號(hào)檢測(cè)工序中，首先檢測(cè)用探針和擴(kuò)增產(chǎn)物在嚴(yán)格的條件下雜交。在檢測(cè)到顯示檢測(cè)序列的存在的信號(hào)時(shí)判斷為有含檢測(cè)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。在檢測(cè)不到顯示檢測(cè)序列的存在的信號(hào)時(shí)判斷為無(wú)含檢測(cè)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。“檢測(cè)用探針”包括含與檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的寡核苷酸。也可使用多種檢測(cè)用探針。例如，在分析目標(biāo)序列的核苷酸的有無(wú)變異時(shí)，可使用與變異型的序列雜交的檢測(cè)用探針(以下也稱(chēng)為“變異型檢測(cè)用探針”)和與野生型的序列雜交的檢測(cè)用探針(以下也稱(chēng)為“野生型檢測(cè)用探針”)。這些檢測(cè)用探針發(fā)生互相不同的種類(lèi)的信號(hào)。在一例中，變異型檢測(cè)用探針引發(fā)的熒光波長(zhǎng)和野生型檢測(cè)用探針引發(fā)的熒光波長(zhǎng)不同。通過(guò)何波長(zhǎng)以何程度被檢測(cè)，可分析目標(biāo)序列的有無(wú)變異。在本發(fā)明中使用的檢測(cè)用探針可為預(yù)先用標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的寡核苷酸，或者也可為非標(biāo)記的寡核苷酸。從檢測(cè)靈敏度的觀點(diǎn)來(lái)看，優(yōu)選使用標(biāo)記的寡核苷酸。作為標(biāo)記物質(zhì)，可例示熒光物質(zhì)、酶、半抗原等。在本說(shuō)明書(shū)中，預(yù)先標(biāo)記化的檢測(cè)用探針也稱(chēng)為“標(biāo)記化檢測(cè)用探針”。作為標(biāo)記物質(zhì)使用熒光物質(zhì)時(shí)，作為信號(hào)可檢測(cè)到熒光。作為熒光物質(zhì)，可舉出熒光素、若丹明、德克薩斯紅、四甲基若丹明、羧基若丹明、藻紅蛋白、6-fam(商標(biāo))、cy(注冊(cè)商標(biāo))3、cy(注冊(cè)商標(biāo))5、alexafluor(注冊(cè)商標(biāo))的系列等。作為標(biāo)記物質(zhì)使用酶時(shí)，使之與所述酶的底物反應(yīng)，通過(guò)生成發(fā)生發(fā)光等的信號(hào)的反應(yīng)產(chǎn)物，可檢測(cè)到信號(hào)。作為標(biāo)記物質(zhì)使用半抗原時(shí)，經(jīng)特異性地結(jié)合于所述半抗原的物質(zhì)使酶或熒光物質(zhì)結(jié)合于檢測(cè)用探針。由此，可檢測(cè)到熒光或發(fā)光等的信號(hào)。再者，作為特異性地結(jié)合于半抗原的物質(zhì)，可舉出抗半抗原抗體。另外，作為半抗原使用生物素時(shí)可使用親和素類(lèi)(親和素、鏈霉親和素等)。由于認(rèn)為對(duì)于標(biāo)記化檢測(cè)用探針和含檢測(cè)序列的核酸的雜交的標(biāo)記物質(zhì)的影響(例如立體障礙)小，標(biāo)記化檢測(cè)用探針中的標(biāo)記物質(zhì)優(yōu)選在其5’末端及/或3’末端標(biāo)記化(修飾)。檢測(cè)用探針可含追加到與檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的5’末端及/或3’末端的序列。標(biāo)記化檢測(cè)用探針含追加到與檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的5’末端及/或3’末端的序列，其5’末端及/或3’末端也可被標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記化。在這樣的標(biāo)記化檢測(cè)用探針中，認(rèn)為與不含追加的序列而其5’末端及/或3’末端用標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記化的標(biāo)記化檢測(cè)用探針相比，標(biāo)記物質(zhì)對(duì)標(biāo)記化檢測(cè)用探針和含檢測(cè)序列的核酸的雜交的影響更得變小。上述追加的序列可為標(biāo)記化檢測(cè)用探針與含檢測(cè)序列的核酸雜交時(shí)面對(duì)的序列，和其一部分或全部是不形成堿基對(duì)的非互補(bǔ)的序列，也可為其全部是形成堿基對(duì)的互補(bǔ)的序列。在1個(gè)實(shí)施方式中，標(biāo)記化檢測(cè)用探針的5’末端由標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記化。在別的實(shí)施方式中，檢測(cè)用探針是非標(biāo)記的寡核苷酸。使用非標(biāo)記的寡核苷酸時(shí)，可通過(guò)使用嵌入劑等進(jìn)行熒光物質(zhì)信號(hào)檢測(cè)。在其他實(shí)施方式中，作為標(biāo)記物質(zhì)，也可使用熒光物質(zhì)和猝滅劑物質(zhì)的組合。使用這樣2種標(biāo)記物質(zhì)時(shí)，例如，可在檢測(cè)用探針的5’末端標(biāo)記化熒光物質(zhì)及猝滅劑物質(zhì)的任一方，在其3’末端標(biāo)記化另一種標(biāo)記物質(zhì)。作為用2種標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記化的檢測(cè)用探針，例如，可舉出taqman(商標(biāo))探針、分子信標(biāo)等。這些探針是公知的，在多種刊物、專(zhuān)利文獻(xiàn)及其他文獻(xiàn)中有記載。例如，對(duì)于taqman(商標(biāo))探針，可參照例如美國(guó)專(zhuān)利第5538848號(hào)，對(duì)于分子信標(biāo)，可參照例如美國(guó)專(zhuān)利第5925517號(hào)，這些公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本說(shuō)明書(shū)中。在本說(shuō)明書(shū)中，“猝滅劑物質(zhì)”是指有降低或消光熒光的作用的物質(zhì)。檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)的檢測(cè)不限定，但由對(duì)于檢測(cè)來(lái)自可多數(shù)(例如，數(shù)千萬(wàn)個(gè))存在的隔區(qū)或珠(參照后述的實(shí)施方式1)的信號(hào)適宜的檢測(cè)器實(shí)施。作為檢測(cè)器不限定，但可使用顯微鏡、流式細(xì)胞儀、像傳感器等?！傲魇郊?xì)胞儀”是向流動(dòng)池中的粒子(例如，珠)或隔區(qū)(例如，液滴)照射激發(fā)光，通過(guò)取得從每個(gè)粒子或隔區(qū)發(fā)出的熒光等的光學(xué)信息，可對(duì)粒子進(jìn)行計(jì)數(shù)的裝置。流式細(xì)胞儀可在短時(shí)間內(nèi)測(cè)定多數(shù)的粒子或隔區(qū)，從而優(yōu)選。使用顯微鏡或像傳感器時(shí)，可對(duì)視野攝像，使用攝像的數(shù)據(jù)檢測(cè)每種珠或隔區(qū)。使用珠時(shí)，珠可靜止，也可流動(dòng)。根據(jù)信號(hào)的種類(lèi)，可使用熒光顯微鏡等。在維持隔區(qū)調(diào)制工序中調(diào)制的隔區(qū)的情況下進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)時(shí)，在隔區(qū)調(diào)制工序或其之前的工序中檢測(cè)用探針被添加到反應(yīng)系統(tǒng)中。一方面，在向珠等固定化擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，也可在維持隔區(qū)的情況下進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)，可在信號(hào)檢測(cè)前從隔區(qū)取出珠而分散到水性溶劑中。信號(hào)檢測(cè)前從隔區(qū)取出珠的方法不特別限定。例如，將油相中的水性液滴作為隔區(qū)時(shí)，可除去油相而將液相分散于水性溶劑中。另外，在將含珠的孔作為隔區(qū)時(shí)，可清洗各孔而取出各孔中收容的珠，分散到水性溶劑中。在從隔區(qū)取出珠時(shí)，可在隔區(qū)調(diào)制工序中將檢測(cè)用探針添加到反應(yīng)系統(tǒng)中，也可在取出珠之后使檢測(cè)用探針雜交于擴(kuò)增產(chǎn)物。在第1實(shí)施方式的判斷工序中，基于信號(hào)檢測(cè)工序的結(jié)果，判斷上述核酸檢測(cè)工序適宜或不適宜。其中，對(duì)于從隔區(qū)發(fā)生信號(hào)時(shí)的例進(jìn)行說(shuō)明。在判斷工序中，首先判斷各隔區(qū)是生成核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的隔區(qū)與否。檢測(cè)到信號(hào)的隔區(qū)(陽(yáng)性隔區(qū))判斷為生成核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的隔區(qū)，檢測(cè)不到信號(hào)的隔區(qū)(陰性隔區(qū))判斷為未生成核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的隔區(qū)。在陽(yáng)性判斷時(shí)，優(yōu)選比較指定的閾值和從隔區(qū)檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度(陽(yáng)性判斷中使用的閾值也稱(chēng)為“第1閾值”)?？椎鹊墓滔噍d體有時(shí)有其自體原本信號(hào)(例如自身熒光)。例如，當(dāng)孔含珠，其珠自體有自身熒光時(shí)，作為信號(hào)從孔檢測(cè)到微弱的熒光。為了將這樣的隔區(qū)判斷為陰性隔區(qū)，使用上述的第1閾值。由于目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物引發(fā)的熒光強(qiáng)度與精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物引發(fā)的熒光強(qiáng)度不同，為了區(qū)別這些可使用第2閾值。第2閾值成為比第1閾值高的值。在精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物引發(fā)的熒光強(qiáng)度比目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物引發(fā)的熒光強(qiáng)度大時(shí)，可將第1閾值以上不足第2閾值的陽(yáng)性隔區(qū)(以下也稱(chēng)為“第1陽(yáng)性隔區(qū)”)判斷為生成目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的隔區(qū)?？蓪⒌?閾值以上的陽(yáng)性隔區(qū)(以下也稱(chēng)為“第2陽(yáng)性隔區(qū)”)判斷為生成精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的隔區(qū)。另外，也可將檢測(cè)不到信號(hào)的隔區(qū)(陰性隔區(qū))判斷為未生成核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的隔區(qū)。當(dāng)信號(hào)不足第1閾值時(shí)可判斷為陰性隔區(qū)。當(dāng)使用固定化引物的珠，檢測(cè)從珠發(fā)出的信號(hào)時(shí)，可從隔區(qū)取出珠，不是每隔區(qū)，而是珠每進(jìn)行陽(yáng)性－陰性的判斷。此時(shí)，也可與上述的隔區(qū)的陽(yáng)性－陰性的判斷同樣地進(jìn)行珠的陽(yáng)性－陰性的判斷。即，可將第1閾值以上不足第2閾值的珠判斷為第1陽(yáng)性珠，將第2閾值以上的珠判斷為第2陽(yáng)性珠。再者，也可將發(fā)生不足第1閾值的信號(hào)的珠判斷為陰性珠。當(dāng)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)從珠發(fā)出的信號(hào)時(shí)，使從隔區(qū)取出的珠流過(guò)流動(dòng)池，檢測(cè)到從各珠發(fā)出的信號(hào)。此時(shí)，也可制成標(biāo)繪各珠的信號(hào)強(qiáng)度的2維散點(diǎn)圖(以下也稱(chēng)為“2d散點(diǎn)圖”)，在散點(diǎn)圖上識(shí)別第1陽(yáng)性珠的群集及第2陽(yáng)性珠的群集，進(jìn)行第1陽(yáng)性珠及第2陽(yáng)性珠的判斷。不管有無(wú)珠，在使隔區(qū)自體流過(guò)流動(dòng)池而進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)時(shí)也是同樣。接下來(lái)，基于在判斷工序中陽(yáng)性隔區(qū)或陽(yáng)性珠的判斷結(jié)果，判斷上述核酸檢測(cè)工序適宜或不適宜。例如，對(duì)第2陽(yáng)性隔區(qū)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，在計(jì)數(shù)結(jié)果在第3閾值以上時(shí)，可判斷核酸檢測(cè)工序適宜。由于在計(jì)數(shù)結(jié)果不足第3閾值時(shí)認(rèn)為精度管理用多核苷酸不正常擴(kuò)增，可判斷核酸檢測(cè)工序不適宜。另外，雖然在此例中進(jìn)行第2陽(yáng)性隔區(qū)的計(jì)數(shù)及計(jì)數(shù)結(jié)果和閾值的比較，但使用從第2陽(yáng)性隔區(qū)發(fā)生的熒光強(qiáng)度的總和或發(fā)生熒光的面積的總和等也可進(jìn)行同樣的判斷。另外，使用珠時(shí)也可進(jìn)行同樣的判斷。第1閾值及第2閾值可由標(biāo)記物質(zhì)的種類(lèi)或信號(hào)的強(qiáng)度等適宜設(shè)定?？墒褂枚鄠€(gè)核酸樣品預(yù)先檢測(cè)陽(yáng)性隔區(qū)或陽(yáng)性珠變成何程度的信號(hào)強(qiáng)度設(shè)定為可最高精度分類(lèi)陰性和第1陽(yáng)性和第2陽(yáng)性的閾值。第3閾值可基于核酸樣品中的精度管理用多核苷酸的濃度(拷貝數(shù))等適宜設(shè)定。[變異檢測(cè)中的精度管理]本發(fā)明的第1實(shí)施方式涉及的核酸擴(kuò)增的精度管理方法能適用于目標(biāo)核酸的變異檢測(cè)中的精度管理方法。從而，第1實(shí)施方式之一的實(shí)施方式是目標(biāo)核酸的變異檢測(cè)中的精度管理方法。再者，在本說(shuō)明書(shū)中，“變異”是指在核酸的堿基序列中與一般被識(shí)別為野生型的序列不同。例如，可舉出核酸中的核苷酸的取代、缺失、附加、染色體轉(zhuǎn)座等。更具體而言，可例示突變或單核苷酸多態(tài)性(snp)等。在變異檢測(cè)中，目標(biāo)核酸被檢測(cè)為變異型核酸或野生型核酸。為了變異檢測(cè)，在目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物中使用與變異型核酸雜交的檢測(cè)用探針和與野生型核酸雜交的檢測(cè)用探針，由哪個(gè)雜交來(lái)判斷是變異型或野生型。在變異型的目標(biāo)核酸中含變異型的檢測(cè)序列(以下也稱(chēng)為“mut檢測(cè)序列”)，在野生型的目標(biāo)核酸中含野生型的檢測(cè)序列(以下也稱(chēng)為“wt檢測(cè)序列”)。以下，作為本發(fā)明的一實(shí)施方式，對(duì)于目標(biāo)核酸的變異檢測(cè)中的精度管理方法進(jìn)行說(shuō)明。此實(shí)施方式的方法包括核酸檢測(cè)工序和判斷工序。核酸檢測(cè)工序與上述同樣、包括核酸樣品的調(diào)制工序、隔區(qū)的調(diào)制工序、核酸擴(kuò)增工序及信號(hào)檢測(cè)工序。在此實(shí)施方式涉及的核酸樣品的調(diào)制工序中，例如，通過(guò)將含目標(biāo)核酸的樣品和含精度管理用多核苷酸的樣品混合，調(diào)制核酸樣品。作為精度管理用多核苷酸，使用mut檢測(cè)序列的檢測(cè)涉及的精度管理用多核苷酸(以下也稱(chēng)為“mut精度管理用多核苷酸”)及wt檢測(cè)序列的檢測(cè)涉及的精度管理用多核苷酸(以下也稱(chēng)為“wt精度管理用多核苷酸”)的任一方或兩方。mut精度管理用多核苷酸含結(jié)合后述的變異型檢測(cè)用探針的mut檢測(cè)序列及與mut檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的任一方或兩方。因此，mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物與變異型檢測(cè)用探針結(jié)合，發(fā)生變異型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)。wt精度管理用多核苷酸含結(jié)合后述的野生型檢測(cè)用探針的wt檢測(cè)序列及與wt檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的任一方或兩方。因此，wt精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物與野生型檢測(cè)用探針結(jié)合，發(fā)生野生型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)。在將后述的僅變異型檢測(cè)用探針作為檢測(cè)用探針使用時(shí)，優(yōu)選使用至少mut精度管理用多核苷酸。當(dāng)作為檢測(cè)用探針使用變異型檢測(cè)用探針及野生型檢測(cè)用探針的兩方時(shí)，使用mut精度管理用多核苷酸及wt精度管理用多核苷酸的任一方或兩方。與上述的精度管理用多核苷酸相關(guān)的其他特征也適用于mut精度管理用多核苷酸、wt精度管理用多核苷酸。此實(shí)施方式的隔區(qū)調(diào)制工序、核酸擴(kuò)增工序及信號(hào)檢測(cè)工序如關(guān)于第1實(shí)施方式在上所述實(shí)施。作為檢測(cè)用探針使用含與mut檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的變異型檢測(cè)用探針。當(dāng)目標(biāo)核酸含變異時(shí)，由于變異型檢測(cè)用探針結(jié)合于目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)到變異型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)。作為檢測(cè)用探針也優(yōu)選使用還含與wt檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的野生型檢測(cè)用探針。變異型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)與野生型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)是互相不同的種類(lèi)。例如，作為野生型檢測(cè)用探針，可使用標(biāo)記fam的寡核苷酸，作為變異型檢測(cè)用探針，可使用標(biāo)記cy5的寡核苷酸。關(guān)于野生型檢測(cè)用探針及變異型檢測(cè)用探針的特征也適用于這些變異型檢測(cè)用探針、野生型檢測(cè)用探針。在此實(shí)施方式的信號(hào)檢測(cè)工序中，進(jìn)行檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)的檢測(cè)。在使用變異型檢測(cè)用探針和野生型檢測(cè)用探針時(shí)，檢測(cè)到變異型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)和野生型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)。在此實(shí)施方式的判斷工序中，基于信號(hào)檢測(cè)工序的結(jié)果，判斷有無(wú)變異和上述核酸檢測(cè)工序適宜或不適宜。其中，首先，作為檢測(cè)用探針，對(duì)于僅使用變異型檢測(cè)用探針的例進(jìn)行說(shuō)明。在此例中，在核酸樣品的調(diào)制工序中調(diào)制的核酸樣品含目標(biāo)核酸和mut精度管理用多核苷酸和珠。在核酸擴(kuò)增工序中，可得到結(jié)合了目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠和結(jié)合了mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠。其中，在信號(hào)檢測(cè)工序之前從隔區(qū)取出珠。在將從隔區(qū)取出的珠分散到水性介質(zhì)之后，加變異型檢測(cè)用探針。在判斷工序中，如上所述，首先，判斷各珠是結(jié)合核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠與否。目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物及精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物和檢測(cè)用探針的雜交在嚴(yán)格的條件下進(jìn)行。從結(jié)合了含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠、結(jié)合了mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠得到了變異型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)。一方面，從結(jié)合了含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠得不到變異型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)。檢測(cè)不到變異型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)的珠(陰性珠)被判斷為未結(jié)合核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠及結(jié)合了含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠的任何。檢測(cè)到變異型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)的珠(陽(yáng)性珠)被判斷為結(jié)合了含mut檢測(cè)序列的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠。在此陽(yáng)性判斷中，如上所述，也可使用與信號(hào)強(qiáng)度相關(guān)的閾值(第1閾值)。如上所述，基于目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度和基于精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度不同。也可使用用于區(qū)別這些的第2閾值。當(dāng)基于mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度比基于含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度大時(shí)，可將第1閾值以上不足第2閾值的陽(yáng)性珠(以下也稱(chēng)為“第1陽(yáng)性珠”)判斷為結(jié)合了含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠?？蓪⒌?閾值以上的陽(yáng)性珠(以下也稱(chēng)為“第2陽(yáng)性珠”)判斷為結(jié)合了mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠。在判斷工序中，進(jìn)行目標(biāo)核酸中的有無(wú)變異的判斷。在有無(wú)變異的判斷中，例如，對(duì)第1陽(yáng)性珠的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，在其計(jì)數(shù)結(jié)果在第3閾值以上時(shí)，可判斷為有變異(陽(yáng)性)。對(duì)第1陽(yáng)性珠的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，其計(jì)數(shù)結(jié)果不足第3閾值時(shí)，可判斷為無(wú)變異(陰性)。在此例中進(jìn)行第1陽(yáng)性珠的計(jì)數(shù)結(jié)果和閾值的比較，但使用從第1陽(yáng)性珠發(fā)生的熒光強(qiáng)度的總和等也可進(jìn)行同樣的判斷。另外，在此例中，雖從隔區(qū)取出珠，但可在將珠保持在隔區(qū)的情況下，基于從隔區(qū)發(fā)出的信號(hào)檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行同樣的判斷。也可不使用珠而進(jìn)行核酸樣品的調(diào)制工序、隔區(qū)的調(diào)制工序、核酸擴(kuò)增工序，接下來(lái)，維持隔區(qū)地進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)工序，基于從隔區(qū)發(fā)出的信號(hào)檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行同樣的判斷工序。接下來(lái)，在判斷工序中，判斷核酸檢測(cè)工序適宜或不適宜。例如，對(duì)第2陽(yáng)性珠的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。在其計(jì)數(shù)結(jié)果在第3閾值以上時(shí)，可判斷上述核酸檢測(cè)工序適宜。在第2陽(yáng)性珠的個(gè)數(shù)的計(jì)數(shù)結(jié)果不足第3閾值時(shí)，可判斷上述核酸檢測(cè)工序不適宜。對(duì)應(yīng)于珠的個(gè)數(shù)的第3閾值可由核酸樣品中的精度管理用多核苷酸的濃度(拷貝數(shù))等適宜設(shè)定。在判斷核酸檢測(cè)工序適宜時(shí)，可判斷目標(biāo)核酸中的有無(wú)變異的判斷結(jié)果有信賴(lài)性。在判斷核酸檢測(cè)工序不適宜時(shí)，可判斷目標(biāo)核酸中的有無(wú)變異的判斷結(jié)果缺信賴(lài)性。此時(shí)，目標(biāo)核酸中的變異檢測(cè)的判斷結(jié)果，即陽(yáng)性及陰性各自可判斷為有假陽(yáng)性及假陰性的可能性。如此，由第1實(shí)施方式之一的實(shí)施方式，對(duì)目標(biāo)核酸的變異檢測(cè)的判斷結(jié)果可提供懷疑假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果。由此，可提高目標(biāo)核酸的變異檢測(cè)的精度。而且，在判斷核酸檢測(cè)工序不適宜時(shí)，預(yù)測(cè)核酸檢測(cè)工序的任何工序不適宜。從而，由此實(shí)施方式，可通過(guò)提供核酸檢測(cè)工序不適宜的判斷結(jié)果，適宜驗(yàn)證其目標(biāo)核酸的變異檢測(cè)中的不適宜的工序。接下來(lái)，對(duì)于在判斷工序中使用變異型檢測(cè)用探針和野生型檢測(cè)用探針的例進(jìn)行說(shuō)明。在此例中，用核酸樣品的調(diào)制工序調(diào)制的核酸樣品含目標(biāo)核酸、mut精度管理用多核苷酸和wt精度管理用多核苷酸和珠。在核酸擴(kuò)增工序中，得到結(jié)合了目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠、結(jié)合了mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠和結(jié)合了wt精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠。在信號(hào)檢測(cè)工序之前從隔區(qū)取出珠。在將從隔區(qū)取出的珠分散到水性介質(zhì)之后，加變異型檢測(cè)用探針及野生型檢測(cè)用探針。雖從結(jié)合了含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠、結(jié)合了mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠得到變異型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)，但得不到野生型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)。同樣地，從結(jié)合了含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠、wt精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物得到野生型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)，但得不到變異型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)?？蓪⒆儺愋蜋z測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)及野生型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)都檢測(cè)不到的珠(陰性珠)判斷為未結(jié)合核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠。檢測(cè)到變異型及野生型檢測(cè)用探針的任一方引發(fā)的信號(hào)，檢測(cè)不到另一方引發(fā)的信號(hào)的珠(陽(yáng)性珠)可判斷為結(jié)合了核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠。在此陽(yáng)性判斷中，如上所述，也可使用與信號(hào)強(qiáng)度相關(guān)的閾值(第1閾值)。即，作為與野生型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)強(qiáng)度比較的第1閾值也可使用“第1閾值(wt)”。另外，作為與變異型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)強(qiáng)度比較的第1閾值，也可使用“第1閾值(mut)”。如上所述，基于目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度和基于精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度不同。用于區(qū)別這些的第2閾值可用于各檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)。即，作為關(guān)于野生型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)強(qiáng)度的第2閾值，可使用“第2閾值(wt)”。作為關(guān)于變異型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)強(qiáng)度的第2閾值，可使用“第2閾值(mut)”。對(duì)應(yīng)于各信號(hào)的第2閾值各自成為比第1閾值高的值。以下在此例中，對(duì)于基于mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度比基于含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度大，基于wt精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度比基于含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度大的情況進(jìn)行說(shuō)明。可將第1閾值(mut)以上不足第2閾值(mut)且不足第1閾值(wt)的陽(yáng)性珠(以下也稱(chēng)為“第1陽(yáng)性珠(mut)”)判斷為結(jié)合了含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠。可將第2閾值(mut)以上且不足第1閾值(wt)的陽(yáng)性珠(以下也稱(chēng)為“第2陽(yáng)性珠(mut)”)判斷為結(jié)合了mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠?？蓪⒌?閾值(wt)以上第2閾值(wt)不足且不足第1閾值(mut)的陽(yáng)性珠(以下也稱(chēng)為“第1陽(yáng)性珠(wt)”)判斷為結(jié)合了含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠?？蓪⒌?閾值(wt)以上且不足第1閾值(mut)的陽(yáng)性珠(以下也稱(chēng)為“第2陽(yáng)性珠(wt)”)判斷為結(jié)合了wt精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠。在判斷工序中，如上所述，進(jìn)行有無(wú)變異的判斷。在有無(wú)變異的判斷中，例如，可以在目標(biāo)核酸的濃度(全拷貝數(shù))之中，僅哪個(gè)濃度(拷貝數(shù))的目標(biāo)核酸含mut檢測(cè)序列(即，含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的拷貝數(shù)對(duì)目標(biāo)核酸的全拷貝數(shù)的比例：(含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的拷貝數(shù))/(目標(biāo)核酸的全拷貝數(shù)))作為指標(biāo)進(jìn)行判斷。此比例通過(guò)用第1陽(yáng)性珠(mut)的個(gè)數(shù)和第1陽(yáng)性珠(wt)的個(gè)數(shù)的合計(jì)數(shù)除以第1陽(yáng)性珠(mut)的個(gè)數(shù)來(lái)算出(＝(第1陽(yáng)性珠(mut)的個(gè)數(shù))/[(第1陽(yáng)性珠(mut)的個(gè)數(shù)+(第1陽(yáng)性珠(wt)的個(gè)數(shù))])。當(dāng)算出的比例在對(duì)應(yīng)于此比例的第3閾值以上時(shí)，可判斷為有變異(陽(yáng)性)。當(dāng)此比例不足指定的閾值時(shí)，可判斷為無(wú)變異(陰性)。作為判斷的指標(biāo)，不限于此，如上所述，當(dāng)?shù)?陽(yáng)性珠(mut)的個(gè)數(shù)在對(duì)應(yīng)于珠的個(gè)數(shù)的第3閾值以上時(shí)可判斷為有變異(陽(yáng)性)，在不足上述第3閾值時(shí)可判斷為無(wú)變異(陰性)。在判斷工序中，判斷核酸檢測(cè)工序適宜或不適宜。例如，對(duì)第2陽(yáng)性珠(mut)的個(gè)數(shù)及第2陽(yáng)性珠(wt)的個(gè)數(shù)各自進(jìn)行計(jì)數(shù)。在第2陽(yáng)性珠(mut)的計(jì)數(shù)結(jié)果不足第3閾值(mut)或第2陽(yáng)性珠(wt)的計(jì)數(shù)結(jié)果不足第3閾值(wt)時(shí)，可判斷為核酸檢測(cè)工序不適宜，可判斷為有無(wú)變異的檢測(cè)結(jié)果信賴(lài)性低。此時(shí)，可將有無(wú)變異的檢測(cè)結(jié)果記為“信賴(lài)性低”而輸出，也可不輸出。當(dāng)?shù)?陽(yáng)性珠(mut)的計(jì)數(shù)結(jié)果是第3閾值(mut)以上，并且第2陽(yáng)性珠(wt)的計(jì)數(shù)結(jié)果是第3閾值(wt)以上時(shí)，可判斷核酸檢測(cè)工序適宜，可賦予有無(wú)變異的檢測(cè)結(jié)果信賴(lài)性。另外，當(dāng)?shù)?陽(yáng)性珠(mut)的計(jì)數(shù)結(jié)果不足對(duì)應(yīng)于第2陽(yáng)性珠(mut)的第3閾值時(shí)，可判斷關(guān)于含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的核酸檢測(cè)工序不適宜。由此，可判斷為目標(biāo)核酸中的有無(wú)變異的判斷結(jié)果缺信賴(lài)性。此時(shí)，可判斷為目標(biāo)核酸中的變異檢測(cè)的判斷結(jié)果，即陽(yáng)性及陰性各自有假陽(yáng)性及假陰性的可能性。如上所述，根據(jù)需要，也可進(jìn)行用于驗(yàn)證核酸檢測(cè)工序的任何的工序不適宜的追試。在上述例中，雖從隔區(qū)取出珠，但可在將珠保持在隔區(qū)的情況下，基于從隔區(qū)發(fā)出的信號(hào)檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行同樣的判斷。另外，也可不使用珠而進(jìn)行核酸樣品的調(diào)制工序、隔區(qū)的調(diào)制工序、核酸擴(kuò)增工序，接下來(lái)，維持隔區(qū)地進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)工序，基于從隔區(qū)發(fā)出的信號(hào)檢測(cè)的結(jié)果同樣地進(jìn)行判斷工序。雖在上述的變異檢測(cè)的精度管理方法中使用2種精度管理用多核苷酸，但在其中，對(duì)于可使用1種精度管理用多核苷酸，實(shí)施變異檢測(cè)的精度管理方法的例進(jìn)行說(shuō)明。此例中的精度管理用多核苷酸在第3區(qū)域含wt檢測(cè)序列及與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的任一方或其兩方，并且含mut檢測(cè)序列及與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的任一方或其兩方(以下也稱(chēng)為“wt和mut精度管理用多核苷酸”)。在此例中，用核酸樣品的調(diào)制工序調(diào)制的核酸樣品含目標(biāo)核酸、wt和mut精度管理用多核苷酸和珠。在核酸擴(kuò)增工序中，可得到結(jié)合了目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠和結(jié)合了wt和mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠。其中，在信號(hào)檢測(cè)工序之前從隔區(qū)取出珠。在將從隔區(qū)取出的珠分散到水性介質(zhì)之后，加變異型檢測(cè)用探針及野生型檢測(cè)用探針。在此實(shí)施方式中的檢測(cè)工序中，與上述同樣地，從結(jié)合了目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠取得同樣的信號(hào)。wt和mut精度管理用多核苷酸含wt檢測(cè)序列和mut檢測(cè)序列的兩方。從而，使wt和mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物和檢測(cè)用探針在嚴(yán)格的條件下雜交，則可得到變異型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)和野生型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)。檢測(cè)不到變異型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)，并且檢測(cè)不到野生型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)的珠(陰性珠)被判斷為未結(jié)合核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠。檢測(cè)到變異型檢測(cè)用探針和野生型檢測(cè)用探針引發(fā)的兩方的信號(hào)的珠被判斷為結(jié)合了wt和mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠(以下也稱(chēng)為“wt和mut陽(yáng)性珠”)。在此陽(yáng)性判斷中，如上所述，也可使用與信號(hào)強(qiáng)度相關(guān)的閾值(第1閾值)。即，作為與野生型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)強(qiáng)度比較的第1閾值，可使用“第1閾值(wt)”。另外，作為與變異型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)強(qiáng)度比較的第1閾值，可使用“第1閾值(mut)”。wt和mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物中的wt檢測(cè)序列和與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的合計(jì)數(shù)與含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物中的wt檢測(cè)序列和與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的合計(jì)數(shù)不同。同樣地，wt和mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物中的mut檢測(cè)序列和與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的合計(jì)數(shù)與含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物中的mut檢測(cè)序列和與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的合計(jì)數(shù)不同。從而，基于目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的各檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)強(qiáng)度和基于wt和mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的各檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)強(qiáng)度不同。用于區(qū)別這些各信號(hào)強(qiáng)度的差異的第2閾值可用于各檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)。即，作為關(guān)于野生型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)強(qiáng)度的第2閾值，可使用“第2閾值(wt)”。作為關(guān)于變異型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)強(qiáng)度的第2閾值，可使用“第2閾值(mut)”。對(duì)應(yīng)于各信號(hào)的第2閾值各自成為比第1閾值高的值。以下在此例中，對(duì)于基于wt和mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度比基于含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)大，并且基于wt和mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度比基于含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度大的情況進(jìn)行說(shuō)明。可將第1閾值(mut)以上不足第2閾值(mut)且不足第1閾值(wt)的陽(yáng)性珠(第1陽(yáng)性珠(mut))判斷為結(jié)合了含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠?？蓪⒌?閾值(wt)以上第2閾值(wt)不足且不足第1閾值(mut)的陽(yáng)性珠(第1陽(yáng)性珠(wt))判斷為結(jié)合了含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠?？蓪⑹堑?閾值(wt)以上，并且，第2閾值(mut)以上的陽(yáng)性珠(以下也稱(chēng)為“第2陽(yáng)性珠(wt和mut)”)判斷為結(jié)合了wt和mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠(wt和mut陽(yáng)性珠)。在判斷工序中，與上述實(shí)施方式同樣地，判斷有無(wú)變異。例如，在第1陽(yáng)性珠(mut)的個(gè)數(shù)對(duì)應(yīng)于第1陽(yáng)性珠(mut)的個(gè)數(shù)的第3閾值以上時(shí)判斷為有變異(陽(yáng)性)，在不足上述第3閾值時(shí)可判斷為無(wú)變異(陰性)。另外，如上所述，也可以在目標(biāo)核酸的濃度(全拷貝數(shù))之中，僅哪個(gè)濃度(拷貝數(shù))的目標(biāo)核酸含mut檢測(cè)序列作為指標(biāo)判斷有無(wú)變異。這些是例示，判斷有無(wú)變異的方法不限于此。在判斷工序中，判斷上述核酸檢測(cè)工序適宜或不適宜。使用1種wt和mut精度管理用多核苷酸的精度管理方法中的判斷工序和使用上述的wt精度管理用多核苷酸和mut精度管理用多核苷酸這2種的精度管理方法中的判斷工序除下述情況外，同樣地進(jìn)行。在使用上述的wt精度管理用多核苷酸和mut精度管理用多核苷酸這2種的精度管理方法中，從第2陽(yáng)性珠(wt)判斷關(guān)于含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的核酸檢測(cè)工序適宜或不適宜。另外，從第2陽(yáng)性珠(mut)判斷關(guān)于含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的核酸檢測(cè)工序適宜或不適宜。即，在使用2種精度管理用多核苷酸時(shí)，基于2種陽(yáng)性珠，判斷與含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸相關(guān)的核酸檢測(cè)工序和與含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸相關(guān)的核酸檢測(cè)工序適宜或不適宜。與此相比，作為精度管理用多核苷酸，在使用1種wt和mut精度管理用多核苷酸的精度管理方法中，從1種陽(yáng)性珠(wt和mut陽(yáng)性珠)，判斷與含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸相關(guān)的核酸檢測(cè)工序和與含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸相關(guān)的核酸檢測(cè)工序適宜或不適宜。例如，對(duì)wt和mut陽(yáng)性珠的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。當(dāng)其計(jì)數(shù)結(jié)果在對(duì)應(yīng)于wt和mu陽(yáng)性珠的個(gè)數(shù)的第3閾值以上時(shí)，可判斷為核酸檢測(cè)工序適宜。當(dāng)wt和mut陽(yáng)性珠的個(gè)數(shù)的計(jì)數(shù)結(jié)果不足對(duì)應(yīng)于wt和mut陽(yáng)性珠的個(gè)數(shù)的第3閾值時(shí)，可判斷為核酸檢測(cè)工序不適宜。在判斷為核酸檢測(cè)工序不適宜時(shí)，假定含核酸樣品的調(diào)制工序、隔區(qū)的調(diào)制工序、核酸擴(kuò)增工序及信號(hào)檢測(cè)工序的核酸檢測(cè)工序的哪個(gè)工序不適宜。哪個(gè)工序不適宜，如上所述，可通過(guò)進(jìn)行追試等來(lái)進(jìn)行適宜驗(yàn)證。在使用1種wt和mut精度管理用多核苷酸的精度管理方法中，也與使用上述的2種精度管理用多核苷酸的精度管理方法同樣地，對(duì)目標(biāo)核酸的變異檢測(cè)的判斷結(jié)果給使有信賴(lài)性或缺信賴(lài)性的判斷成為可能的結(jié)果。接下來(lái)，參照附圖，對(duì)于本發(fā)明之一的實(shí)施方式涉及的實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。再者，以下的說(shuō)明全部旨在例示而非限制，不以任何方式限定隨附的專(zhuān)利權(quán)利要求中記載的發(fā)明。[實(shí)施方式1]圖1是顯示實(shí)施方式1涉及的核酸檢測(cè)工序的模式圖。在實(shí)施方式1中，向油相中的水性液滴封入珠而進(jìn)行數(shù)字pcr，進(jìn)行核酸檢測(cè)。本實(shí)施方式中使用的“珠”的材質(zhì)不特別限定。可使用金屬制粒子、樹(shù)脂制粒子等。作為金屬制粒子的材質(zhì)的具體例，可例示金、銀、銅、鐵、鋁、鎳、錳、鈦、這些的氧化物等。另外，也可為這些的合金。作為樹(shù)脂制粒子的材質(zhì)的具體例，可例示聚苯乙烯、乳膠等。也可使珠帶磁性(以下也稱(chēng)為“磁性珠”)。首先，調(diào)制含目標(biāo)核酸、精度管理用多核苷酸、在表面結(jié)合目標(biāo)核酸擴(kuò)增用引物組之中的一方的引物的珠和對(duì)于此外的核酸擴(kuò)增必要的試劑的核酸樣品(圖1(i))。實(shí)施方式1中使用的目標(biāo)核酸含1個(gè)檢測(cè)序列(n＝1)，精度管理用多核苷酸含2個(gè)檢測(cè)序列(n＝2)。將作為水相的核酸樣品、油相、及乳化劑混合，由攪拌等形成多個(gè)油相中的水性液滴(隔區(qū))(圖1(ii))。由于此水性液滴比目標(biāo)核酸或精度管理用多核苷酸的拷貝數(shù)大過(guò)量形成，從而在理論上單一的水性液滴中含精度管理用核酸一分子或目標(biāo)核酸一分子。另外，由于水性液滴數(shù)還比珠數(shù)大過(guò)量形成，理論上變得在單一的水性液滴中含1個(gè)珠。通常，在數(shù)字pcr中，形成數(shù)千萬(wàn)個(gè)液滴，在其中的0.1～1％左右含目標(biāo)核酸一分子或精度管理用多核苷酸一分子和1個(gè)結(jié)合了引物的珠(圖1(ii)(b)、(c))。在此外的液滴中通常缺少任何的成分(圖1(ii)(a1)～(a4))、在珠上的核酸擴(kuò)增不進(jìn)行(圖1(iii)(a1)～(a4))。通過(guò)對(duì)水性液滴集團(tuán)實(shí)施pcr法，在含目標(biāo)核酸一分子或精度管理用多核苷酸一分子和結(jié)合引物的珠1個(gè)的水性液滴中，在珠上結(jié)合延伸的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1(iii)(b)、(c))。接下來(lái)，將水性液滴(隔區(qū))由公知的手段(例如，表面活性劑添加)破壞(破壞工序)、由離心分離等除去含未結(jié)合到珠的擴(kuò)增產(chǎn)物或未反應(yīng)成分的上清(b/f分離工序)，回收珠。使得用熒光物質(zhì)預(yù)先標(biāo)記化的檢測(cè)用探針在嚴(yán)格的條件下雜交于回收的珠上的擴(kuò)增產(chǎn)物。再次、進(jìn)行b/f分離，除去未雜交的檢測(cè)用探針。其后，對(duì)每種珠照射激發(fā)光(λ1)，測(cè)定來(lái)自各珠的熒光信號(hào)(λ2)(信號(hào)檢測(cè)工序)。由此，得到關(guān)于結(jié)合到珠上的擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)。在信號(hào)的檢測(cè)中，使用流式細(xì)胞儀。在結(jié)合精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠(圖1(iii)(c))中，比結(jié)合了目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠(圖1(iii)(b))可雜交約2倍的數(shù)的檢測(cè)用探針。由此雜交的檢測(cè)用探針的數(shù)的差異，從結(jié)合了精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠可得到計(jì)算上比從結(jié)合了目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠得到的熒光信號(hào)強(qiáng)度強(qiáng)約2倍的熒光信號(hào)強(qiáng)度。其中，隔區(qū)的調(diào)制由微乳劑的形成進(jìn)行。微乳劑可由移液器吸吐等的攪拌操作形成核酸樣品、油相及乳化劑的混合物。在1個(gè)實(shí)施方式中，形成的微乳劑不限定，但水相可為10～30％(v/v)，油相可為60～85％(v/v)，乳化劑可為5～10％(v/v)。由于數(shù)字pcr伴隨熱循環(huán)，乳化劑優(yōu)選是熱穩(wěn)定性的。在實(shí)施方式1中，在利用數(shù)字pcr的核酸擴(kuò)增中，雖使目標(biāo)核酸擴(kuò)增用引物組的一方的引物結(jié)合到珠上，但在本發(fā)明的實(shí)施方式涉及的核酸擴(kuò)增中結(jié)合于珠上的引物的種類(lèi)不限于1種。在實(shí)施方式1的變形例中，也可使目標(biāo)核酸擴(kuò)增用引物組的兩方結(jié)合到珠上。在實(shí)施方式1中，破壞工序后，用熒光染料預(yù)先標(biāo)記化，使用在探針單獨(dú)的狀態(tài)下顯示信號(hào)、雜交之后也顯示信號(hào)的檢測(cè)用探針。這樣的標(biāo)記化檢測(cè)用探針在將不與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的檢測(cè)用探針可由b/f分離除去的實(shí)施方式中有利地使用。在實(shí)施方式1的變形例中，可在隔區(qū)的調(diào)制前在核酸樣品中使用在探針單獨(dú)的狀態(tài)下不顯示信號(hào)，在雜交的狀態(tài)下顯示信號(hào)的探針、例如分子信標(biāo)探針。由此變形例能不破壞水性液滴(隔區(qū))而在維持隔區(qū)的狀態(tài)下，檢測(cè)關(guān)于來(lái)自各隔區(qū)的核酸擴(kuò)增的信號(hào)?；趤?lái)自結(jié)合精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠的信號(hào)的檢測(cè)結(jié)果，判斷核酸檢測(cè)工序適宜或不適宜。如上所述，在判斷為核酸檢測(cè)工序適宜時(shí)，可判斷為目標(biāo)核酸的檢測(cè)結(jié)果有信賴(lài)性。在判斷為核酸檢測(cè)工序不適宜時(shí)，可判斷為目標(biāo)核酸的檢測(cè)結(jié)果缺信賴(lài)性。如此，由實(shí)施方式1可管理核酸的檢測(cè)結(jié)果的精度－品質(zhì)。[實(shí)施方式2]實(shí)施方式2關(guān)于目標(biāo)核酸的變異檢測(cè)中的精度管理方法。圖2是顯示實(shí)施方式2中的核酸擴(kuò)增的種類(lèi)(b)及檢測(cè)信號(hào)的2d散點(diǎn)圖(a)的模式圖。在實(shí)施方式2中，對(duì)于使用變異型的目標(biāo)核酸及野生型的目標(biāo)核酸混在的樣品的情況進(jìn)行說(shuō)明。作為精度管理用多核苷酸，使用mut檢測(cè)序列的檢測(cè)用的精度管理用多核苷酸(mut精度管理用多核苷酸)和wt檢測(cè)序列的檢測(cè)用的精度管理用多核苷酸(wt精度管理用多核苷酸)的2種。mut精度管理用多核苷酸含5個(gè)mut檢測(cè)序列，wt精度管理用多核苷酸含5個(gè)wt檢測(cè)序列。在實(shí)施方式2中，核酸樣品的調(diào)制、隔區(qū)調(diào)制及核酸擴(kuò)增工序與實(shí)施方式1同樣地實(shí)施。在實(shí)施方式2中的核酸擴(kuò)增工序中，由目標(biāo)核酸擴(kuò)增用引物組(第1引物及第2引物)，可擴(kuò)增wt精度管理用多核苷酸(圖2(b)(i))、含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸(圖2(b)(ii))、mut精度管理用多核苷酸(圖2(b)(iii))及含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸(圖2(b)(iv))。由此，可得到結(jié)合了wt精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠、結(jié)合了含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠、結(jié)合了mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠、及結(jié)合了含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠。與實(shí)施方式1同樣地從隔區(qū)回收上述珠。使檢測(cè)用探針在嚴(yán)格的條件下雜交于回收的珠。在實(shí)施方式2中，使用向用熒光物質(zhì)cy5標(biāo)記化的mut檢測(cè)序列雜交的檢測(cè)用探針(以下也稱(chēng)為“mut檢測(cè)用探針(cy5)”)和向用熒光物質(zhì)fam標(biāo)記化的wt檢測(cè)序列雜交的檢測(cè)用探針(以下也稱(chēng)為“wt檢測(cè)用探針(fam)”)。通過(guò)將不同的熒光物質(zhì)標(biāo)記化，各檢測(cè)用探針發(fā)互相不同的熒光信號(hào)。在使上述檢測(cè)用探針雜交之后，進(jìn)行b/f分離，除去未雜交的檢測(cè)用探針。由流式細(xì)胞儀，檢測(cè)來(lái)自珠的信號(hào)。圖2a是x軸示分配mut檢測(cè)用探針(cy5)來(lái)源的熒光信號(hào)強(qiáng)度，y軸示分配wt檢測(cè)用探針(fam)來(lái)源的熒光信號(hào)強(qiáng)度的2d散點(diǎn)圖。由于含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸含1個(gè)mut檢測(cè)序列(n＝1)，mut精度管理用多核苷酸含5個(gè)mut檢測(cè)序列(n＝5)，1個(gè)mut檢測(cè)用探針(cy5)可雜交于結(jié)合了含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠，5個(gè)mut檢測(cè)用探針(cy5)可雜交于結(jié)合了mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠。從而，從結(jié)合了mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠得到的cy5來(lái)源的熒光信號(hào)強(qiáng)度比從結(jié)合了含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠得到的cy5來(lái)源的熒光信號(hào)強(qiáng)度大。目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物及精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物和檢測(cè)用探針的雜交在嚴(yán)格的條件下進(jìn)行。從而，從含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物和mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物，fam來(lái)源的熒光信號(hào)是檢測(cè)界限以下或即使有也僅略微檢測(cè)到。在圖2a中，將用于區(qū)別珠等的自身熒光和來(lái)自結(jié)合了含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠的熒光信號(hào)的閾值作為第1閾值(cy5)顯示。另外，將用于區(qū)別來(lái)自結(jié)合了含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠的熒光信號(hào)和來(lái)自結(jié)合了mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠的熒光信號(hào)的閾值作為第2閾值(cy5)顯示。在結(jié)合了含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠可標(biāo)繪在第1閾值(cy5)和第2閾值(cy5)之間，不足后述的第1閾值(fam)的區(qū)(iv)。結(jié)合了mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠可標(biāo)繪在第2閾值(cy5)以上且不足后述的第1閾值(fam)的區(qū)(iii)。同樣地，由于含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸含1個(gè)(n＝1)wt檢測(cè)序列，wt精度管理用多核苷酸含5個(gè)(n＝5)wt檢測(cè)序列，1個(gè)wt檢測(cè)用探針(fam)可雜交于結(jié)合了含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠，5個(gè)wt檢測(cè)用探針(fam)可雜交于結(jié)合了wt精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠。核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物和檢測(cè)用探針的雜交在嚴(yán)格的條件下進(jìn)行。從而，從結(jié)合了wt精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠得到的fam來(lái)源的熒光信號(hào)強(qiáng)度比從結(jié)合了含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠得到的fam來(lái)源的熒光信號(hào)強(qiáng)度大。另外，從它們擴(kuò)增產(chǎn)物，cy5來(lái)源的熒光信號(hào)是檢測(cè)界限以下或即使有也僅略微檢測(cè)到。在圖2a中，將用于區(qū)別珠等的自身熒光和來(lái)自結(jié)合了含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠的熒光信號(hào)的閾值作為第1閾值(fam)顯示。另外，將用于區(qū)別來(lái)自結(jié)合了含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠的熒光信號(hào)和來(lái)自結(jié)合了wt精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠的熒光信號(hào)的閾值作為第2閾值(fam)顯示。在結(jié)合了含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠可標(biāo)繪在第1閾值(fam)和第2閾值(fam)之間，不足第1閾值(cy5)的區(qū)(ii)。結(jié)合了wt精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠可標(biāo)繪在第2閾值(fam)以上且不足第1閾值(cy5)的區(qū)(i)。在實(shí)施方式2的判斷工序中，判斷有無(wú)變異。例如，可以目標(biāo)核酸的濃度(全拷貝數(shù))之中僅哪個(gè)濃度(拷貝數(shù))的目標(biāo)核酸含mut檢測(cè)序列作為指標(biāo)而進(jìn)行判斷。在可標(biāo)繪有結(jié)合了目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠的區(qū)(ii)和區(qū)(iv)的兩方有點(diǎn)時(shí)，算出相對(duì)于區(qū)(ii)的點(diǎn)數(shù)和區(qū)(iv)的點(diǎn)數(shù)的合計(jì)的區(qū)(iv)的點(diǎn)數(shù)的比例(＝(區(qū)(iv)的點(diǎn)數(shù))/[(區(qū)(ii)的點(diǎn)數(shù))+(區(qū)(iv)的點(diǎn)數(shù))])。在其比例在指定的閾值以上時(shí)，可判斷為有變異。在判斷工序中，判斷核酸檢測(cè)工序適宜或不適宜。在實(shí)施方式2中，在可標(biāo)繪有結(jié)合了mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠的區(qū)(iii)中存在的點(diǎn)的數(shù)在指定的閾值以上時(shí)，可判斷為關(guān)于含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的核酸檢測(cè)工序適宜。此判斷結(jié)果提示目標(biāo)核酸的有無(wú)變異的判斷結(jié)果有信賴(lài)性。在實(shí)施方式2中，也得到來(lái)自wt精度管理用多核苷酸的野生型檢測(cè)用探針引發(fā)的信號(hào)。在可標(biāo)繪有結(jié)合了wt精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠的區(qū)(i)中存在的點(diǎn)的數(shù)在指定的閾值以上時(shí)，可判斷為關(guān)于含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的核酸檢測(cè)工序適宜?；诖藚^(qū)(i)的判斷結(jié)果可給對(duì)于上述的基于區(qū)(iii)的判斷結(jié)果(關(guān)于含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的核酸檢測(cè)工序適宜)的信賴(lài)性。如此，通過(guò)使用2種精度管理用多核苷酸，與使用1種精度管理用多核苷酸的情況比，可使目標(biāo)核酸中的精度管理的信賴(lài)性進(jìn)一步提高，結(jié)果，目標(biāo)核酸的變異檢測(cè)的精度可進(jìn)一步提高。在區(qū)(iii)中存在的點(diǎn)的數(shù)不足指定的閾值時(shí)，可判斷為關(guān)于含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的核酸檢測(cè)工序不適宜。此判斷結(jié)果提示目標(biāo)核酸的有無(wú)變異的判斷結(jié)果欠信賴(lài)性。鑒于核酸檢測(cè)工序不適宜的判斷結(jié)果，如需要，也可為了驗(yàn)證核酸檢測(cè)工序的任何的工序是否不適宜而進(jìn)行追試。其中，在區(qū)(i)中存在的點(diǎn)的數(shù)在指定的閾值以上時(shí)，可判斷為關(guān)于含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的核酸檢測(cè)工序適宜。此時(shí)，如上所述，作為上述追試，在核酸檢測(cè)工序之中，可假定為信號(hào)檢測(cè)工序不適宜。如此，通過(guò)使用2種精度管理用多核苷酸，與使用1種精度管理用多核苷酸的情況比，關(guān)于與目標(biāo)核酸相關(guān)的核酸檢測(cè)工序的任何的工序不適宜而可得到附加的的信息，從而有利。[實(shí)施方式2的變形例]在實(shí)施方式2中，使用變異型檢測(cè)用探針、野生型檢測(cè)用探針的2種檢測(cè)用探針和2種精度管理用多核苷酸(mut精度管理用多核苷酸和wt精度管理用多核苷酸)。其中，說(shuō)明使用1種精度管理用多核苷酸和上述的2種檢測(cè)用探針的目標(biāo)核酸的變異檢測(cè)中的精度管理方法。在此變形例中，作為精度管理用多核苷酸，使用含2個(gè)wt檢測(cè)序列、2個(gè)mut檢測(cè)序列的多核苷酸(以下也稱(chēng)為“wt和mut精度管理用多核苷酸”)。目標(biāo)核酸，與實(shí)施方式2同樣、含1個(gè)mut檢測(cè)序列或wt檢測(cè)序列。檢測(cè)用探針，與實(shí)施方式2同樣，使用wt檢測(cè)用探針(fam)、mut檢測(cè)用探針(cy5)。在此變形例中，核酸檢測(cè)工序與實(shí)施方式2同樣地實(shí)施。在圖2a中，結(jié)合了含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠，與實(shí)施方式2同樣、標(biāo)繪在區(qū)(ii)。另外，結(jié)合了含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠標(biāo)繪在區(qū)(iv)。在結(jié)合了wt和mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠中，可雜交2個(gè)wt檢測(cè)用探針(fam)，可雜交2個(gè)mut檢測(cè)用探針(cy5)。從而，從結(jié)合了wt和mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠得到的fam來(lái)源的熒光信號(hào)強(qiáng)度比從結(jié)合了含wt檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠得到的fam熒光信號(hào)強(qiáng)度大。同樣地，從上述珠得到的cy5來(lái)源的熒光信號(hào)強(qiáng)度比從結(jié)合了含mut檢測(cè)序列的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠得到的cy5熒光信號(hào)強(qiáng)度大。在此變形例中，為了區(qū)別基于目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的各檢測(cè)用探針引發(fā)的熒光信號(hào)強(qiáng)度和基于wt和mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的各檢測(cè)用探針引發(fā)的熒光信號(hào)強(qiáng)度而使用第2閾值。對(duì)于mut檢測(cè)用探針(cy5)引發(fā)的信號(hào)稱(chēng)為第2閾值(cy5)，對(duì)于wt檢測(cè)用探針(fam)引發(fā)的信號(hào)稱(chēng)為第2閾值(fam)(未在圖2a中圖示)。結(jié)合了wt和mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠可標(biāo)繪在第2閾值(fam)以上，并且，第2閾值(cy5)以上的區(qū)(圖2a、區(qū)(v))。此變形例中的有無(wú)變異的判斷，與實(shí)施方式2同樣、算出區(qū)(iv)的點(diǎn)數(shù)對(duì)區(qū)(ii)的點(diǎn)數(shù)和區(qū)(iv)的點(diǎn)數(shù)的合計(jì)的比例(＝(區(qū)(iv)的點(diǎn)數(shù))/[(區(qū)(ii)的點(diǎn)數(shù))+(區(qū)(iv)的點(diǎn)數(shù))])，其比例在指定的閾值以上時(shí)，可判斷為有變異。此變形例中的核酸檢測(cè)工序適宜與否的判斷，在可標(biāo)繪有結(jié)合了wt和mut精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠的區(qū)(v)的點(diǎn)的數(shù)不足指定的閾值時(shí)，可判斷為目標(biāo)核酸的變異檢測(cè)中的核酸檢測(cè)工序不適宜。一方面，區(qū)(v)的點(diǎn)的數(shù)在指定的閾值以上時(shí)，可判斷為目標(biāo)核酸的變異檢測(cè)中的核酸檢測(cè)工序適宜?；谶@些判斷結(jié)果，可如在實(shí)施方式2中記載進(jìn)行目標(biāo)核酸的變異檢測(cè)的精度管理。[實(shí)施方式3]圖3是顯示實(shí)施方式3涉及的核酸檢測(cè)工序的模式圖。在實(shí)施方式3中，與實(shí)施方式1不同，顯示由液滴型的數(shù)字pcr進(jìn)行核酸擴(kuò)增之后，不破壞隔區(qū)而從各隔區(qū)檢測(cè)信號(hào)的例。在實(shí)施方式3中，調(diào)制含目標(biāo)核酸、精度管理用多核苷酸、能與檢測(cè)序列雜交的taqman(商標(biāo))探針(檢測(cè)用探針)、有5’→3’外切核酸酶活性的聚合酶(未圖示)和對(duì)此外的核酸擴(kuò)增必要的試劑的核酸樣品(圖3(i))。實(shí)施方式3中使用的目標(biāo)核酸及精度管理用多核苷酸，與在實(shí)施方式1中使用的同樣、目標(biāo)核酸含1個(gè)檢測(cè)序列(n＝1)，精度管理用多核苷酸含2個(gè)檢測(cè)序列(n＝2)。在隔區(qū)調(diào)制工序中，與實(shí)施方式1同樣地，形成油相中的水性液滴(隔區(qū))(圖3(ii))。在形成的多數(shù)的水性液滴之中，調(diào)制含目標(biāo)核酸一分子或精度管理用多核苷酸一分子和多個(gè)taqman(商標(biāo))探針的水性液滴(圖3(ii)(b)、(c))。通過(guò)對(duì)水性液滴集團(tuán)實(shí)施pcr法，在含目標(biāo)核酸一分子或精度管理用多核苷酸一分子的水性液滴中，在其水性液滴中生成核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖3(iii)(b)、(c))。在此外的水性液滴中通常缺目標(biāo)核酸和精度管理用多核苷酸(圖3(ii)(a))、在這樣的水性液滴中，即使實(shí)施pcr法，也不進(jìn)行核酸擴(kuò)增(圖3(iii)(a))。在核酸擴(kuò)增工序中，taqman(商標(biāo))探針由聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性分解。伴隨taqman(商標(biāo))探針的分解而熒光物質(zhì)與猝滅劑物質(zhì)隔離，成為能發(fā)熒光的狀態(tài)。在目標(biāo)核酸的情況中，由第一次的核酸擴(kuò)增，由每一條鏈的擴(kuò)增而一分子的taqman(商標(biāo))探針可分解。由此，成為一分子的熒光物質(zhì)能發(fā)熒光的狀態(tài)。在精度管理用多核苷酸的情況中，由第一次的核酸擴(kuò)增，由每1條鏈的擴(kuò)增而二分子的taqman(商標(biāo))探針可分解。由此，成為二分子的熒光物質(zhì)能發(fā)熒光的狀態(tài)。在信號(hào)檢測(cè)工序中，對(duì)每種水性液滴照射激發(fā)光(λ1)，測(cè)定來(lái)自各水性液滴的熒光信號(hào)(λ2)。測(cè)定的熒光信號(hào)強(qiáng)度可反映成為能發(fā)熒光的熒光物質(zhì)的數(shù)。認(rèn)為可在含精度管理用多核苷酸一分子的水性液滴中存在的能發(fā)熒光的熒光物質(zhì)的數(shù)比可在含目標(biāo)核酸一分子的水性液滴中存在的能發(fā)熒光的熒光物質(zhì)的數(shù)多約2倍。由此能發(fā)熒光的熒光物質(zhì)的數(shù)的差異，從含精度管理用多核苷酸一分子的水性液滴可得到比從含目標(biāo)核酸一分子的水性液滴得到的熒光信號(hào)強(qiáng)度計(jì)算上強(qiáng)約2倍的熒光信號(hào)強(qiáng)度?；趤?lái)自生成精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的隔區(qū)(液滴)的信號(hào)的檢測(cè)結(jié)果，判斷核酸檢測(cè)工序適宜或不適宜。如上所述，當(dāng)判斷為核酸檢測(cè)工序適宜時(shí)，可判斷為目標(biāo)核酸的檢測(cè)結(jié)果有信賴(lài)性。當(dāng)判斷為核酸檢測(cè)工序不適宜時(shí)，可判斷為目標(biāo)核酸的檢測(cè)結(jié)果缺信賴(lài)性。如此，由實(shí)施方式3可管理核酸的檢測(cè)結(jié)果的精度－品質(zhì)。[實(shí)施方式4]圖4是顯示實(shí)施方式4涉及的核酸檢測(cè)工序的模式圖。在實(shí)施方式4中，與實(shí)施方式3不同，顯示由孔型的數(shù)字pcr進(jìn)行核酸擴(kuò)增的例。在實(shí)施方式4中，調(diào)制含目標(biāo)核酸、精度管理用多核苷酸和對(duì)于此外的核酸擴(kuò)增必要的試劑的核酸樣品(圖4(i))。實(shí)施方式4中使用的目標(biāo)核酸及精度管理用多核苷酸，與在實(shí)施方式3中使用的同樣、目標(biāo)核酸含1個(gè)檢測(cè)序列(n＝1)，精度管理用多核苷酸含2個(gè)檢測(cè)序列(n＝2)。在隔區(qū)調(diào)制工序中，與實(shí)施方式3不同，將核酸樣品分注于微滴定板的多數(shù)的孔(隔區(qū))。在多個(gè)孔之中，調(diào)制含目標(biāo)核酸一分子或精度管理用多核苷酸一分子的孔(圖4(ii)(b)、(c))。通過(guò)對(duì)分注到孔中的核酸樣品實(shí)施pcr法，在含目標(biāo)核酸一分子或精度管理用多核苷酸一分子的孔中，在其孔中生成核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖4(iii)(b)、(c))。在此外的孔中通常缺目標(biāo)核酸和精度管理用多核苷酸(圖4(ii)(a))、在這樣的孔中即使實(shí)施pcr法也不進(jìn)行核酸擴(kuò)增(圖4(iii)(a))。在實(shí)施方式4中，核酸擴(kuò)增后，將單獨(dú)不顯示信號(hào)、但通過(guò)雜交顯示信號(hào)的檢測(cè)用探針、例如分子信標(biāo)加到孔中，在存在時(shí)在嚴(yán)格的條件下雜交于擴(kuò)增產(chǎn)物。分子信標(biāo)探針是一個(gè)末端被熒光物質(zhì)標(biāo)記化，另一末端被猝滅劑物質(zhì)標(biāo)記化的寡核苷酸，含能與檢測(cè)序列雜交的序列，是可取發(fā)夾型二級(jí)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。分子信標(biāo)探針通過(guò)與檢測(cè)序列雜交，發(fā)夾型二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，可取延伸的結(jié)構(gòu)。由此，標(biāo)記化的熒光物質(zhì)成為能發(fā)熒光的狀態(tài)。在目標(biāo)核酸的情況中，由于檢測(cè)序列是1個(gè)(n＝1)，可雜交一分子的分子信標(biāo)探針。在精度管理用多核苷酸的情況中，由于檢測(cè)序列是2個(gè)(n＝2)，可雜交二分子的分子信標(biāo)探針。在信號(hào)檢測(cè)工序中，向每種孔照射激發(fā)光(λ1)，測(cè)定來(lái)自各孔的熒光信號(hào)(λ2)。在熒光信號(hào)的檢測(cè)中，使用微滴定板讀取器。測(cè)定的熒光信號(hào)強(qiáng)度可反映與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的分子信標(biāo)探針的數(shù)(即，發(fā)熒光可能的熒光物質(zhì)的數(shù))。認(rèn)為含精度管理用多核苷酸一分子的孔中與其擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的分子信標(biāo)探針的數(shù)比含目標(biāo)核酸一分子的孔中與其擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的分子信標(biāo)探針的數(shù)多約2倍。由此雜交的分子信標(biāo)探針的數(shù)的差異，從含精度管理用多核苷酸一分子的孔可得到比從含目標(biāo)核酸一分子的孔得到的熒光信號(hào)強(qiáng)度計(jì)算上強(qiáng)約2倍的熒光信號(hào)強(qiáng)度?；趤?lái)自生成精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的隔區(qū)(孔)的信號(hào)的檢測(cè)結(jié)果，判斷核酸檢測(cè)工序適宜或不適宜。如上所述，當(dāng)判斷為核酸檢測(cè)工序適宜時(shí)，可判斷為目標(biāo)核酸的檢測(cè)結(jié)果有信賴(lài)性。當(dāng)判斷為核酸檢測(cè)工序不適宜時(shí)，可判斷為目標(biāo)核酸的檢測(cè)結(jié)果缺信賴(lài)性。如此，由實(shí)施方式4可管理核酸的檢測(cè)結(jié)果的精度－品質(zhì)。在實(shí)施方式4中，雖作為檢測(cè)用探針使用了分子信標(biāo)探針，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。例如，在實(shí)施方式4的核酸調(diào)制中，也可調(diào)制還含實(shí)施方式3中使用的taqman(商標(biāo))探針及有5’→3’外切核酸酶活性的聚合酶的核酸樣品，將調(diào)制的核酸樣品如實(shí)施方式4所述分注到孔中(隔區(qū)調(diào)制)而核酸擴(kuò)增。在信號(hào)檢測(cè)工序中，核酸擴(kuò)增時(shí)從猝滅劑物質(zhì)隔離而檢測(cè)到來(lái)自發(fā)熒光成為可能的熒光物質(zhì)的熒光信號(hào)。另外，也可使用固定化引物的珠。此時(shí)，可微滴定板1孔收容各1個(gè)珠，與上述同樣地進(jìn)行核酸擴(kuò)增及信號(hào)檢測(cè)。[精度管理用試劑]本發(fā)明的第2實(shí)施方式提供含精度管理用多核苷酸的精度管理用試劑。在第1實(shí)施方式中關(guān)于精度管理用多核苷酸記載的特征也適用于上述試劑中所含的精度管理用多核苷酸。[精度管理用試劑盒]在本發(fā)明的第3實(shí)施方式之一的實(shí)施方式中，精度管理用試劑盒含收容精度管理用多核苷酸的試劑容器。此外，也可適宜含收容上述引物組、上述檢測(cè)用探針、聚合酶、dntps等必要的試劑的試劑容器。再者，也可含記載試劑的使用方法等的附帶文書(shū)。圖10是顯示本實(shí)施方式的精度管理用試劑盒的一例的模式圖。此試劑盒含收容精度管理用多核苷酸的試劑容器11；收容第1引物的試劑容器12；收容第2引物的試劑容器13；收容檢測(cè)用探針的試劑容器14；收容聚合酶的試劑容器15；收容核苷三磷酸(dntps)的試劑容器16；及附帶文書(shū)18。試劑容器11～16及附帶文書(shū)18收容到盒17中。在圖10所示的試劑盒中，各自的試劑類(lèi)被收容到不同的容器中，但對(duì)于即使共存也對(duì)核酸擴(kuò)增及信號(hào)檢測(cè)無(wú)問(wèn)題的試劑而言，也可收容到相同容器內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可適宜選擇共存何種試劑。例如，第1引物、第2引物及dntps可收容到相同容器內(nèi)。在本說(shuō)明書(shū)中，關(guān)于精度管理用多核苷酸及檢測(cè)用探針記載的特征也適用于上述試劑盒中所含的精度管理用多核苷酸及檢測(cè)用探針。本發(fā)明之一的實(shí)施方式是精度管理用多核苷酸用于上述的精度管理用試劑或精度管理用試劑盒的制造的用途。關(guān)于精度管理用試劑、精度管理用試劑盒、及精度管理用多核苷酸的特征如上所述。本發(fā)明之一的實(shí)施方式是本發(fā)明的第1實(shí)施方式涉及的核酸擴(kuò)增的精度管理方法中的，上述的精度管理用多核苷酸、精度管理用試劑或精度管理用試劑盒的使用。其他實(shí)施方式是用于在本發(fā)明的第1實(shí)施方式涉及的核酸擴(kuò)增的精度管理方法中使用的，上述的精度管理用多核苷酸、精度管理用試劑及精度管理用試劑盒。關(guān)于精度管理用試劑、精度管理用試劑盒、精度管理用多核苷酸、及精度管理方法的特征如上所述。以下，記載具體的實(shí)施例，但它們顯示本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，不以任何方式限定隨附的專(zhuān)利權(quán)利要求中記載的發(fā)明。從本說(shuō)明書(shū)中記載的具體的實(shí)施方式、材料、組合物及方法容易識(shí)別的均等物、或者變更、改變或變形在本發(fā)明的范圍內(nèi)。【實(shí)施例】在實(shí)施例中，使用以下的試劑、裝置及解析軟件。<試劑>phusionii熱啟動(dòng)高保真度dna聚合酶(thermoscientific公司)鉑taqdna聚合酶(lifetechonologies公司)quantitpicogreendsdna測(cè)定試劑盒(lifetechnologies)脫氧核苷三磷酸(各10mmol/l、lifetechnologies)10xpcr緩沖液(670mmol/ltris-hclph8.8、166mmol/l硫化銨、100mmol/l2-巰基乙醇、11.7mmol/l氯化鎂)emulsifire(7％(v/v)abilwe09,20％(v/v)礦物油,73％(v/v)tegosoftdec)te緩沖液ph7.5(10mmol/ltris-hclph7.0,1mmol/l乙二胺四醋酸)breaking緩沖液(10mmol/ltris-hclph7.5、1％tritonx-100、1％十二烷基硫酸鈉、100mmol/l氯化鈉、1mmol/l乙二胺四醋酸)0.1mol/l氫氧化鈉tk緩沖液(20mmol/ltris-hclph8.4,50mmol/l氯化鉀)5x雜交緩沖液(75mmol/ltris-hclph9.5、33.5mmol/l氯化鎂、25％甲酰胺)dynabeadsmyone鏈霉親和素c1(dynal)不銹鋼珠(5mm)<裝置>veriti熱循環(huán)儀(appliedbiosystems公司)bdaccuric6流式細(xì)胞儀(becktondickinson公司)<解析軟件>flowjo(flowjo公司)[實(shí)施例1]<kras擴(kuò)增樣品dna的調(diào)制>調(diào)制將含野生型人kras的基因序列的質(zhì)粒和含變異型人krasc.38g>a的基因序列的質(zhì)粒以99:1的比率混合的dna樣品。將調(diào)制的dna樣品使用phusionii高保真度dna聚合酶(thermoscientific公司)及表1中顯示的引物組由pcr法擴(kuò)增。pcr反應(yīng)使用veriti熱循環(huán)儀(appliedbiosystems公司)實(shí)施。以下，對(duì)于實(shí)施pcr反應(yīng)而言，同樣地使用veriti熱循環(huán)儀?！颈?】表2示野生型人kras基因的外顯子2(seqidno：(8)及變異型人krasc.38g>a基因的外顯子2(seqidno：(9)。由上述pcr反應(yīng)，表2中顯示的序列中，大文字中顯示的序列部分由使用表1中顯示的引物組的上述pcr擴(kuò)增。表2中顯示的序列中，加下劃線的區(qū)域示后述的檢測(cè)序列，由四邊形框圍起來(lái)的區(qū)域示能雜交后述的共探針的區(qū)域?！颈?】得到的擴(kuò)增產(chǎn)物使用picogreen熒光嵌入劑定量(quantitpicogreendsdna測(cè)定試劑盒(lifetechnologies))。以下，將上述擴(kuò)增產(chǎn)物稱(chēng)為“kras擴(kuò)增樣品dna”。<精度管理用多核苷酸的調(diào)制>作為精度管理用多核苷酸，調(diào)制含seqidno：10～seqidno：15的各序列的單鏈dna。上述單鏈dna由β-氰基乙基氨基亞磷酸酯法各自化學(xué)合成。將合成的各dna使用phusionii高保真度dna聚合酶(thermoscientific公司)及表1中顯示的引物組，由pcr法各自擴(kuò)增。純化各擴(kuò)增產(chǎn)物，使用紫外吸光法各自定量。上述擴(kuò)增產(chǎn)物各自，如下所述命名(表3)。各精度管理用多核苷酸含表3中顯示的數(shù)的野生型(wt)及變異型(mut)人kras基因序列中的檢測(cè)序列(以下也各自稱(chēng)為“wt檢測(cè)序列”及“mut檢測(cè)序列”)。wt檢測(cè)序列是在表2中顯示的seqidno：8的序列中加下劃線的序列，mut檢測(cè)序列是在表2中顯示的seqidno：9的序列中加下劃線的序列。在表3中，檢測(cè)序列加下劃線而表示?！颈?】<引物結(jié)合磁性珠的調(diào)制>調(diào)制有seqidno：1的序列(5’-tcccgcgaaattaatacgac-3’)的單鏈dna。在上述單鏈dna的5’末端結(jié)合生物素二聚體，調(diào)制生物素化引物。將上述生物素化引物加到用鏈霉親和素修飾的磁性珠(dynabeadsmyone鏈霉親和素c1(dynal))，使上述引物結(jié)合于上述磁性珠，調(diào)制引物結(jié)合磁性珠。清洗上述引物結(jié)合磁性珠，除去未結(jié)合的生物素化引物。<beaming法>由作為利用磁性珠的液滴型的數(shù)字pcr的beaming(beads，emulsions，amplificationandmagnetics)法，進(jìn)行核酸擴(kuò)增。調(diào)制以下顯示的pcr反應(yīng)溶液(濃度是終濃度)。kras擴(kuò)增樣品dna1×107拷貝精度管理用多核苷酸(wt，n＝5)100,000拷貝10×pcr緩沖液1.6μl脫氧核苷三磷酸(dntps)0.2mmol/l正向引物5(seqidno：1：5’-tcccgcgaaattaatacgac-3’)50fmol/l反向引物6(seqidno：2：5’-gctggagctctgcagcta-3’)8pmol/l引物結(jié)合磁性珠0.64μltaqdna聚合酶(lifetechnologies公司)5單位容量16μl接下來(lái)，向此pcr反應(yīng)溶液添加64μl的emulsifire(7％(v/v)abilwe09、20％(v/v)礦物油、73％(v/v)tegosoftdec)。通過(guò)將上述溶液在不銹鋼珠(5mm)存在下顛倒混合，形成乳液。對(duì)于上述乳液，進(jìn)行接下來(lái)顯示的條件的pcr反應(yīng)。步驟熱變性退火延伸循環(huán)數(shù)194℃，2分鐘298℃，15秒鐘64℃，45秒鐘72℃，75秒鐘3398℃，15秒鐘61℃，45秒鐘72℃，75秒鐘3498℃，15秒鐘58℃，45秒鐘72℃，75秒鐘3598℃，15秒鐘57℃，45秒鐘72℃，75秒鐘50其中，結(jié)合于上述引物結(jié)合磁性珠的引物與上述pcr反應(yīng)溶液中使用的正向引物5有相同的序列(seqidno：1記載的序列)。由上述pcr，例如，從結(jié)合于磁性珠的引物，以與該引物雜交的kras擴(kuò)增樣品dna作為模板延伸其互補(bǔ)鏈。由此，得到結(jié)合kras擴(kuò)增樣品dna的擴(kuò)增產(chǎn)物的磁性珠。<檢測(cè)用探針溶液的調(diào)制>各自調(diào)制含表4中顯示的序列編號(hào)的序列的單鏈dna。使表4中顯示的熒光物質(zhì)各自結(jié)合于上述單鏈dna的各5’末端，調(diào)制用熒光物質(zhì)標(biāo)記的檢測(cè)用探針。其中，共探針還能與使用表1中顯示的引物組擴(kuò)增的野生型和變異型的人kras基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的任何雜交，seqidno：5的序列含與上述擴(kuò)增產(chǎn)物的雙方共同的序列互補(bǔ)的序列(參照表2中顯示的序列中，由四邊形框圍起來(lái)的序列)。wt檢測(cè)用探針能與由上述引物組擴(kuò)增的野生型的人kras基因的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，seqidno：6的序列含與wt檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列。mut檢測(cè)用探針能與由上述引物組擴(kuò)增的變異型的人kras基因的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，seqidno：7的序列含與mut檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列?！颈?】探針名序列編號(hào)序列5’→3’熒光物質(zhì)共探針seqidno：5tgacgatacagctaattcacy3wt檢測(cè)用探針seqidno：6tgctggtggcgtaggcfammut檢測(cè)用探針seqidno：7tgctggtgacgtaggccy5向雜交溶液添加調(diào)制的3種檢測(cè)用探針至各探針的終濃度成0.1μmol/l，調(diào)制檢測(cè)用探針溶液(合計(jì)探針濃度0.3μmol/l)。<磁性珠的回收及與檢測(cè)用探針的雜交>將含結(jié)合由pcr反應(yīng)合成的擴(kuò)增核酸的磁性珠的上述乳液使用breaking緩沖液(10mmol/ltris-hclph7.5、1％tritonx-100、1％十二烷基硫酸鈉、100mmol/l氯化鈉、1mmol/l乙二胺四醋酸)破壞，回收上述磁性珠。將回收的磁性珠用0.1mol/l氫氧化鈉處理，清洗。將清洗后的磁性珠懸浮于上述檢測(cè)用探針溶液。將懸浮液于50℃處理15分鐘，使上述磁性珠上的擴(kuò)增核酸和上述檢測(cè)用探針雜交。此后，將上述磁性珠使用tk緩沖液(20mmol/ltris-hclph8.4、50mmol/l氯化鉀)清洗，懸浮于tk緩沖液中。<流式細(xì)胞術(shù)解析>將上述懸浮液中的磁性珠由bdaccuric6流式細(xì)胞儀(becktondickinson公司)測(cè)定。在此實(shí)施例中，由流式細(xì)胞儀(fcm)測(cè)定而得到關(guān)于磁性珠的信號(hào)(前方散射光及測(cè)定散射光)，再得到關(guān)于擴(kuò)增核酸的信號(hào)(檢測(cè)用探針及共探針來(lái)源的熒光)。在實(shí)施例中，將共探針(cy3標(biāo)記)來(lái)源的熒光用上述流式細(xì)胞儀的fl2通道接收，由fl1通道接收wt檢測(cè)用探針(fam標(biāo)記)來(lái)源的熒光，由fl4通道接收mut檢測(cè)用探針(cy5標(biāo)記)來(lái)源的熒光。基于得到的前方散射及側(cè)方散射，挑選反映非凝集性的磁性珠的測(cè)定數(shù)據(jù)。再者，基于共探針(cy3標(biāo)記)來(lái)源的熒光信號(hào)(lf2通道)，確認(rèn)為是結(jié)合kras擴(kuò)增樣品dna的擴(kuò)增產(chǎn)物的磁性珠。實(shí)施例中使用的精度管理用多核苷酸不含共探針能雜交的區(qū)域，但利用含比kras擴(kuò)增樣品dna多數(shù)倍的檢測(cè)序列，能排除磁性珠來(lái)源的自身熒光。例如，在結(jié)合了精度管理用多核苷酸(wt,n＝5)的擴(kuò)增產(chǎn)物的磁性珠中，如后所述，計(jì)算上可結(jié)合5倍于結(jié)合kras擴(kuò)增樣品dna的擴(kuò)增產(chǎn)物的磁性珠的數(shù)的wt檢測(cè)用探針(fam標(biāo)記)。結(jié)果，從結(jié)合精度管理用多核苷酸(wt,n＝5)的擴(kuò)增產(chǎn)物的磁性珠得到數(shù)倍強(qiáng)的fam熒光信號(hào)強(qiáng)度。由此強(qiáng)的fma熒光信號(hào)強(qiáng)度，發(fā)生向lf2通道的漏溢。通過(guò)利用此fam熒光信號(hào)的向lf2通道的漏溢，可確認(rèn)是結(jié)合精度管理用多核苷酸(wt,n＝5)的擴(kuò)增產(chǎn)物的磁性珠。通過(guò)使用共探針，在存在時(shí)可排除磁性珠來(lái)源的自身熒光，更高精度地進(jìn)行kras擴(kuò)增樣品dna的分析變得可能。另外，利用精度管理用多核苷酸中存在的檢測(cè)序列和與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的合計(jì)數(shù)與目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物中存在的檢測(cè)序列和與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的合計(jì)數(shù)不同，在存在時(shí)還能排除磁性珠來(lái)源的自身熒光。對(duì)于挑選的測(cè)定數(shù)據(jù)，制成在x軸分配mut檢測(cè)用探針來(lái)源的熒光信號(hào)強(qiáng)度，在y軸分配wt檢測(cè)用探針來(lái)源的熒光信號(hào)強(qiáng)度的2d散點(diǎn)圖(圖5a)。在制成的2d散點(diǎn)圖中，各自計(jì)數(shù)對(duì)應(yīng)于發(fā)wt檢測(cè)用探針來(lái)源的熒光的磁性珠的區(qū)內(nèi)的點(diǎn)數(shù)(對(duì)應(yīng)于顯示野生型kras基因的存在的磁性珠的個(gè)數(shù))、及對(duì)應(yīng)于發(fā)mut檢測(cè)用探針來(lái)源的熒光的磁性珠的區(qū)內(nèi)的點(diǎn)數(shù)(對(duì)應(yīng)于顯示變異型kras基因的存在的磁性珠的個(gè)數(shù))。在圖5a中，將2d散點(diǎn)圖分成4個(gè)區(qū)(q1～q4)、在各區(qū)表示計(jì)數(shù)的各區(qū)的點(diǎn)數(shù)相對(duì)于2d散點(diǎn)圖中的點(diǎn)總數(shù)的比例(％)。以下同樣地，在2d散點(diǎn)圖中表示各區(qū)(q1～q4)中的點(diǎn)的比例。[比較例1]在比較例1中，除了調(diào)制未添加精度管理用多核苷酸(wt,n＝5)的pcr反應(yīng)溶液之外，用與實(shí)施例1基本上相同的方法，進(jìn)行beaming法、磁性珠的回收、雜交、及流式細(xì)胞術(shù)(fcm)解析(圖5b)。在顯示實(shí)施例1(含精度管理用多核苷酸(wt,n＝5)(+))的結(jié)果的圖5a中，在y軸的值是3×103～1×104[事件]之間觀察到多數(shù)的點(diǎn)(實(shí)線圓圍起來(lái)的區(qū))。在顯示比較例1(不含精度管理用多核苷酸(wt,n＝5)(-))的結(jié)果的圖5b中也同樣地，在y軸的值是3×103～1×104[事件]之間觀察到多數(shù)的點(diǎn)(實(shí)線圓圍起來(lái)的區(qū))。此區(qū)內(nèi)的點(diǎn)集團(tuán)顯示，wt檢測(cè)用探針(fam標(biāo)記)來(lái)源的熒光信號(hào)強(qiáng)度比較強(qiáng)，一方面，mut檢測(cè)用探針(cy5標(biāo)記)來(lái)源的熒光信號(hào)強(qiáng)度比較弱。由此提示，對(duì)應(yīng)于此區(qū)內(nèi)的點(diǎn)的磁性珠反映dna樣品中的野生型kras基因的存在。其中，可算出相對(duì)于2d散點(diǎn)圖中的點(diǎn)總數(shù)的此區(qū)內(nèi)的點(diǎn)數(shù)的比例([區(qū)內(nèi)的點(diǎn)數(shù)]/[點(diǎn)總數(shù)]×100)。上述比例可反映試驗(yàn)的dna樣品中的野生型kras基因的含有率。在實(shí)施例1中，使用將含野生型人kras的基因序列的質(zhì)粒和含變異型人krasc.38g>a的基因序列的質(zhì)粒以99:1的比率混合的dna樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物。在圖5a及圖5b的2d散點(diǎn)圖中，在x軸的值是1×104～3×104之間觀察到點(diǎn)集團(tuán)(被實(shí)線四角形圍起來(lái)的區(qū))。此區(qū)內(nèi)的點(diǎn)集團(tuán)顯示，mut檢測(cè)用探針(cy5標(biāo)記)來(lái)源的熒光信號(hào)強(qiáng)度比較強(qiáng)，一方面，wt檢測(cè)用探針(fam標(biāo)記)來(lái)源的熒光信號(hào)強(qiáng)度比較弱。由此提示，對(duì)應(yīng)于此區(qū)內(nèi)的點(diǎn)的磁性珠反映dna樣品中的變異型kras基因的存在。如上所述，可算出相對(duì)于2d散點(diǎn)圖中的點(diǎn)總數(shù)的此區(qū)內(nèi)的點(diǎn)數(shù)的比例。上述比例可反映試驗(yàn)的dna樣品中的變異型kras基因的含有率。在圖5a(精度管理用多核苷酸(wt,n＝5)(+))中，在y軸的值是1×104～3×104之間觀察到能與y軸的值是3×103～1×104之間的實(shí)線圓圍起來(lái)的區(qū)中存在的點(diǎn)集團(tuán)區(qū)別的點(diǎn)集團(tuán)(虛線圓圍起來(lái)的區(qū))。在圖5b(精度管理用多核苷酸(mut,n＝5)(-))中，對(duì)應(yīng)于圖5a的虛線圓圍起來(lái)的區(qū)的區(qū)觀察不到點(diǎn)。圖5a的虛線圓圍起來(lái)的區(qū)內(nèi)的點(diǎn)集團(tuán)顯示，wt檢測(cè)用探針(fam標(biāo)記)來(lái)源的熒光信號(hào)強(qiáng)度比實(shí)線圓圍起來(lái)的區(qū)內(nèi)的點(diǎn)集團(tuán)顯示的熒光信號(hào)強(qiáng)度大數(shù)倍。這提示，對(duì)應(yīng)于圖5a、b的虛線圓圍起來(lái)的區(qū)的點(diǎn)的磁性珠比對(duì)應(yīng)于實(shí)線圓圍起來(lái)的區(qū)的點(diǎn)的磁性珠，以數(shù)倍多種wt檢測(cè)用探針雜交。從而理解，圖5a的虛線圓圍起來(lái)的區(qū)內(nèi)的點(diǎn)集團(tuán)可反映結(jié)合了有5個(gè)wt檢測(cè)用探針能雜交的檢測(cè)序列的精度管理用多核苷酸(wt,n＝5)的擴(kuò)增產(chǎn)物的磁性珠。理解圖5a、b的實(shí)線圓圍起來(lái)的區(qū)內(nèi)的點(diǎn)集團(tuán)可反映結(jié)合了有1個(gè)wt檢測(cè)用探針能雜交的檢測(cè)序列的野生型的kras擴(kuò)增dna的擴(kuò)增產(chǎn)物的磁性珠。[實(shí)施例2及比較例2]在實(shí)施例2中，除了調(diào)制代替精度管理用多核苷酸(wt,n＝5)而使用精度管理用多核苷酸(mut,n＝5)的pcr反應(yīng)溶液之外，用與實(shí)施例1基本上相同的方法，進(jìn)行beaming法、磁性珠的回收、雜交、及fcm解析(圖6a)。在比較例2中，除了調(diào)制未添加精度管理用多核苷酸(mut,n＝5)的pcr反應(yīng)溶液之外，用與實(shí)施例2實(shí)質(zhì)上相同的方法，進(jìn)行beaming法、磁性珠的回收、雜交、及fcm解析(圖6b)。實(shí)施例2及比較例2的結(jié)果，與實(shí)施例1及比較例1的結(jié)果同樣地，在反映dna樣品中的野生型kras基因的存在的區(qū)內(nèi)觀察到多數(shù)的點(diǎn)(圖6a及b、實(shí)線圓圍起來(lái)的區(qū))、另外，在反映變異型kras基因的存在的區(qū)內(nèi)觀察到點(diǎn)集團(tuán)(圖6a及b、被實(shí)線四角形圍起來(lái)的區(qū))。在圖6a(精度管理用多核苷酸(mut,n＝5)(+))中，在x軸的值是3×104～6×105之間的被虛線四角形圍起來(lái)的區(qū)觀察到能與x軸的值是1×104～2×104之間的被實(shí)線四角形圍起來(lái)的區(qū)中存在的點(diǎn)集團(tuán)區(qū)別的點(diǎn)集團(tuán)。在圖6b(精度管理用多核苷酸(mut,n＝5)(-))中，在對(duì)應(yīng)于圖6a的被虛線四角形圍起來(lái)的區(qū)的區(qū)中觀察不到點(diǎn)。圖6a的被虛線四角形圍起來(lái)的區(qū)內(nèi)的點(diǎn)集團(tuán)顯示，mut檢測(cè)用探針(cy5標(biāo)記)來(lái)源的熒光信號(hào)強(qiáng)度比被實(shí)線四角形圍起來(lái)的區(qū)內(nèi)的點(diǎn)集團(tuán)顯示的熒光信號(hào)強(qiáng)度大數(shù)倍。這提示，圖6a、b的對(duì)應(yīng)于被虛線四角形圍起來(lái)的區(qū)的點(diǎn)的磁性珠比對(duì)應(yīng)于被實(shí)線四角形圍起來(lái)的區(qū)的點(diǎn)的磁性珠，以數(shù)倍多種mut檢測(cè)用探針雜交。理解圖6a的被虛線四角形圍起來(lái)的區(qū)內(nèi)的點(diǎn)集團(tuán)可反映結(jié)合了有5個(gè)mut檢測(cè)用探針能雜交的檢測(cè)序列的精度管理用多核苷酸(mut,n＝5)的擴(kuò)增產(chǎn)物的磁性珠。理解圖6a、b的被實(shí)線四角形圍起來(lái)的區(qū)內(nèi)的點(diǎn)集團(tuán)可反映結(jié)合了有1個(gè)mut檢測(cè)用探針能雜交的檢測(cè)序列的變異型的kras擴(kuò)增dna的擴(kuò)增產(chǎn)物的磁性珠。從實(shí)施例1及實(shí)施例2的結(jié)果可理解，由本發(fā)明之一的實(shí)施方式涉及的核酸擴(kuò)增的精度管理方法，為了使用能使用與用于擴(kuò)增目標(biāo)核酸的引物組相同的引物組核酸擴(kuò)增，可使用與用于檢測(cè)目標(biāo)核酸來(lái)源的擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)用探針相同的檢測(cè)用探針與目標(biāo)核酸來(lái)源的擴(kuò)增產(chǎn)物能區(qū)別地檢測(cè)的精度管理用多核苷酸，能判斷包括核酸調(diào)制、隔區(qū)調(diào)制、核酸擴(kuò)增及信號(hào)檢測(cè)的一系列的工序是否適宜。另外，從實(shí)施例1及實(shí)施例2的結(jié)果理解，本發(fā)明之一的實(shí)施方式涉及的精度管理用多核苷酸也能在變異檢測(cè)的精度管理方法中使用。[實(shí)施例3]<精度管理用多核苷酸的拷貝數(shù)和fcm檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度的相關(guān)關(guān)系>在實(shí)施例1的pcr反應(yīng)溶液中，各自添加25,000拷貝、50,000拷貝、100,000拷貝、200,000拷貝、400,000拷貝、800,000拷貝精度管理用多核苷酸(wt,n＝5)，用與實(shí)施例1基本上相同的方法，進(jìn)行beaming法、磁性珠的回收、雜交、及fcm解析。還用flowjo軟件(flowjo公司)解析用fcm解析得到的數(shù)據(jù)，算出pcr反應(yīng)后的各精度管理用多核苷酸來(lái)源的熒光信號(hào)強(qiáng)度的平均值(圖7a)。圖7a顯示，在x軸分配添加的精度管理用多核苷酸的拷貝數(shù)，在y軸分配用fcm測(cè)定檢測(cè)的熒光信號(hào)強(qiáng)度的分布圖。圖7a中的虛線示回歸直線，其方程式是y＝0.0098x-357。圖7a顯示可對(duì)應(yīng)于添加的精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的量的熒光信號(hào)強(qiáng)度與添加的精度管理用多核苷酸的拷貝數(shù)成比例地增加。同樣地，在實(shí)施例2的pcr反應(yīng)溶液中，各自添加25,000拷貝、50,000拷貝、100,000拷貝、200,000拷貝、400,000拷貝、800,000拷貝精度管理用多核苷酸(mut,n＝5)，用與實(shí)施例2基本上相同的方法，進(jìn)行beaming法、磁性珠的回收、雜交、及fcm解析。還用flowjo軟件(flowjo公司)解析用fcm解析得到的數(shù)據(jù)，算出pcr反應(yīng)后的各精度管理用多核苷酸來(lái)源的熒光信號(hào)強(qiáng)度的平均值(圖7b)。圖7b顯示在x軸分配添加的精度管理用多核苷酸的拷貝數(shù)，在y軸分配用fcm測(cè)定檢測(cè)的熒光信號(hào)強(qiáng)度的分布圖。圖7b中的虛線顯示回歸直線，其方程式是y＝0.011x-68。圖7b也另外顯示，可對(duì)應(yīng)于添加的精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的量的熒光信號(hào)強(qiáng)度與添加的精度管理用多核苷酸的拷貝數(shù)成比例地增加。如圖7a、b所示，在添加的精度管理用多核苷酸的拷貝數(shù)和用fcm檢測(cè)的熒光信號(hào)強(qiáng)度之間有正的相關(guān)。結(jié)果證實(shí)使用本發(fā)明涉及的精度管理用多核苷酸的核酸擴(kuò)增的精度管理方法的定量性。[實(shí)施例4]<精度管理用多核苷酸中的檢測(cè)序列的數(shù)和fcm檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度的相關(guān)關(guān)系>調(diào)制各自含40,000拷貝精度管理用多核苷酸(wt,n＝5)、(wt,n＝4)、(wt,n＝3)、(wt,n＝2)的pcr反應(yīng)溶液、及不含精度管理用多核苷酸的pcr反應(yīng)溶液(野生型人kras基因中的wt檢測(cè)序列的數(shù)(n)＝1)，用與實(shí)施例1基本上相同的方法，進(jìn)行beaming法、磁性珠的回收、雜交、及fcm解析。還用flowjo軟件解析用fcm解析得到的數(shù)據(jù)，算出pcr反應(yīng)后的各精度管理用多核苷酸來(lái)源的熒光信號(hào)強(qiáng)度的平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差(sd)(圖8)。圖8顯示，在x軸分配wt檢測(cè)序列的數(shù)，在y軸分配wt檢測(cè)用探針(fam標(biāo)記)來(lái)源的熒光信號(hào)強(qiáng)度的箱形圖。在箱形圖中，箱的兩端表示平均值±1sd，須兩端表示平均值±3sd。如圖8所示，理解在可對(duì)應(yīng)于擴(kuò)增的精度管理用多核苷酸中的檢測(cè)序列的數(shù)的熒光信號(hào)強(qiáng)度與精度管理用多核苷酸中的檢測(cè)序列的數(shù)之間有正的相關(guān)。在實(shí)施例4中，將顯示能互相區(qū)別檢測(cè)精度管理用多核苷酸的基準(zhǔn)，例如，作為熒光信號(hào)強(qiáng)度的平均值±1sd不重疊，參照?qǐng)D8所示的結(jié)果。在假定目標(biāo)核酸中存在1個(gè)檢測(cè)序列時(shí)(n＝1)、提示如果在精度管理用多核苷酸中至少存在2個(gè)檢測(cè)序列(n≥2)、使用1種檢測(cè)用探針能區(qū)別檢測(cè)上述目標(biāo)核酸和上述精度管理用多核苷酸?；谕瑯拥幕鶞?zhǔn)，可理解在假定例如存在2個(gè)目標(biāo)核酸檢測(cè)序列時(shí)(n＝2)、為了區(qū)別上述目標(biāo)核酸和精度管理用多核苷酸，也可存在在精度管理用多核苷酸中1個(gè)檢測(cè)序列(n＝1)、或者也可存在至少3個(gè)檢測(cè)序列(n≥3)。從實(shí)施例4理解，使用本發(fā)明之一的實(shí)施方式涉及的精度管理用多核苷酸的核酸擴(kuò)增的精度管理方法通過(guò)使用與目標(biāo)核酸中可存在的檢測(cè)序列和與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的合計(jì)數(shù)不同的合計(jì)數(shù)的檢測(cè)序列和含與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列的精度管理用多核苷酸，使用1種檢測(cè)用探針能互相區(qū)別檢測(cè)。[實(shí)施例5及比較例3]在實(shí)施例5中，除了代替在實(shí)施例1的pcr反應(yīng)溶液中添加100,000拷貝的精度管理用多核苷酸(wt,n＝5)而添加50,000拷貝的精度管理用多核苷酸(wt,n＝6)之外，用與實(shí)施例1基本上相同的方法，進(jìn)行beaming法、磁性珠的回收、雜交、及fcm解析(圖9a)。在比較例3中，除了調(diào)制未添加精度管理用多核苷酸(wt,n＝6)的pcr反應(yīng)溶液之外，用與實(shí)施例5基本上相同的方法進(jìn)行beaming法、磁性珠的回收、雜交、及fcm解析(圖9b)。在圖9a(精度管理用多核苷酸(wt,n＝6)(+))中，在y軸的值是約1.5×104～約3×104之間的虛線圓圍起來(lái)的區(qū)中觀察到能與y軸的值是約3×103～約1×104之間的實(shí)線圓圍起來(lái)的區(qū)中存在的多數(shù)的點(diǎn)區(qū)別的點(diǎn)集團(tuán)。在圖9b(精度管理用多核苷酸(wt,n＝6)(-))中，在對(duì)應(yīng)于圖9a的虛線圓圍起來(lái)的區(qū)的區(qū)中觀察不到點(diǎn)。圖9a的虛線圓圍起來(lái)的區(qū)內(nèi)的點(diǎn)集團(tuán)顯示，wt檢測(cè)用探針(fam標(biāo)記)來(lái)源的熒光信號(hào)強(qiáng)度比實(shí)線圓圍起來(lái)的區(qū)內(nèi)的點(diǎn)集團(tuán)顯示的熒光信號(hào)強(qiáng)度大數(shù)倍。這提示，圖9a、b的對(duì)應(yīng)于虛線圓圍起來(lái)的區(qū)的點(diǎn)的磁性珠比對(duì)應(yīng)于實(shí)線圓圍起來(lái)的區(qū)的點(diǎn)的磁性珠，以數(shù)倍多種wt檢測(cè)用探針雜交。理解圖9a的虛線圓圍起來(lái)的區(qū)內(nèi)的點(diǎn)集團(tuán)可反映結(jié)合了有6個(gè)wt檢測(cè)用探針能雜交的檢測(cè)序列的精度管理用多核苷酸(wt,n＝6)的擴(kuò)增產(chǎn)物的珠。理解圖9a、b的實(shí)線圓圍起來(lái)的區(qū)內(nèi)的點(diǎn)集團(tuán)可反映結(jié)合了有1個(gè)wt檢測(cè)用探針能雜交的檢測(cè)序列的野生型的kras擴(kuò)增dna的擴(kuò)增產(chǎn)物的磁性珠。實(shí)施例5中使用的對(duì)照多核苷酸(wt,n＝6)是，wt檢測(cè)序列之間的間隔子序列是2bp(參照表3、seqidno：15的序列中，加下劃線的檢測(cè)序列間的堿基的數(shù)(鏈長(zhǎng)))。在實(shí)施例1～4中使用的對(duì)照多核苷酸(wt,n＝5)、(wt,n＝4)、(wt,n＝3)、(wt,n＝2)、及(mut,n＝5)中，各檢測(cè)序列之間的間隔子序列是5bp(參照表3、seqidno：10～14的序列中，加下劃線的檢測(cè)序列間的鏈長(zhǎng))。從實(shí)施例5的結(jié)果理解，使用本發(fā)明之一的實(shí)施方式涉及的精度管理用多核苷酸的核酸擴(kuò)增的精度管理方法，即使檢測(cè)序列或與上述檢測(cè)序列互補(bǔ)的序列間的間隔子序列是2bp，也能將精度管理用多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物與目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)別檢測(cè)。?序列表<110>sysmexcorporation<120>核酸擴(kuò)增的精度管理方法、精度管理用試劑及其試劑盒<130>15-051cn<160>15<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物5<400>1tcccgcgaaattaatacgac20<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物6<400>2gctggagctctgcagcta18<210>3<211>45<212>dna<213>人工序列<220><223>引物1<400>3gctggagctctgcagctatgactgaatataaacttgtggtagttg45<210>4<211>43<212>dna<213>人工序列<220><223>引物2<400>4tcccgcgaaattaatacgaccatattcgtccacaaaatgattc43<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>共探針<400>5tgacgatacagctaattca19<210>6<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>wt探針<400>6tgctggtggcgtaggc16<210>7<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>突變型探針<400>7tgctggtgacgtaggc16<210>8<211>122<212>dna<213>智人（homosapiens）<400>8ctctattgttggatcatattcgtccacaaaatgattctgaattagctgtatcgtcaaggc60actcttgcctacgccaccagctccaactaccacaagtttatattcagtcattttcagcag120gc122<210>9<211>122<212>dna<213>智人（homosapiens）<400>9ctctattgttggatcatattcgtccacaaaatgattctgaattagctgtatcgtcaaggc60actcttgcctacgtcaccagctccaactaccacaagtttatattcagtcattttcagcag120gc122<210>10<211>158<212>dna<213>人工序列<220><223>串聯(lián)dna,n=5(obq_r050-04)<400>10tcatattcgtccacaaaatgattcagatgcctacgccaccagctatcagcctacgccacc60agctcagtgcctacgccaccagctactagcctacgccaccagctatgagcctacgccacc120agctacgatgcaactaccacaagtttatattcagtcat158<210>11<211>158<212>dna<213>人工序列<220><223>串聯(lián)dna,n=4(obq_r040-11)<400>11tcatattcgtccacaaaatgattcagatgcctacgccaccagctatcagcctacgccacc60agctcagtgcctacgccaccagctactagcctacgccaccagctatgaacctctattgtt120ggatacgatgcaactaccacaagtttatattcagtcat158<210>12<211>158<212>dna<213>人工序列<220><223>串聯(lián)dna,n=3(obq_r030-12)<400>12tcatattcgtccacaaaatgattcagatgcctacgccaccagctatcagcctacgccacc60agctcagtgcctacgccaccagctactatattaaaacaagatttatgaacctctattgtt120ggatacgatgcaactaccacaagtttatattcagtcat158<210>13<211>158<212>dna<213>人工序列<220><223>串聯(lián)dna,n=2(obq_r020-13)<400>13tcatattcgtccacaaaatgattcagatgcctacgccaccagctatcagcctacgccacc60agctcagtgcaccagtaatatgcaactatattaaaacaagatttatgaacctctattgtt120ggatacgatgcaactaccacaagtttatattcagtcat158<210>14<211>150<212>dna<213>人工序列<220><223>串聯(lián)dna,n=5,突變型(obq_r005-03)<400>14tcatattcgtccacaaaatgattctgcctacgtcaccagctatcagcctacgtcaccagc60tcagtgcctacgtcaccagctactagcctacgtcaccagctatgagcctacgtcaccagc120tccaactaccacaagtttatattcagtcat150<210>15<211>155<212>dna<213>人工序列<220><223>串聯(lián)dna,n=6(obq_r060-01)<400>15tcatattcgtccacaaaatgattctgcctacgccaccagctagcctacgccaccagcttg60cctacgccaccagctggcctacgccaccagctcgcctacgccaccagctagcctacgcca120ccagctccaactaccacaagtttatattcagtcat155當(dāng)前第1頁(yè)12