本公開涉及生物工程領域，具體地，涉及一種臍帶膠原活性肽組合物及其制備方法。
背景技術：
：膠原是哺乳動物體內含量最多的蛋白質，是細胞外間質中的主要成分,占蛋白質總量的25％～30％，相當于體重的6％。膠原蛋白可作為表皮細胞遷移、增殖的支架，促進皮膚細胞的增生修復和愈合，結合大量的水分維持皮膚張力；可促進骨的形成，增強低鈣水平下的骨膠原結構；還可吸附腸道中的毒素和重鈣離子，降低血清甘油三脂和膽固醇。但是膠原是一種高分子蛋白質，平均分子量在30萬至幾百萬道爾頓之間，生物利用度很低。利用生物酶技術將膠原小分子化而得到的膠原肽及多肽是膠原蛋白的結構與功能片段，且分子量小，相容性良好，并可以提高生物利用度，因而被作為生物醫(yī)藥、化妝品及保健品的原料、輔材或添加劑。臍帶是哺乳動物連接胎兒和胎盤的管狀結構，由兩條動脈和一條靜脈構成，在血管周圍有半透明的基質，稱華通膠。華通膠為含水量豐富來自胚外中胚層的膠樣胚胎結締組織，具有保護血管的作用，組織學檢查可見其中含有大量的膠原及彈力纖維。華通膠組織中還存在著豐富的臍帶間充質干細胞。臍帶間充質干細胞可分泌包括egf、vegf、fgf在內的多種細胞因子來發(fā)揮生物學效應。不同于動物骨中的膠原，動物骨因含有油脂、多種礦物質和其他雜質，往往需要在提取膠原及活性物質之前必須進行預處理，剔除殘留的肉質和肌腱等雜物，除去骨中無機物才可提高膠原及活性蛋白的得率；臍帶組織中的膠原較為純凈，還包含多種干細胞活性分泌因子，因此具有較大的生物學利用價值。cn104120162a公開了一種水溶性活性膠原的制備方法，包括以下步驟：取新鮮或冷凍保存的健康胎盤和/或臍帶，經解凍、清洗、脫脂處理、浸泡、切碎、攪拌及離心后分離出白色組織液，然后將白色組織液進行酶解、鹽析、酰化、洗滌和冷凍干燥后制得水溶性活性膠原。經過測試發(fā)現(xiàn)，上述水溶性活性膠原的制備方法所制得的水溶性活性膠原的生物活性仍然有待提高。技術實現(xiàn)要素：本公開的目的是提供一種臍帶膠原活性肽組合物，該臍帶膠原活性肽組合物能夠在抗衰老、提高皮膚彈性和緊實度方面具有更高的生物活性。為了實現(xiàn)上述目的，本公開提供了一種制備臍帶膠原活性肽組合物的方法，該方法包括如下步驟：s1、將臍帶組織用液氮研磨法粉碎為50-200目的臍帶組織粉末；s2、用脫脂溶劑對所述臍帶組織粉末進行脫脂，得到脫脂后的物料；s3、用酸性提取液對所述脫脂后的物料進行浸提，得到浸出液；s4、用胃蛋白酶溶液對所述浸出液進行酶解，得到酶解產物；s5、將所述酶解產物依次進行透析純化、鹽析純化、再次透析純化和干燥；其中，步驟s2中，相對于100g的所述臍帶組織粉末，所述脫脂溶劑的用量為1-2l，所述脫脂溶劑為含有5-15體積％的正丁醇的乙醇溶液。本發(fā)明還提供了如上所述的方法制備得到的臍帶膠原活性肽組合物。本發(fā)明還提供了一種臍帶膠原活性肽組合物，該臍帶膠原活性肽組合物具有如下所示的肽分子量高斯分布模式：分子量為100-1000道爾頓的肽高斯分布面積為26-30％，且分子量在1000-10000道爾頓的多肽高斯分布面積為40-46％。通過上述技術方案，本公開提供的制備臍帶膠原活性肽組合物的方法中，通過液氮研磨法的引入以及脫脂條件的優(yōu)化，使得得到的臍帶膠原活性肽組合物具有特定的肽分子量分布，并且出乎意料能夠在抗衰老、提高皮膚彈性和緊實度方面具有更高的生物活性。本公開的其他特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。具體實施方式以下對本公開的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本公開，并不用于限制本公開。本公開提供了一種制備臍帶膠原活性肽組合物的方法，該方法包括如下步驟：s1、將臍帶組織用液氮研磨法粉碎為50-200目的臍帶組織粉末；s2、用脫脂溶劑對所述臍帶組織粉末進行脫脂，得到脫脂后的物料；s3、用酸性提取液對所述脫脂后的物料進行浸提，得到浸出液；s4、用胃蛋白酶溶液對所述浸出液進行酶解，得到酶解產物；s5、將所述酶解產物依次進行透析純化、鹽析純化、再次透析純化和干燥；其中，步驟s2中，相對于100g的所述臍帶組織粉末，所述脫脂溶劑的用量為1-2l，所述脫脂溶劑為含有5-15體積％的正丁醇的乙醇溶液。其中，步驟s3中，相對于100g的所述脫脂后的物料，所述酸性提取液的用量可以為1-2l，所述酸性提取液可以為含有0.5-1.5mol/l的酸的水溶液，所述酸可以為醋酸、鹽酸、磷酸、甲酸、乙酸、蘋果酸和檸檬酸中的至少一種。步驟s4中，相對于1l的所述浸出液，所述胃蛋白酶溶液的用量可以為5-20l，所述胃蛋白酶溶液可以為含有5-10g/l的胃蛋白酶和0.5-1.5mol/l的醋酸的水溶液。其中，步驟s2中，脫脂的條件可以包括：脫脂溫度可以為0-25℃，脫脂的時間可以為每6-10小時更換所述脫脂溶劑一次，共更換2-8次。其中，步驟s3中，浸提的條件可以包括：浸提溫度可以為0-25℃，優(yōu)選為4-10℃，浸提時間可以為10-60小時，優(yōu)選為24-48小時。其中，步驟s4中，酶解的條件可以包括：酶解的溫度可以為10-40℃，優(yōu)選為20-38℃，酶解的時間可以為10-40小時，優(yōu)選為12-24小時。其中，步驟s5中，透析所用的透析介質可以為0.01-0.03mol/l且ph值7.0-7.4的na2hpo4水溶液，相對于1體積的所述酶解產物，所述透析介質的用量可以為10-30倍體積，透析的時間可以為每6-18小時更換所述透析介質一次，共更換2-8次；透析所得的透析液離心取沉淀后復溶于5-20倍體積的0.5-1.5mol/l的醋酸溶液中，得到透析純化產物。其中，可以將所述透析純化產物與nacl固體混合使得nacl的終濃度為0.5-1.5mol/l，然后可以進一步加入含有2-3mol/l的nacl和0.03-0.08mol/l的tris-hcl且ph值為7.2-7.7的水溶液以進行鹽析，將鹽析所得沉淀復溶于5-20倍體積的0.5-1.5mol/l的醋酸溶液中，得到鹽析純化產物。其中，將所述鹽析純化產物進行再次透析純化所用的再次透析介質為去離子水，且相對于1體積的所述鹽析純化產物，再次透析所用去離子水的用量可以為10-30倍體積，再次透析的時間可以為每6-18小時更換去離子水一次，共更換2-8次；并且，將再次透析所得的透析液于-18℃至-22℃的溫度下預冷凍8-20小時，再進行真空冷凍干燥。其中，步驟s1中所用的臍帶組織可以為預先清洗并剪碎為組織碎塊的臍帶組織。特別優(yōu)選地，本公開提供的制備臍帶膠原活性肽組合物的方法可以按照如下方式實施：斷臍后，從斷口出將臍血放盡，并用無菌紗布擠壓擦拭盡量除盡臍血。在臍帶近胎盤端2-3cm處，用止血鉗夾住臍帶，然后用手術剪將臍帶剪斷。用無菌紗布沾取碘伏將臍帶表面的胎脂、羊水等污染物擦拭去除后，將臍帶放入含有臍帶保存液中，保持溫度為4-10攝氏度的低溫條件進行保存、運輸。所示臍帶保存液可以為含有2.0-20.0mmol/l鈣離子絡合劑且ph6.0-8.0的等滲緩沖液；所述鈣離子絡合劑可以是乙二胺四乙酸鹽、葡萄糖酸鈉、二乙烯三胺五羥酸鹽、酒石酸鈉中的至少一種。采用所述鈣離子絡合劑可以更好的螯合樣品原料中所含有的各種鈣離子雜質。等滲緩沖液可以是tris-hcl、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、兩性離子緩沖液中的一種。采用所述等滲緩沖液可保持體系的ph穩(wěn)定及樣品細胞組分生物活性，同時具有清除雜蛋白及脂質的效果，其中磷酸二氫鉀-氫氧化鈉在低溫下清除雜蛋白及脂質的效果最佳。用含有2.0-20.0mmol/l鈣離子絡合劑、ph6.0-8.0的等滲緩沖液清洗樣品3-5次，至上清清澈無色。將臍帶組織剪切成0.2-1.0cm3的組織小塊。將預處理好的臍帶組織小塊放置于-80攝氏度的液氮中冷凍。冷凍后的組織小塊置于4℃下，粉碎成50-200目粉末。將臍帶樣品粉末按50-100g/l的濃度加至5-15％的正丁醇的乙醇溶液中進行脫脂處理，每8小時換液，持續(xù)慢速攪拌16-48小時。用含有2.0-20.0mmol/l鈣離子絡合劑、ph6.0-8.0的等滲緩沖液(4℃)洗滌樣品3-5次，10000-20000rpm/min4℃離心5分鐘，收取沉淀。將脫脂后的樣品按50-100g/l的濃度加入0.5-1.5mol/l的酸溶液中，0-25℃慢速攪拌24-48小時，浸提。10000-20000rpm/min4℃離心20-40分鐘，收取上清，保存至4℃。酸溶液為醋酸、鹽酸、磷酸、甲酸、乙酸、蘋果酸、檸檬酸等中的一種。酸溶液處理溫度優(yōu)選4-10℃，以免膠原蛋白的生物活性發(fā)生破壞。將酸溶性膠原蛋白的提取上清加入10倍體積的含有胃蛋白酶5-10g/l的0.5-1.5mol/l的醋酸溶液中，慢速攪拌12-24小時，浸提。10000-20000rpm/min4℃離心20-40分鐘，收取上清，以20倍體積的0.02mol/lna2hpo4(ph7.2)為透析介質透析24-48小時，每12小時換液以去除酶活性。將透析液15000-25000rpm/min4℃離心30-60分鐘，取沉淀溶于10倍體積的0.5-1.5mol/l的醋酸溶液中。向提取酶溶性膠原蛋白中加入nacl進行鹽析30-60min，使nacl終濃度達到0.5-1.5mol/l。然后進一步用2.0-3.0mol/l的nacl(0.05mol/ltris-hcl液，ph7.5)沉淀膠原30-60min，20000rpm/min離心30-60min，取沉淀。將沉淀溶于10倍體積的0.2-1.5mol/l醋酸溶液中，先以20倍體積的0.1-0.5mol/l醋酸溶液為介質透析24h，再以20倍體積的去離子水為介質透析至ph值中性，每12h換液一次。將透析后的溶液置于-20℃過夜預冷凍后，放入凍干機中真空冷凍干燥，即得臍帶膠原活性肽及多肽混合物成品。本發(fā)明還提供了如上所述的方法制備得到的臍帶膠原活性肽組合物。本發(fā)明還提供了一種臍帶膠原活性肽組合物，該臍帶膠原活性肽組合物具有如下所示的肽分子量高斯分布模式：分子量為100-1000道爾頓的肽高斯分布面積為26-30％，且分子量在1000-10000道爾頓的多肽高斯分布面積為40-46％。更優(yōu)選地，該臍帶膠原活性肽組合物具有如下所示的肽分子量高斯分布模式：分子量大于10000道爾頓的肽高斯分布面積為20-21％，分子量為5000-10000道爾頓的肽高斯分布面積為10-11％，分子量為3000-5000道爾頓的肽高斯分布面積為9-10％，分子量為2000-3000道爾頓的肽高斯分布面積為14-15％，分子量為1000-2000道爾頓的肽高斯分布面積為10-11％，分子量為100-1000道爾頓的肽高斯分布面積為28-29％，且分子量小于100道爾頓的肽高斯分布面積為7-8％。以下，通過實施例進一步詳細說明本公開的技術方案。實施例1斷臍后，從斷口出將臍血放盡，并用無菌紗布擠壓擦拭盡量除盡臍血。在臍帶近胎盤端2.5cm處，用止血鉗夾住臍帶，然后用手術剪將臍帶剪斷。用無菌紗布沾取碘伏將臍帶表面的胎脂、羊水等污染物擦拭去除后，將臍帶放入臍帶保存液中，保持溫度為5攝氏度的低溫條件進行保存、運輸。所述臍帶保存液含為有10.0mmol/l乙二胺四乙酸鈉、0.1mmol/l的磷酸二氫鉀的水溶液并用1mol/l的氫氧化鈉調至ph7.0。用臍帶保存液清洗臍帶3-5次，至上清清澈無色。將臍帶組織剪切成0.2-1.0cm3的組織小塊。將預處理好的臍帶組織小塊放置于-80攝氏度的液氮中冷凍。冷凍后的組織小塊置于4℃下，粉碎成50-200目粉末。將臍帶樣品粉末按80g/l的濃度加至10％的正丁醇的乙醇溶液中進行脫脂處理，每8小時換液，持續(xù)慢速攪拌36小時。用臍帶保存液洗滌脫脂后的物料3-5次，15000rpm/min4℃離心5分鐘，收取沉淀。將脫脂后的樣品按80g/l的濃度加入1mol/l的醋酸溶液中，4℃慢速攪拌36小時，浸提。15000rpm/min4℃離心30分鐘，收取上清，保存至4℃。將酸溶性膠原蛋白的提取上清加入10倍體積的含有胃蛋白酶8g/l的1mol/l的醋酸溶液中，慢速攪拌18小時，浸提。15000rpm/min4℃離心30分鐘，收取上清，以20倍體積的0.02mol/lna2hpo4(ph7.2)為透析介質透析36小時，每12小時換液以去除酶活性。將透析液20000rpm/min4℃離心45分鐘，取沉淀溶于10倍體積的1mol/l的醋酸溶液中。向提取酶溶性膠原蛋白中加入nacl進行鹽析45min，使nacl終濃度達到1mol/l。然后進一步用2.5mol/l的nacl(0.05mol/ltris-hcl液，ph7.5)沉淀膠原45min，20000rpm/min離心45min，取沉淀。將沉淀溶于10倍體積的1mol/l醋酸溶液中，先以20倍體積的0.3mol/l醋酸溶液為介質透析24h，再以20倍體積的去離子水為介質透析至ph值中性，每12h換液一次。將透析后的溶液置于-20℃過夜預冷凍后，放入凍干機中真空冷凍干燥，即得臍帶膠原活性肽組合物的成品。對比例1按照實施例1的方法制備臍帶膠原活性肽組合物，所不同的是，脫脂溶劑為乙二醇乙醚。對比例2按照實施例1的方法制備臍帶膠原活性肽組合物，所不同的是，將臍帶組織剪切成0.2-1.0cm3的組織小塊之后，將預處理好的臍帶組織小塊按160g/l的濃度懸浮在臍帶保存液中并進行機械勻漿。將機械勻漿后的物料加至等體積的10％的正丁醇的乙醇溶液中進行脫脂處理。測試實施例1根據本行業(yè)內常用的高效液相分析方法檢測肽分子量的qb/t22492-2008標準對實施例1和對比例1-2的臍帶膠原活性肽組合物的成品進行分子量高斯分布的測定。根據表1可以看出，本公開得到的臍帶膠原活性肽組合物具有特定的肽分子量分布，分子量小于1000道爾頓的肽高斯分布峰面積為35.79％，分別為對比例1和對比例2的16.4倍、15.2倍。分子量小于10000道爾頓的肽高斯分布峰面積為79.57％，分別為對比例1和對比例2的1.2倍、1.2倍。具體地，詳細的肽高斯分布面積數據如表1所示。表1測試實施例2使用德國khazaka(ck)+courage皮膚彈性測試儀mpa580和reviscometerrv600探頭對40名年齡在28-50的自愿者，男女各半，進行面部受試，檢測皮膚和粗糙度參數。將實施例1和對比例1-2的臍帶膠原活性肽組合物的成品配置成0.1％水溶液，在涂抹4周內，每周檢測一次，并對皮膚彈性和粗糙度進行評級，空白組不含活性肽組合物的水溶液。結果數據如表2、表3所示。表2皮膚彈性平均值處理時間空白組實施例1對比例1對比例2初始0.57±0.040.53±0.010.56±0.020.57±0.02一周0.48±0.060.58±0.040.57±0.030.58±0.04兩周0.51±0.020.64±0.020.58±0.020.57±0.03三周0.49±0.070.68±0.030.59±0.010.54±0.03四周0.52±0.080.77±0.040.59±0.020.55±0.02表3平均粗糙度值處理時間空白組實施例1對比例1對比例2初始2.83±0.162.82±0.132.83±0.152.84±0.21一周2.85±0.232.23±0.162.66±0.162.71±0.23兩周2.84±0.182.01±0.152.54±0.162.52±0.20三周2.83±0.121.78±0.162.33±0.122.34±0.17四周2.82±0.081.67±0.182.12±0.112.24±0.14根據表2的數據可以看出，在測試的4周內，使用空白樣品組的皮膚彈性平均值未有顯著變化，使用實施例組的皮膚彈性隨時間的延長呈明顯改善趨勢，第四周時皮膚彈性數值提升了近24％，皮膚彈性明顯提高，實施例優(yōu)于對比例。根據表3的數據可以看出，在測試的4周內，使用空白樣品組的皮膚粗糙度基本持平，使用實施例組的皮膚粗糙度隨時間的延長呈明顯下降趨勢，第四周時皮膚粗糙度改善了近59％，對受試者面部進行觀察發(fā)現(xiàn)，皮膚表面假性干紋明顯減少，表面細紋隨使用時間增長變細小，光滑度和柔嫩觸感增加，實施例明顯優(yōu)于對比例。本公開得到的臍帶膠原活性肽組合物具有特定的肽分子量分布，并且出乎意料具有在特定濃度提高皮膚彈性和改善粗糙度的生物活性功效。測試實施例3皮膚衰老與自由基產生直接相關，根據本行業(yè)內常用的清除dpph自由基實驗檢測將實施例1和對比例1-2的臍帶膠原活性肽組合物的成品對自由基的清除能力。dpph為一種穩(wěn)定的自由基，若組合物能將其清除，則表示組合物具有降低羥自由基或氧化自由基的有效濃度的作用。將實施例1和對比例1-2的臍帶膠原活性肽組合物稀釋成不同濃度，分別取2ml不同濃度的測試液與2ml20mmol/ldpph混勻，反應30分鐘，測定517nm波長下的吸光度，對照用無水乙醇代替，按下式計算抑制率：抑制率(％)＝[1-(ai-aj/ac)]*100；ai為2mldpph溶液與2ml不同濃度的測試液組成的混合液的吸光度；aj為2ml不同濃度的測試液與2ml無水乙醇組成的混合液的吸光度；ac為2mldpph溶液與2ml無水乙醇組成的混合液的吸光度。測試結果見表4表4dpph清除率如表4所示，組合物在低濃度時便有一定對dpph的清除能力，在濃度1-5‰濃度范圍內，隨濃度增大，dpph自由基清除率隨之增加。超過5‰濃度隨濃度增大，dpph自由基清除率沒有明顯變化。實施例優(yōu)與對比例。以上詳細描述了本公開的優(yōu)選實施方式，但是，本公開并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本公開的技術構思范圍內，可以對本公開的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本公開的保護范圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本公開對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本公開的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本公開的思想，其同樣應當視為本公開所公開的內容。當前第1頁12