本申請是pct申請?zhí)枮閜ct/ep2009/001198，中國國家階段申請?zhí)枮?00980111208.8的發(fā)明專利申請的分案申請。原申請的發(fā)明名稱為“生產(chǎn)生物活性hiv-1tat蛋白的方法”，申請日期為2009年2月6日。本發(fā)明涉用于疫苗的生物活性hiv-1tat、其衍生物和其前體，包括所有hiv-1分化體-特異性形式的生產(chǎn)。人免疫缺陷病毒(hiv)，即，aids的病原體，持續(xù)在世界范圍內(nèi)快速傳播。who和unaids估計自開始流行以來，已有超過六千萬人感染了該病毒。在2004年年末，有超過四千萬人，大部分生活在發(fā)展中國家，感染了hiv。發(fā)展中國家中hiv流行病的無情傳播和由aids導(dǎo)致的發(fā)病率和死亡率加強對針對aids的有效、安全且廉價的疫苗的急需性。在過去的15-20年中，hiv疫苗開發(fā)中的大部分努力集中在通過利用產(chǎn)生能夠防止感染的中和抗體(na)的基本原理，靶向負責(zé)病毒結(jié)合和進入的hiv包膜蛋白(env)而獲得消除性免疫(wahren，2002)。然而，來自臨床前和臨床試驗的結(jié)果，包括最初的iii期試驗(vaxgen的aidsvax)，其中在白種人中沒有觀察到對原發(fā)性感染的保護作用，這些結(jié)果是非常令人失望的。這可以通過所述疫苗不能激發(fā)保護性na來解釋，其歸因于env的高可變性(myers，1995)，并且阻止na對相關(guān)的、主要是構(gòu)象表位的識別；且還可以通過gp120的嚴重糖基化來解釋，其有助于隱藏關(guān)鍵的(中和)env-表位(在burton1997中綜述)。最近以來，已經(jīng)開發(fā)了其它方法，其目的是誘導(dǎo)針對其它hiv抗原的t細胞介導(dǎo)的反應(yīng)。這些方法目的在于控制病毒復(fù)制，其在不存在消除性免疫的條件下實現(xiàn)，提供保護以避免疾病進展，并因此減少病毒傳播至健康個體。然而，這些方法也都失敗了。其中的一個實例是merck最近基于三種hiv基因進行的試驗。這種疫苗使用三種成分的混合物產(chǎn)生，每種成分用一種常見的感冒病毒，即5型腺病毒(ad5)的復(fù)制缺陷型版本制成，所述5型腺病毒(ad5)作用為hivgag、pol和nef基因的載體或遞送載體。該疫苗不能預(yù)防感染：在接受三劑量疫苗系列中的至少一劑量的志愿者中，在接受疫苗的741名志愿者中觀察到24例hiv感染，在安慰劑組的762名參與者中觀察到21例hiv感染。另外，該疫苗不減少被感染的那些人血流中的病毒的量；診斷感染后約8-12周的hivrna水平在疫苗和安慰劑組中相似。一種根本不同的方法是基于關(guān)鍵的hiv調(diào)控基因tat以及其蛋白產(chǎn)物tat作為疫苗候選物。作為非常早期的調(diào)控蛋白并且在hiv-1復(fù)制和發(fā)病機理中起著主要作用，tat代表疫苗開發(fā)的最佳候選物(ensoli，1990，1993和1994；chang，1997)。tat是一種在感染后非常早，甚至在hiv整合之前產(chǎn)生的重要的病毒調(diào)控蛋白，并且是病毒基因表達(arya，1985；fisher，1986；ensoli，1993；wu，2001)、以及細胞-到-細胞病毒傳播和疾病進展所必需的。事實上，在不存在tat時，沒有或可以忽略量的結(jié)構(gòu)蛋白得到表達，并且因此，不形成傳染性病毒。此外，tat由被感染的t淋巴細胞釋放在細胞外環(huán)境中(ensoli，1990和1993；chang，1997)，并且進入感染的細胞和未感染的細胞，在感染的細胞中，其促進hiv-1復(fù)制，在未感染的細胞中，其引起控制細胞周期的細胞因子和細胞基因的激活或抑制(frankel和pabo，1988；ensoli，1993；chang，1995)。這一方法的目的在于誘導(dǎo)中和細胞外tat的抗體和針對病毒感染的細胞的t細胞反應(yīng)。一些研究表明針對tat的免疫反應(yīng)具有保護作用，并且可以在體內(nèi)控制疾病的進展(reiss，1990；rodman，1993；re，1995；zagury，1998；re，2001)。特別地，與疾病晚期階段的患者相比較，在無癥狀hiv-感染個體中(krone1988，demirhan2000，re2001)和與快速進展者相比較，在非進展者中(zagury1998)，已經(jīng)顯示了更高的抗-tat抗體流行性。我們最近在一組252名個體中進行了橫向和縱向的研究，該組個體具有準確估測的血清轉(zhuǎn)化日期和平均7.2年的隨訪(rezza，待出版)。這一研究的結(jié)果揭示在抗-tat抗體的存在和疾病的較緩慢進展之間的強相關(guān)性。事實上，對于抗-tat陽性個體，發(fā)展aids或嚴重免疫缺陷的危險比抗-tat陰性個體低60％?？v向分析還表明持久為抗-tat陽性的個體具有最低的疾病進展危險，而持久為抗-tat陰性的那些個體具有最高的發(fā)展嚴重免疫缺陷的危險。特別地，暫時為抗-tat陽性/陰性的個體與持久為陰性的個體相比具有幾乎70％更低的危險，這提供了抗-tat抗體的存在預(yù)示較緩慢的疾病進展的證據(jù)(rezza，待出版)。tat的免疫原區(qū)在所有的表位m亞型中是保守的(b和t細胞)(myers，1995)。實際上，我們最近的數(shù)據(jù)表明來自htlviiib實驗室-適應(yīng)病毒株的分化體b毒株-來源(bh-10)tat蛋白的有效交叉識別(buttò，2003)，所述htlviiib實驗室-適應(yīng)病毒株在約20年前(ratner，1985)由在非洲傳播并屬于不同的hiv-1分化體的病毒感染的個體分離，由此反映出相對應(yīng)的tat區(qū)的高保守程度。具體地，來自主要感染了a，b，c和d以及較輕程度的f和ghiv-1亞型的意大利、烏干達和南非患者的血清以相似的水平(即，抗-tat抗體的流行性和滴度)識別bh-10tat蛋白。這一觀察得到序列保守分析結(jié)果的進一步證實，這表明預(yù)測的tat氨基酸序列在屬于不同hiv-1分化體的不同傳播病毒中是充分保守的，并且表現(xiàn)出與bh-10tat序列相對較高程度的同源性(buttò，2003)。在tat的第一外顯子編碼的部分，并且特別是在1-58區(qū)，同源性特別高，在1-58區(qū)中包含tat的功能結(jié)構(gòu)域和大部分目前鑒定的b、t-輔助和ctl表位(buttò，2003)。此外，使用來自相同bh-10tat序列的線性肽對來自意大利、烏干達和南非患者的tat-陽性血清的表位作圖研究表明相同的識別模式，并且證實氨基末端區(qū)包含tat的主要b細胞表位，盡管大部分抗-tat抗體表現(xiàn)為構(gòu)象抗體，其不取決于感染的病毒毒株(buttò，2003)。這些發(fā)現(xiàn)表明tat的總體性質(zhì)在構(gòu)象水平上也是保守的，并且提供有力的正式證據(jù)表明基于tat的疫苗確實可以表現(xiàn)為針對hiv的“通用”工具，原因在于其能夠誘導(dǎo)有效針對不同病毒分化體的廣譜的免疫反應(yīng)。我們已經(jīng)通過在不同動物模型中進行的臨床前研究證實了這一假說，所述不同的動物模型包括小鼠和食蟹猴，證明用生物活性tat蛋白或tatdna接種是安全的，引發(fā)廣譜且特異性的免疫反應(yīng)，并且最重要的是，在接種的猴子中誘導(dǎo)針對高度致病性病毒(shiv89.6p)感染的長期保護，所述高度致病性病毒在這些猴子中引起aids和死亡(cafaro，1999，2000和2001)。特別地，天然tat蛋白誘導(dǎo)th-1和cd8+ctls細胞免疫反應(yīng)和高滴度的抗-tat抗體，并且阻斷猿/人免疫缺陷病毒(shtv)89.6p的原發(fā)性感染，這如由在食蟹猴中cd4+t細胞計數(shù)的維持和疾病發(fā)作的缺乏所示(cafaro，1999，2000和2001)。當(dāng)然，保護是長期的，因為在兩年的隨訪過程中，在被保護動物的外周血單核細胞或在淋巴結(jié)中均沒有發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)制的跡象。此外，當(dāng)用破傷風(fēng)類毒素兩次加強時，在任何被保護的獼猴中，無論是在血漿中還是在淋巴結(jié)中，均沒有檢測到靜息細胞中隱藏的殘留病毒，破傷風(fēng)類毒素為已知的激活病毒復(fù)制的刺激物。長期的保護作用與針對tat的高且穩(wěn)定的體液和細胞(cd4和cd8t-細胞反應(yīng))的存在相關(guān)。最后，在shiv感染的獼猴中進行的試驗性研究表明用tatdna或蛋白接種在患有aids的猴子中也是安全的。除了表現(xiàn)為關(guān)于hiv/aids疫苗的有價值的抗原之外，生物活性tat還表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)性特征，使其成為用于其它抗原的有吸引力的佐劑。事實上，我們最近已經(jīng)表明，單核細胞來源的樹突細胞(mddc)，和更小程度上巨噬細胞，而非b類淋巴母細胞細胞系或t細胞胚細胞，有效且快速地攝取天然的而不是氧化-失活的tat(fanales-belasio，2002)。當(dāng)攝取時，天然tat促進mddc成熟和活化(增加mhc抗原和共刺激分子的表達、生成th-1細胞因子和趨化因子)，導(dǎo)致異源和外源可溶抗原更有效的呈遞(fanales-belasio，2002)。更近的數(shù)據(jù)表明這些作用均由天然tat對tnfα表達的誘導(dǎo)所介導(dǎo)(fanales-belasio，已投稿)。此外，我們已經(jīng)表明，在表達tat或用外源生物活性tat蛋白處理的b和t細胞中，tat修飾免疫蛋白酶體的催化亞基組成。特別地，tat上調(diào)潛伏膜蛋白7和多催化性內(nèi)肽酶復(fù)合物樣1亞基，并且下調(diào)潛伏膜蛋白2亞基。這些改變與蛋白酶體的所有三種主要的蛋白水解活性的增加相關(guān)，并且導(dǎo)致異源抗原亞結(jié)構(gòu)域mhc-i-結(jié)合ctl表位更有效的產(chǎn)生和呈遞(gavioli，2004)。因此，tat對抗原加工和ctl表位產(chǎn)生的修飾可能在hiv-1感染過程中的病毒感染的細胞的控制和tat用于接種策略的應(yīng)用具有影響。綜上所述，存在日益增長的表明生物活性tat作用為抗原和有效的佐劑的證據(jù)實體，原因在于：i)其誘導(dǎo)向th1誘導(dǎo)的表型的mddcs成熟和活化，ii)其得到主要組織相容性復(fù)合物(mhc)種類i呈遞途徑的通路(moy等，molbiotechnol(分子生物技術(shù))，1996；kim等，jimmunol(免疫學(xué)雜志)1997)，和iii)其調(diào)節(jié)蛋白酶體催化亞基組成，所述蛋白酶體催化亞基組成修飾有利于亞結(jié)構(gòu)域和隱藏表位呈遞的ctl表位的序位。綜合看來，這些特征使得單獨的tat或與其它抗原結(jié)合的tat成為hiv疫苗的最佳候選者。在血清陽性患者中，這應(yīng)該有助于減少hiv-1復(fù)制和疾病進展。在接種后暴露于病毒的個體中，疫苗可以在感染的一開始時改變病毒-宿主的動力學(xué)，并且這將影響重要的免疫細胞的消耗和感染的進展，原因在于累積的證據(jù)表明在感染開始時病毒負荷的水平是向疾病進展的強指示(mellors，1996；watson，1997；lifson，1997；tenhaaft，1998；staprans，1999)。這一途徑還具有這樣的優(yōu)點：不使用在目前的hiv檢測中出現(xiàn)的hiv成分，并且患者檢測為hiv-陰性。重要的是使用tat的生物活性形式，原因在于天然構(gòu)象的保持允許：誘導(dǎo)有效的th1細胞免疫反應(yīng)；誘導(dǎo)針對構(gòu)象表位的抗體；并且對于保留tat的佐劑性質(zhì)是重要的。hiv-1(htlv-iiib毒株，克隆bh-10)的tat蛋白是由兩個外顯子編碼的86個氨基酸的分子。第一外顯子的產(chǎn)物對于hiv-1啟動子的反式激活是充分的。該區(qū)域包含4個結(jié)構(gòu)域，包括氨基端結(jié)構(gòu)域(aa1-21)，富含半胱氨酸(cystein)的結(jié)構(gòu)域(aa22-37)，核心(aa38-48)和堿性結(jié)構(gòu)域(49-57)。富含半胱氨酸的區(qū)域是鋅離子介導(dǎo)的二聚體形成所必需的，并且代表反式激活結(jié)構(gòu)域。堿性區(qū)域，富含賴氨酸和精氨酸殘基，是核定位必需的，并且可以特異性結(jié)合其rna靶標，所述rna靶標為ltr中的反式激活反應(yīng)元件(tar)(hauber，1989；ruben，1989；roy，1990；chang，1995)。由外顯子2編碼的tatc端14個氨基酸不是hiv-1ltr反式激活所必需的，但是包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rgd)序列，這是在胞外基質(zhì)蛋白中存在的基序(barillari，1993；brake，1990)。這一區(qū)域和堿性結(jié)構(gòu)域分別是胞外tat與硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的相互作用和胞外tat與整聯(lián)蛋白家族的細胞表面分子的相互作用所必需的，并且介導(dǎo)樹突細胞(dc)對tat的攝入(fanales-belasio，2002)。事實上，生物活性tat被單核細胞來源的dc選擇性且有效地攝入和加工，從而誘導(dǎo)其成熟，并且促進其呈遞抗原的能力，激發(fā)針對th1模式的免疫反應(yīng)，并且增加針對其它抗原的t細胞反應(yīng)。這些功能僅由生物活性的tat蛋白實施，并且在該蛋白氧化/失活后消失或被極大地阻礙(fanales-belasio，2002)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所嘗試的通過重組宿主的常規(guī)培養(yǎng)生產(chǎn)tat僅產(chǎn)生物失活的tat，并且因此對于以商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)tat是無用的，因為生物特性的恢復(fù)可能是僅在產(chǎn)物的完全變性和正確重折疊之后獲得。變性和重折疊方法需要使用在對于人類應(yīng)用的目的生物制劑所不允許的溶劑，以致這些方法是無用的，且它們也不能作用為生產(chǎn)生物活性tat的指導(dǎo)。令人吃驚地，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過在重組子即生產(chǎn)tat的培養(yǎng)物的對數(shù)生長期過程中誘導(dǎo)tat生產(chǎn)而生產(chǎn)生物活性的tat是可能的。因此，在第一方面中，本發(fā)明提供用于制備生物活性tat的方法，所述方法包括培養(yǎng)在誘導(dǎo)時能夠表達tat的宿主生物體，并且其中tat的表達是在宿主生物體的對數(shù)生長期過程中誘導(dǎo)的。適當(dāng)?shù)乃拗魃矬w優(yōu)選是容易允許在商業(yè)條件下大體積培養(yǎng)的那些。因此，優(yōu)選地盡可能地避免復(fù)雜的方法步驟。優(yōu)選的生物體通常是真核生物體，包括細菌和酵母?？梢允褂萌魏文軌虮晦D(zhuǎn)化從而表達tat的生物體。實例包括釀酒酵母(s.cerevisiae)、枯草芽孢桿菌(b.subtilis)、和大腸桿菌(e.coli)。特別優(yōu)選的是大腸桿菌。優(yōu)選大腸桿菌bl21菌株，其已經(jīng)專門開發(fā)用于大體積生產(chǎn)。生物活性tat一般是單體的(monomeric)，并且不被氧化，即，其以其還原形式存在。對于細胞培養(yǎng)的目的，氧化是不可能的，并且在晚期生長期過程中的誘導(dǎo)導(dǎo)致產(chǎn)生二聚體的、四聚體的、和/或多聚體的tat。在不進行處理的條件下，不可能由所述分子得到生物活性的、單體形式的tat，所述處理使得所得到的tat不能用于治療制劑中。因此，在備選的方面中，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)單體tat的方法，所述方法包括培養(yǎng)在誘導(dǎo)時能夠表達tat的宿主生物體，并且其中tat的表達是在所述宿主生物體對數(shù)生長期過程中誘導(dǎo)的。重組tat蛋白的生物活性可以使用數(shù)種檢測評估，諸如通過單核細胞來源的樹突細胞(mddc)的攝取，tat-缺陷型原病毒的拯救，hiv-1ltr的反式激活，卡波西肉瘤細胞和細胞因子-激活的內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和侵入(ensoli，1992和1993；barillari1993和1999；fiorelli，1995；fanales-belasio，2002)。然而，由于極好的重現(xiàn)性和靈敏性，以及其對于疫苗功效的重要作用，由mddc攝取是關(guān)于重組tat蛋白的優(yōu)選潛力檢測。胞外tat被細胞攝取(frankel和pabo，1988；ensoli1993；chang1997；tyagi2001)，并且，與大多數(shù)可溶蛋白不同，進入i類mhc呈遞途徑，并且激發(fā)ctl活性(moy1996；kim1997)。已經(jīng)表明，在大部分有效的apcs中，mddcs比其它細胞類型如t細胞胚細胞和b類淋巴母細胞細胞系更有效地攝取tat，且以時間-、劑量-和成熟-依賴性方式攝取(fanales-belasio2002)。tat被mddcs以低至0.01ng/ml的劑量攝取，且攝取在5-10分鐘后最大。這種方法顯著地被蛋白的氧化/失活和被低溫(fanales-belasio2002)所妨礙，并且在本文用于表征具體的tat樣品是否是生物活性的。生物活性tat通常能夠在非免疫妥協(xié)的患者中誘導(dǎo)免疫學(xué)反應(yīng)，并且將具有上文關(guān)于生物活性tat所述的其它特征。對于生物活性tat特別優(yōu)選的標記是其被單核細胞來源的樹突細胞攝取的能力。關(guān)于mddc的tat攝取的適當(dāng)?shù)臋z測記述在fanales-belasioe，morettis，nappif，barillarig，michelettif，cafaroa，和ensolib.″nativehiv-1tatproteintargetsmonocyte-deriveddendriticcellsandenhancestheirmaturation，functionandantigen-specifictcellresponses(天然hiv-1tat蛋白靶向單核細胞來源的樹突細胞，并且提高其成熟、功能和抗原特異性t細胞反應(yīng))″j.immunol.(免疫學(xué)雜志)2002，168：191-206中。因此，在一方面中，本發(fā)明提供用于制備生物活性的tat的方法，所述方法包括培養(yǎng)在誘導(dǎo)時能夠表達tat的宿主生物體，并且其中tat的表達是在宿主生物體的對數(shù)生長期過程中誘導(dǎo)的，其中生物活性的量度是tat被單核細胞來源的樹突細胞攝取的能力。實際上，在本發(fā)明的所有方面中，生物活性的量度可以是tat被單核細胞來源的樹突細胞攝取的能力。可以按照本發(fā)明生產(chǎn)表現(xiàn)出tat的理想特性，特別是被mddc攝取的能力的任何tat變體或突變體，并且其可以包括在″生物活性tat″的定義中。所述變體和突變體可以天然獲得，諸如由任何hiv毒株、或分化體獲得，或可以通過遺傳操作編碼tat的核酸獲得。所述操作可以是通過刪除、插入或倒置進行，包括通過其組合進行，條件是保留生物活性tat的特性。特別地，優(yōu)選保留在上文中鑒定為在分化體之間是保守的那些區(qū)域。例如，可以結(jié)合前導(dǎo)序列和/或尾序列，例如，以輔助分泌和/或提供抗消化的保護水平。tat編碼序列可以包括兩個天然存在的外顯子，有或無間插內(nèi)含子，并且僅需要包含用于保留生物活性的足夠序列信息。然而，通常優(yōu)選地使用盡可能多的天然存在的序列。tat是本領(lǐng)域中公知的。然而，優(yōu)選的，tat蛋白是seqidnos.2或3所示的那些，尤其是在任何翻譯后修飾之后(諸如分裂掉n′端met)。對于seqidno.s5和6所示的tat遵循相同的內(nèi)容。在需要突變體或變體是tat的情形中，如優(yōu)選地，這些將具有生物活性，并且優(yōu)選地其至少與″生物活性tat″相當(dāng)。適當(dāng)?shù)?，所述突變體或變體優(yōu)選地與所述seqidnos所示的氨基酸序列、至少其中所示的編碼tat氨基酸序列的核苷酸序列、或其中所示的全長核苷酸序列有至少70％，更優(yōu)選地至少75％，更優(yōu)選地至少80％，更優(yōu)選地至少85％，更優(yōu)選地至少90％，更優(yōu)選地至少95％，更優(yōu)選地至少99％，更優(yōu)選地至少99.5％，且最優(yōu)選地99.9％的序列同源性。因此，特別優(yōu)選地是tat是seqidnos.2，35或6所示的那些，或其具有生物活性且與所述序列具有至少70％的序列同源性的突變體或變體。在這種情形中，上文提及的更高水平的序列同源性也是優(yōu)選的。任何核酸序列，諸如上文所述，可以用來編碼tat，但是優(yōu)選的是，從培養(yǎng)的宿主獲得的表達產(chǎn)物與本領(lǐng)域已經(jīng)證明是生物活性的且具有需要的特性的tat是相同的、或基本上相同的。宿主生物體可以被基因組轉(zhuǎn)化，或通過結(jié)合適當(dāng)?shù)谋磉_質(zhì)粒來轉(zhuǎn)化。為了成為可誘導(dǎo)的，優(yōu)選地，tat編碼序列應(yīng)該處于可誘導(dǎo)啟動子的控制之下?！翱烧T導(dǎo)啟動子”意指不是組成型的且僅在所選的環(huán)境下在其控制之下引起編碼序列表達的啟動子。可誘導(dǎo)啟動子通常分成兩類，第一類是其中通常組成型地存在聚合酶，但在不存在易化配體的條件下，將不識別該啟動子，或僅以有限程度識別其。第二類是其中啟動子僅被特異性聚合酶識別，所述特異性聚合酶本身不是組成型表達的，并且可以是處在可誘導(dǎo)啟動子的控制之下。在大腸桿菌bl21菌株中，t7rna聚合酶處在lac(iptg可誘導(dǎo)的)啟動子控制下，以便這種聚合酶的產(chǎn)生可以容易地通過添加iptg進行誘導(dǎo)。那么，對于控制外源序列所必需的所有問題是關(guān)于所述序列與t7啟動子締合。向bl21大腸桿菌培養(yǎng)物中加入iptg將刺激t7rna聚合酶生產(chǎn)，然后其可以在t7啟動子的控制下轉(zhuǎn)錄該序列。在本發(fā)明中，在該實例中，tat編碼序列處在t7啟動子的控制下。宿主生物體可以在任何適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)，所述條件允許以本領(lǐng)域?qū)τ诒磉_外源蛋白公知的方式進行表達。對本領(lǐng)域公知技術(shù)的唯一顯著的背離是外源蛋白tat的誘導(dǎo)在對數(shù)期開始至平臺期之前實施和終止。在常規(guī)蛋白生產(chǎn)培養(yǎng)物中，誘導(dǎo)之前，通常允許od達到1.2或更高。盡管在該水平誘導(dǎo)產(chǎn)生與按照本發(fā)明獲得的相似量的tat，但是該tat不是生物活性的。通過在對數(shù)期過程中而不是在對數(shù)期開始顯著到達平臺期時進行誘導(dǎo)，可能獲得與在od1.2獲得相似的產(chǎn)率，但是其中tat是生物活性的。優(yōu)選的od′s在0.4-0.9范圍內(nèi)，更優(yōu)選地在0.45-0.8范圍內(nèi)，包括端點值。特別優(yōu)選地是用于誘導(dǎo)的od是0.5-0.7，包括端點值，并且發(fā)現(xiàn)od約為6提供極好的生物活性tat產(chǎn)率。通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的tat是特別有利的，因為其可以在發(fā)酵步驟中不被動物來源的蛋白污染而獲得。其還具有這樣的優(yōu)點，即，由于溶劑不允許在用于人類的生物制劑中使用，于是避免了溶劑的使用。另一個優(yōu)點是按照本發(fā)明生產(chǎn)的tat能夠進行配制，從而經(jīng)受住在低至-80℃或者低于-80℃的溫度下的保存。按照本發(fā)明獲得的tat可以按需要使用。特別優(yōu)選的是將這種tat用在疫苗制劑中，如本領(lǐng)域所述，但是考慮了關(guān)于這樣生產(chǎn)的tat的其它應(yīng)用，并且同等地在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。在另一方面中，提供了按照本發(fā)明的方法生產(chǎn)的生物活性tat?，F(xiàn)在，將通過下述非限制性實施例進一步描述本發(fā)明。本文引用的任何參考文獻按其不與本發(fā)明沖突的程度結(jié)合于此作為參考。實施例hiv-1tat基因tat基因的結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過反式激活感受態(tài)cdna，即pcv-tat的分子克隆和核苷酸測序鑒定(ensoli，1993)。已經(jīng)顯示tat蛋白由包含兩個編碼外顯子的雙剪切的rna翻譯(aldovini，1986)。第一編碼外顯子(核苷酸5411-5625)(ratner，1985)，其緊接著位于env基因前并且限定72個氨基酸，已經(jīng)證明其是反式激活所必需的和充分的(sodroski，1985；seigel，1986)。第二編碼外顯子編碼另外14個氨基酸，并且位于核苷酸7956和核苷酸8001之間，使得tat蛋白的總大小為86個氨基酸。在該方法中所用的tat基因來源于pcv-tat質(zhì)粒(ensoli，1993)。為了產(chǎn)生tat表達質(zhì)粒pcv-tat(全長tatcdna)，使用tatcdna的-61至-41和+270至+289的引物通過聚合酶鏈式反應(yīng)(pcr)進行擴增。引物在5′末端設(shè)計有pst1位點作為連接體。然后，將pcr擴增的片段用pst1消化，并且克隆到pcv0的pst1位點。通過核苷酸序列分析驗證構(gòu)建體的序列和方向。tat基因，原始來源于htlv-iii-感染的細胞系，后來鑒定為來源于htlv-iiib分離體bh-10克隆(分化體b)。表達系統(tǒng)pet系統(tǒng)是用于在大腸桿菌中克隆和表達重組蛋白的有力系統(tǒng)?；谧畛跤蓅tudier及同事(studier，1986和1990；rosenberg，1987)開發(fā)的t7啟動子驅(qū)動的系統(tǒng)，novagen的pet系統(tǒng)已經(jīng)用于表達數(shù)以千計的不同蛋白。pet系統(tǒng)提供能夠調(diào)整基礎(chǔ)表達水平以最優(yōu)化靶基因表達的載體-宿主組合(rosenberg，1987)。在非表達宿主中建立質(zhì)粒后，通常將其轉(zhuǎn)化到攜帶t7rna聚合酶基因的宿主(λde3溶原體)中，用于表達靶蛋白。在λde3溶原體中，t7rna聚合酶基因處于lacuv5啟動子控制下。這允許在非誘導(dǎo)狀態(tài)的某種程度的轉(zhuǎn)錄。對于更嚴格的控制，可以使用攜帶plyss的宿主。plys質(zhì)粒編碼t7溶菌酶，其是t7rna聚合酶的天然抑制劑，并且因此減少t7rna聚合酶在非誘導(dǎo)的細胞中轉(zhuǎn)錄靶基因的能力。對于重組tat的表達，細菌菌株bl21(de3)用pet-tat和plyss質(zhì)粒來轉(zhuǎn)化。bl21細胞是最廣泛使用的宿主。這些細胞缺少lon蛋白酶，并且缺乏ompt外膜蛋白酶(表1)。bl21細胞對利福平敏感，plys表達t7溶菌酶，其抑制基礎(chǔ)t7rna聚合酶。表1.用于表達tat蛋白的細菌菌株的特征pet載體來源于pbr322，并且是許多pet家族載體的前體。pet-3a-d載體攜帶n端t7tag序列和bamhi克隆位點。在本研究中使用pet-3c載體(圖1)。pet-3c載體的序列在序列表中以seqidno.7提供。pet-3c的圖譜與pet-3a(顯示的)的圖譜除下述例外之外相同：pet-3c是4638bp的質(zhì)粒，在510處bamhi外每個位點減去2bp；nco位點替換ndei位點，在pet-3c的位置550處具有凈bp缺失。質(zhì)粒plyss是4886bp質(zhì)粒，其通過在pacyc184的bamhi位點插入t7溶菌酶基因而構(gòu)建(studier，1986和1990)。這種質(zhì)粒不是克隆質(zhì)粒，并且用在λde3溶原性宿主中，以通過產(chǎn)生t7溶菌酶來抑制來自t7啟動子的基礎(chǔ)表達，t7溶菌酶為t7rna聚合酶的天然抑制劑(圖2)。plys載體的序列提供在seqedno.8中。構(gòu)建表達載體并制備產(chǎn)物細胞系pet-tat通過將來自pcv-tat表達質(zhì)粒的261bptat克隆到pet-3c的5′ndei和3′bamh1位點而構(gòu)建(圖3和seqidno.1，其顯示pet-3c克隆表達區(qū))。利用包含ndei分裂位點的5′引物和包含bamh1分裂位點的3′引物從pcv-tat質(zhì)粒擴增tat基因的261bp片段(圖4，其顯示克隆在pet-3c中用ecori切下的pcv-tat載體所包含的原始序列；還顯示在seqidnos.2和3中)。將擴增的tat產(chǎn)物和pet-3c載體用ndei和bamh1消化。然后，消化之后進行連接酶反應(yīng)，轉(zhuǎn)化到novablue細菌菌株中，并且通過pcr篩選選擇tat陽性克隆(圖5，其顯示261bptat基因的克隆，還如在seqidno.4中所示)。使用abiprismbigdye終止子循環(huán)測序試劑盒(應(yīng)用生物系統(tǒng)(appliedbiosystems))，使用t7啟動子和t7終止子作為測序引物，通過sanger法測序tatcdna在pet-3c載體中的正確插入(圖6，其顯示tat在pet-3c載體中的插入，突出顯示ntd位置22-282的cds，其還如seqidnos.5和6所示)。將得到的重組質(zhì)粒(pet-3c/tat)用于轉(zhuǎn)化多個大腸桿菌菌株，所述大腸桿菌菌株包含在iptg(異丙基-β-d-硫代半乳糖吡喃糖苷(thiogalactopyranoside))-可誘導(dǎo)的lacuv5啟動子控制下編碼的t7rna聚合酶的基因。通過sds-page評估在誘導(dǎo)細菌培養(yǎng)物后的重組tat蛋白的生產(chǎn)，得到質(zhì)粒構(gòu)建體的功效和最佳細菌菌株的選擇。為了在bl21(de3)plyss中的表達pet-3c/tat，將過夜細胞培養(yǎng)物以1∶10稀釋在合成培養(yǎng)基(ph7.5)中，所述合成培養(yǎng)基包含：氨芐青霉素1ml/l(儲液為25mg/ml)，氯霉素1ml/l(儲液為34mg/ml)，硫胺(thiamin)0.5ml/l(儲液為4.5mg/ml)，mg溶液1.25ml/l(儲液為240mg/ml)，和葡萄糖12ml/l(儲液為630mg/ml)。然后，將稀釋的細菌在37℃培養(yǎng)，直至600nm的光學(xué)密度為0.6-0.7。為了最優(yōu)化重組蛋白的表達條件，進行數(shù)個誘導(dǎo)實驗。通過向在37℃培養(yǎng)物中加入1mmiptg4小時而獲得最有效的tat生產(chǎn)。結(jié)束時，離心細菌，并且將沉淀物重懸在裂解緩沖液中。超聲處理包含tat蛋白的細菌裂解物，并且離心，以增溶該蛋白。然后，將沉淀物重懸在包含甘露糖、甘油、磷酸鹽緩沖液、dtt和nacl的緩沖液中。將樣品再次超聲處理，并且以10,500xg離心30分鐘，過濾上清，并且上樣到deaesepharosefastflow(amershampharmaciabiotech(安瑪西亞法瑪西亞生物技術(shù))，uppsala，瑞典)柱。然后，該蛋白用1mnacl洗脫。收集包含tat的級分，并且以1∶1體積比稀釋，并上樣到肝素瓊脂糖cl-6b(amershampharmaciabiotech(安瑪西亞法瑪西亞生物技術(shù))，uppsala，瑞典)柱。然后，該蛋白用2mnacl洗脫。收集包含tat的級分，并透析以去除nacl。通過sds-page驗證通過上述步驟得到的蛋白的純度等級?；厥盏牡鞍椎漠a(chǎn)率顯示在表2中。表2.純化在大腸桿菌中表達的tat蛋白依據(jù)標準的實踐最優(yōu)化一些參數(shù)：·誘導(dǎo)過程中的iptg濃度·用plyss質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，以抑制t7啟動子的基礎(chǔ)表達·氧氣、溫度和生物量產(chǎn)量該項工作的結(jié)果得到出現(xiàn)對應(yīng)于重組tat的蛋白條帶的直接驗證。例如，參見圖7，其中：泳道1＝未誘導(dǎo)的(在標準條件下)泳道2.＝誘導(dǎo)的(在標準條件下)泳道3.＝lmw泳道4.＝未誘導(dǎo)的(在最優(yōu)化后)泳道5.＝誘導(dǎo)的(在最優(yōu)化后)在確定的最優(yōu)化條件下，我們能夠在上述轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中誘導(dǎo)4-5mg的重組tat表達。不幸的是，這些條件不提供生物活性tat。相反，偶然地，發(fā)現(xiàn)可以獲得生物活性的重組tat，條件是在加入iptg時刻且直到誘導(dǎo)時間結(jié)束，大腸桿菌以確定的濃度存在。發(fā)現(xiàn)在加入iptg時刻，細胞培養(yǎng)物的最佳od為0.5-0.7o.d.單位，優(yōu)選地為0.6o.d.單位。tat表達中的這種行為完全是出乎意料的。常規(guī)誘導(dǎo)培養(yǎng)物的o.d.是可以收獲最大生物量的o.d.。不存在為什么堅持常規(guī)常識產(chǎn)生無生物活性的tat而在對數(shù)期中期過程中表達產(chǎn)生生物活性tat的已知原因。該結(jié)果是非常令人驚訝的。這顯示在圖8中，其描述允許回收生物活性重組tat的條件。已知改變溫度和收獲條件以防止表達的重組蛋白在內(nèi)含體中沉淀，并且這有時候需要在低于潛在可獲得的最大值的od或溫度值下誘導(dǎo)。tat的情形是不同的，因為在高od誘導(dǎo)后回收的可溶tat的量與在低od誘導(dǎo)后回收的量相似，不同的是沒有生物活性。例如，參見圖9，其中泳道：1.＝lmw2.＝未誘導(dǎo)的3.＝在0.6od誘導(dǎo)的(1小時)4.＝在0.6od誘導(dǎo)的(2小時)5.＝在0.6od誘導(dǎo)的(3小時)6.＝在1.2od誘導(dǎo)的(2小時)重組tat生物活性的喪失與其在內(nèi)含體內(nèi)作為可溶蛋白或作為重組蛋白表達不相關(guān)，但是，相反，與作為單體回收相關(guān)。以多聚體形式存在并且在標準sds-page條件下是不可分離的重組蛋白，不表現(xiàn)出生物活性。圖10顯示無生物活性但是以可溶形式回收的tat蛋白。制備生產(chǎn)hiv-1重組tat蛋白的大腸桿菌主細胞庫(mcb)(大腸桿菌bl21de3plyssmcb)的方法mcb定義為單一細胞集合的等分試樣，其通常由所選擇的細胞克隆在確定條件下制備，分裝到多個容器中，并且在確定的條件下保存。制備植物蛋白胨瓊脂平板以分離轉(zhuǎn)化了pet-tat和plyss質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)的單個菌落。制備包含植物蛋白胨、葡萄糖、磷酸氫二鉀、酵母提取物和氯化鈉的液體培養(yǎng)基，并且在即將高壓滅菌之前，加入瓊脂塊。通過在121℃高壓20分鐘進行滅菌。將從高壓滅菌器中取出的培養(yǎng)基輕輕渦旋，以將瓊脂均勻地分散在整個溶液中。在加入抗生素(50μg/ml氨芐青霉素和34μg/ml氯霉素)之前允許培養(yǎng)基冷卻至30-37℃。然后，直接由燒瓶傾倒平板，允許每個90mm平板有20ml植物蛋白胨瓊脂。當(dāng)培養(yǎng)基完全變硬時，將平板倒置并且在使用前保存在4℃。然后，在使用平板前1-2小時，將平板由保存中取出。將1ml大腸桿菌bl21(de3)plyss小瓶(直接來自冷凍的甘油儲液)無菌轉(zhuǎn)移到9mlpbs中，并且搖動進行混合。重復(fù)該步驟，以制備至多10-10且包括10-10的細菌對數(shù)稀釋液。取下植物蛋白胨瓊脂板的蓋子，并且向平板中加入200μl10-1稀釋。對于每份稀釋液重復(fù)這一步驟。將稀釋液分散到植物蛋白胨瓊脂板的表面上，確保平板完全干燥，并且重新放上蓋子。溫育在37℃有氧進行最少24小時。在這一溫育時間后，檢驗接種的植物蛋白胨瓊脂板的單個細菌菌落。將轉(zhuǎn)化了pet-tat和plyss質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)的單個菌落(來自可能的最高的稀釋液)接種到包含50μg/ml氨芐青霉素和34μg/ml氯霉素的植物蛋白胨肉湯(植物蛋白胨，葡萄糖，磷酸氫二鉀，酵母提取物和氯化鈉)中，然后，在設(shè)定為200rpm的培養(yǎng)箱搖動器上在37℃有氧溫育5小時。以每小時的時間間隔從視覺上檢驗培養(yǎng)物，直到培養(yǎng)物開始變渾濁。在600nm測量樣品的光學(xué)密度。在每次讀數(shù)前，使用植物蛋白胨肉湯作為0。進行溫育，直到光學(xué)密度達到0.4-0.6的范圍。當(dāng)光學(xué)密度達到該范圍時，向細胞混懸液中加入30％甘油(在無菌條件下)，將混懸液渦旋約30秒，以混合，并且然后將1ml混合物轉(zhuǎn)移到2ml凍存管(2mlnalgene凍存管)中。將凍存管以數(shù)字順序填充。mcb小瓶保存在-80℃。通過標準生化和分子方法進一步表征該主細胞庫。對于三個驗證批次進行重組tat蛋白的制備生產(chǎn)過程已經(jīng)在avitechantigenproductionunit(diathevas.r.lgmpfacility)fano-italy執(zhí)行和進行。1)發(fā)酵和收獲1.1大腸桿菌bl21de3plyss起子培養(yǎng)物將植物蛋白胨肉湯加50μg/ml氨芐青霉素和34μg/ml氯霉素(vpb+ac)，8x2000mlerlenmeyer培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到發(fā)酵裝置的層流室中，以制備大腸桿菌bl21de3plyss起子培養(yǎng)物。將400mlvpb+ac無菌轉(zhuǎn)移到無菌的2000ml培養(yǎng)瓶中。將erlenmeyer培養(yǎng)瓶接種400μlmcb大腸桿菌混懸液，并且標記為起子培養(yǎng)物。將該培養(yǎng)物在設(shè)定為250rpm的培養(yǎng)箱搖動器中在37℃±2℃有氧溫育。溫育16小時后，通過將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)裝置的層流室中，并且用10ml移液器無菌取出需要的體積，而從erlenmeyer培養(yǎng)瓶中取出5ml樣品。將樣品轉(zhuǎn)移到無菌的50ml離心管中。使用分光光度計在600nm測量樣品的光學(xué)密度，并且記錄該測量。在vpb+ac中制備樣品的適當(dāng)稀釋液，以便稀釋液的光學(xué)密度在0.3-0.7之間。在每次讀數(shù)前，vpb+ac用作0。每小時重復(fù)取樣和測量，并且在光學(xué)密度接近2.0的目標值時更頻繁。當(dāng)光學(xué)密度超出2.0時，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到2l無菌pirex瓶中。將標記附在包含培養(yǎng)物的無菌pirex瓶上。395ml起子培養(yǎng)物用于biostatc15的接種。將用于發(fā)酵細胞濃縮物的原材料轉(zhuǎn)移到發(fā)酵裝置中。1.2細胞培養(yǎng)和收獲準備發(fā)酵桶連接器和管道裝置，包裝并用fedegari高壓滅菌器fmv周期1滅菌。在周期結(jié)束時，檢查高壓滅菌器的記錄，以確保滿足最低滅菌條件(負載探針≥121℃，≥15分鐘)并且附上高壓滅菌器的打印輸出。準備biostatc15發(fā)酵桶進行滅菌。校正ph探針，并且記錄ph探針校正的詳情和時間。將兩個沉降板(settleplates)放置在實驗臺上，暴露平板并記錄時間。制備發(fā)酵桶基礎(chǔ)培養(yǎng)基如下：向biostatc15容器中加入磷酸二氫鉀、磷酸氫銨、檸檬酸一水合物；然后向該容器中加入純凈水，攪動設(shè)定為100rpm，且控制模式設(shè)定為pid?；旌先芤海_保所有成分溶解。然后，向biostatc15中加入1.512gr檸檬酸鐵(iii)水合物，37.5mg氯化鈷(ii)六水合物，225mg氯化錳(ii)四水合物，22.5mg氯化銅(ii)二水合物，45mg硼酸，31.5mg無水鉬酸鈉，507mg醋酸鋅二水合物和221.5mgedta。將沉降板蓋上，記錄結(jié)束時間和總時間。準備biostatc15進行滅菌，滅菌溫度設(shè)定為122℃，并且滅菌時間設(shè)定為20分鐘。生長溫度設(shè)定為37℃，并且控制模式設(shè)定為pid。在確保樣品和接種連接相連后，將包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基的biostatc15滅菌。校準do電極，并且對室進行清潔。將無菌氨水溶液轉(zhuǎn)移到發(fā)酵室中，并且連接適當(dāng)?shù)臒o菌管道。將氨水溶液與biostatc15相連，ph設(shè)定為7.5，并且控制模式設(shè)定為pid。對ph計進行2-點校準。測量樣品的ph，并且按需要調(diào)節(jié)校準零點。將抗生素溶液(氨芐青霉素，硫胺，鎂，葡萄糖，氯霉素)轉(zhuǎn)移到發(fā)酵室中，并且向biostatc15中無菌加入15ml抗生素溶液amp25，7.5ml硫胺溶液，18.75ml鎂溶液，500ml葡萄糖溶液和15ml氯霉素溶液。biostatc15接種大腸桿菌bl21de3plyss起子培養(yǎng)物如下：將接種端口滅菌，攪動設(shè)定為關(guān)閉，并且起子培養(yǎng)物管道裝置與接種連接器管道裝置連接，并且將管道插入到蠕動泵的泵頭中。打開端口配件，并且將起子培養(yǎng)物泵入到容器中，根據(jù)需要換瓶子，以接種全部起子培養(yǎng)物。關(guān)閉端口配件并且滅菌。攪動設(shè)定為100rpm，并且控制模式變?yōu)閜id。調(diào)整氣流為50升/分鐘，do設(shè)定為50，且控制模式設(shè)定為pid。攪動控制模式設(shè)定為do，并且上部攪動設(shè)定點為400rpm。使用分光光度計在600nm測量樣品的光學(xué)密度(在每次讀數(shù)前使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為0)，并且記錄測量。在至少為0.6的光學(xué)密度下，加入15ml1miptg(終濃度為1mm)。繼續(xù)發(fā)酵至iptg誘導(dǎo)后最多4小時，每小時取樣。在iptg誘導(dǎo)后4小時后，溫度設(shè)定為關(guān)閉，ph線圈設(shè)定為關(guān)閉，攪動設(shè)定點改變?yōu)?00rpm。連接收集配件線路和管道。將6個轉(zhuǎn)子瓶放置在填充架上，并將襯墊(liner)置于每個瓶中。襯墊通過漏斗負載物質(zhì)。該操作在層流室中進行。然后密封每個襯墊頸部的閥門，并且將襯墊頸部折疊以適合瓶子內(nèi)部。將瓶子用轉(zhuǎn)子塞和帽/蓋密封，并將密封的瓶子放置在轉(zhuǎn)子筒中進行離心。離心后，將離心瓶轉(zhuǎn)移到層流室中，并且切下襯墊閥門，傾析上清。將襯墊密封，以將沉淀物保存在-20℃。標記每個包含沉淀物的襯墊，并且置于保存袋中。將該袋子放置在冰箱中。使用testo175t1溫度數(shù)據(jù)記錄器測量緊接袋子周圍的溫度，并且記錄批次中包括的打印輸出。2)分離2.1大腸桿菌bl21de3plyss細胞分解將裂解緩沖液放置在冰箱中冷卻。清潔并且準備微射流均質(zhì)機(microfluidiser)，以進行細胞分解。在使用前凈化微射流均質(zhì)機。將儲庫裝滿1m氫氧化鈉和通過保持至少1000bar壓力的系統(tǒng)處理的腐蝕劑。微射流均質(zhì)機儲庫裝滿1m氫氧化鈉。通過微射流均質(zhì)機處理氫氧化鈉。打開主釋放閥，并且打開發(fā)動機，以除去任何截留的空氣。達到100bar時，關(guān)閉第二壓力值，并且達到100bar時，關(guān)閉主壓力值。為了防止空氣進入系統(tǒng)，儲庫裝滿1m氫氧化鈉。進行ph-計的3-點校準。測量樣品的ph，并且用注射用水沖洗樣品，直至ph達到＜7.5的水平。在引入樣品之前，用500ml0.1mnacl裂解緩沖液沖洗微射流均質(zhì)機。在儲庫全空之前停止微射流均質(zhì)機，以避免截留空氣。從冰箱中取出大腸桿菌bl21de3plyss細胞沉淀物。停止testo175t1溫度數(shù)據(jù)記錄器，并且保留打印輸出。將細胞塊轉(zhuǎn)移到層流室中。將細胞塊重懸在50ml/升的細胞培養(yǎng)物中。向細胞塊加入700ml冷的0.1mnacl裂解緩沖液，并且輕輕混合。細胞裂解液通過微射流均質(zhì)機處理，僅在680bar下通過一次。將裂解混懸液傾倒到儲庫中。起動增壓泵，并且調(diào)整壓力控制鈕，將壓力增加至大約680bar。通過微射流均質(zhì)機處理裂解混懸液。在樣品完全處理后，向儲庫中加入50ml0.1nnacl裂解緩沖液，并且通過該系統(tǒng)處理，以確保所有的裂解混懸液已經(jīng)進行處理，并且通過產(chǎn)物出口。一旦所有的裂解緩沖液已經(jīng)被處理，停止微射流均質(zhì)機。將處理的產(chǎn)物收集在離心瓶中，然后在4℃以8,000rpm沉淀1小時。從每管線(line)中取出上清，并且匯集到無菌pirex瓶中。將上清液、無菌的1000mlpirex瓶、0.45μm濾器和管道裝置轉(zhuǎn)移到層流室中。按下述使用無菌步驟組裝濾器：a)管道的自由端插入到上清液中；b)管道裝置的另一端與0.45μm濾器連接；c)將濾器夾持在架子中；d)將管道插入到分配泵的泵頭中。取下1lpirex瓶的帽，并且將瓶子放置在濾器下。使用分配泵過濾上清液。當(dāng)1lpirex瓶裝滿時，重新蓋上帽。通過使用運送盒(pass-box)將瓶子從層流室中取出直接置于清潔室中，以立即進行純化。3)純化3.1deae層析的準備工作使用akta填裝deae層析柱，并且清洗。取出所有的管線(lines)，并且置于1mnaohnalgeneptfe容器中。在“系統(tǒng)控制”中，點擊“手動”，然后是“系統(tǒng)洗滌”，然后是“插入”e，最后是“執(zhí)行”，以進行系統(tǒng)的清潔。30分鐘后，中止程序。在“系統(tǒng)控制”中，點擊“手動”，然后是“系統(tǒng)洗滌”，插入“流速”，然后“執(zhí)行”，以進行系統(tǒng)出口閥門的清潔。取樣閥門用1mnaoh和相同的方法洗滌。30分鐘后，中止程序。將管線從1mnaoh中取出，并且置于注射用水中，直到ph值達到6-8。然后，將管線從注射用水中取出，置于在5000mlnalgeneptfe容器中的5000ml0.1mnacl裂解緩沖液中。點擊“繼續(xù)”，并且將系統(tǒng)用緩沖液沖洗。倒空廢液容器，使用20l小口大瓶袋作為廢液。完成層析柱的視覺檢查，以確保樹脂是均勻的，且在填裝的柱中沒有氣泡可見。柱的進口和出口管線與akta探測器中的適當(dāng)連接器連接。3.2tat蛋白純化的第一步在unicom軟件中，點擊“系統(tǒng)控制”，并且在文件菜單中選擇下列：“運行”，然后選擇文件“deae”。出現(xiàn)一些對話框，訊問關(guān)于運行的信息：變量，注意，方法信息和結(jié)果。管線放置如下：管線a11與0.1mnacl裂解緩沖液袋連接；管線b1與1mnacl裂解緩沖液袋連接；管線s1用于純化的物質(zhì)。f3與2l無菌pirex瓶連接，其用于收集洗脫的產(chǎn)物。f4與10lnalgeneptfe容器連接，其用于收集上樣流過液和洗液。f1連接到廢液20lnalgene容器。所有的收集容器適當(dāng)?shù)剡M行標記。程序準備好開始。設(shè)定方法程序，在純化運行過程中采取的任何手動行為記錄在日志記錄中，并且在“評論”中說明。靶蛋白在1mnacl裂解緩沖液洗滌(elutionblock)時洗脫下來。在色譜窗口中，在傳導(dǎo)率增加的同時出現(xiàn)在280nm波長處檢測到的吸收峰。設(shè)定收集程序，并且自動完成方法。在層流櫥中使用干凈的圓筒(cylinder)將deae洗脫物由2l無菌pirex瓶轉(zhuǎn)移到無菌pirex瓶中。將deae洗脫物匯集液用不含鹽的裂解緩沖液以1∶1稀釋，從而在上樣到肝素瓊脂糖柱上的溶液中提供0.5mnacl的終濃度。3.3肝素瓊脂糖層析的準備工作使用akta填裝deae層析柱，并且清洗。取出所有的管線(lines)，并且置于0.5mnaohnalgeneptfe容器中。在“系統(tǒng)控制”中，點擊“手動”，然后是“系統(tǒng)洗滌”，然后是“插入”e，最后是“執(zhí)行”，以進行系統(tǒng)的清潔。30分鐘后，中止程序。在“系統(tǒng)控制”中，點擊“手動”，然后是“系統(tǒng)洗滌”，插入“流速”，然后“執(zhí)行”，以進行系統(tǒng)出口閥門的清潔。取樣閥門用0.5mnaoh和相同的方法洗滌。30分鐘后，中止程序。將管線從0.5mnaoh中取出，并且置于注射用水中，直到ph值達到6-8。然后，將管線從注射用水中取出，置于在10lnalgeneptfe容器中的10l0.5mnacl裂解緩沖液中。點擊“繼續(xù)”，并且將系統(tǒng)用緩沖液沖洗。棄掉廢液容器，用空的容器替換。完成層析柱的視覺檢查，以確保樹脂是均勻的，且在填裝的柱中沒有氣泡可見。柱的進口和出口管線與akta探測器中的適當(dāng)連接器連接，并且記錄這些的詳情。3.4tat蛋白純化的第二步在unicom軟件中，點擊“系統(tǒng)控制”，并且在文件菜單中選擇下列：“運行”，然后選擇文件“肝素”。出現(xiàn)一些對話框，訊問關(guān)于運行的信息：變量，層析，注意，方法信息和結(jié)果。管線放置如下：管線a11與0.5mnacl裂解緩沖液袋連接；管線b1與2mnacl裂解緩沖液袋連接；管線s1用于純化的物質(zhì)。f3與2l無菌pirex瓶連接，其用于收集洗脫的產(chǎn)物。f4與10lnalgeneptfe容器連接，其用于收集上樣流過液和洗液。f1連接到廢液20lnalgene容器。所有的收集容器適當(dāng)?shù)剡M行標記。程序準備好開始。設(shè)定方法程序，在純化運行過程中采取的任何手動行為記錄在日志記錄中，并且在“評論”中說明。靶蛋白在2mnacl裂解緩沖液洗滌(elutionblock)時洗脫下來。在色譜窗口中，在傳導(dǎo)率增加的同時出現(xiàn)在280nm波長處檢測到的吸收峰。設(shè)定收集程序，并且自動完成方法。目的峰依據(jù)傳導(dǎo)率色譜定位，并且使用鼠標放大uv280模式。收集3種靶收集集合：第一收集，樣品1(集合1)；第二收集，樣品2(集合2)；第三收集，樣品3(集合3)。使用無菌的10ml移液管將目的級分轉(zhuǎn)移到無菌的500ml瓶中。將瓶標記并保存在4℃。來自每種收集的一個0.5ml的小瓶送于qc進行hplc分析，并且一個1ml小瓶送于qc進行內(nèi)毒素檢測。向集合1、集合2和集合3中加入20％的has至終濃度0.05％。重組tat的表征蛋白質(zhì)印跡蛋白的免疫化學(xué)性質(zhì)有助于確定其身份、同質(zhì)性和純度。因此，通過蛋白質(zhì)印跡分析對tat大體積蛋白的免疫化學(xué)特性進行分析。通過sdspage分離蛋白樣品，并且用對tat蛋白特異性的一級抗體探測。在與多克隆抗兔hrp--綴合物反應(yīng)后，使用化學(xué)發(fā)光劑獲得信號的顯現(xiàn)。如圖11(gmptat相對于tat參照標準物的蛋白質(zhì)印跡分析)所示，分析的樣品顯現(xiàn)對應(yīng)于單體tat蛋白的條帶。參考圖11：與tat蛋白參照標準物(圖b，批次80802)相比的gmptat(圖a)的蛋白質(zhì)印跡分析。lmv：低分子量標準物。分子量對通過分析性凝膠電泳分離的蛋白的檢測通過考馬斯藍染色和銀染完成，銀染是一種更靈敏的方法。按照這些方法，將蛋白在還原條件(存在sds和2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇)下在電場中基于其分子量分離。結(jié)果表明存在單一條帶(＞95％的總蛋白)，其對應(yīng)于單體tat蛋白。沒有檢測到該蛋白的二聚體或更高的多聚體。生物活性tat生物活性在本文中通過被單核細胞來源的樹突細胞(mddcs)攝取的能力來表征。mddcs與一系列濃度(0.1-1.000ng/ml)的天然tat蛋白一起溫育10分鐘，并且在用特異性親和純化的兔抗tat多克隆抗體染色后通過流式細胞計數(shù)法評估細胞質(zhì)內(nèi)的tat含量。對于mddcs的接受標準如下：對于mddcs分化的接受標準表3a如果至少對于三種tat稀釋物滿足該表中報道的結(jié)果，則獲得tat生物活性的驗證：tat濃度(ng/ml)％陽性細胞0.1≥161≥2110≥23100≥491000≥72表3b進一步優(yōu)選的說明總結(jié)如下：表4參考文獻aldovinia，debouckc，feinbergmb，rosenbergm，aryask，wong-staalf.synthesisofthecompletetrans-activationgeneproductofhumant-lymphotropicvirustypeiiiinescherichiacoli：demonstrationofimmunogenicityinvivoandexpressioninvitro(在大腸桿菌中合成iii型人嗜t淋巴細胞病毒的完整的反式激活基因產(chǎn)物：證明體內(nèi)免疫原性和體外表達).procnatlacadsciusa(美國國家科學(xué)院學(xué)報).1986，83：6672-6676.aryask，guoc，josephssf，wong-staalf.trans-activatorgeneofhumant-lymphotropicvirustypeiii(htlv-iii)(iii型人嗜t淋巴細胞病毒(htlv-iii)的反式激活子基因).science(科學(xué))1985，229：69-73.barillarig，gendelmanr，gallorc，ensolib.thetatproteinofhumanimmunodeficiencyvirustype1，agrowthfactorforaidskaposisarcomaandcytokine-activatedvascularcells，inducesadhesionofthesamecelltypesbyusingintegrinreceptorsrecognisingthergdaminoacidsequence(i型人免疫缺陷病毒的tat蛋白，其為aids卡波西肉瘤和細胞因子活化的血管細胞的生長因子，通過利用識別rgd氨基酸序列的整聯(lián)蛋白受體誘導(dǎo)相同細胞型的黏附).procnatlacadsciusa(美國國家科學(xué)院學(xué)報)1993，90：7941-7945.barillarig，sgadaric，fiorelliv，samaniegof，colombinis，manzariv，modestia，nairbc，cafaroa，stürzlm，ensolib.thetatproteinofhumanimmunodeficiencyvirustype-1promotesvascularcellgrowthandlocomotionbyengagingtheα5β1andαvβ3integrinsbymobilisingsequesteredbasicfibroblastgrowthfactor(1型人免疫缺陷病毒的tat蛋白通過使螯合的基本成纖維細胞生長因子運動結(jié)合α5β1和αvβ3整聯(lián)蛋白而促進血管細胞生長和運動).blood(血液)1999，94：663-672.brakeda，debouckc，bieseckerg.identificationofanarg-gly-asp(rgd)celladhesionsiteinhumanimmunodeficiencyvirustype1transactivationprotein，tat(在1型人免疫缺陷病毒反式激活蛋白tat中鑒定arg-gly-asp(rgd)細胞黏附位點).jcellbiol(細胞生物學(xué)雜志)1990，111：1275-1281.burtondr.avaccineforhivtype1：theantibodyperspective(1型hiv的疫苗：抗體前景).procnatlacadsciusa(美國國家科學(xué)院學(xué)報)1997，94：10018-10023.buttòs，fiorelliv，tripicianoa，ruiz-alvarezmj，scoglioa，ensolif，ciccozzim，collacchib，sabbatuccim，cafaroa，guzmanca，borsettia，aiutif，vardase，colvinm，lukwyiam，rezzag，ensolib，和tat多聚體研究組.cross-recognitionofthecladebhiv-1tatproteinvaccinecandidatebyantibodiesfromhiv-1-infecteditalian，ugandanandsouthafricanindividuals(來自感染hiv-1的意大利、烏干達和南非個體的抗體對分化體bhiv-1tat蛋白疫苗候選物的交叉識別).jinfdis.(傳染病雜志)inpress(出版中).cafaroa，caputoa，fracassoc，maggiorellamt，golettid，baroncellis，pacem，sernicolal，koanga-mogtomoml，bettim，borsettia，bellir，akerbloml，corriasf，buttòs，heeneyj，veranip，tittif，ensolib.controlofshiv-89.6p-infectionofcynomolgusmonkeysbyhiv-1tatproteinvaccine(hiv-1tat蛋白疫苗對食蟹猴shiv-89.6p-感染的控制).natmed(自然醫(yī)學(xué))1999，5：643-650.cafaroa，caputoa，maggiorellamt，baroncellis，fracassoc，pacem，borsettia，sernicolal，negridr，tenhaaftp，bettim，micheliniz，macchiai，fanales-belasioe，bellir，corriasf，buttòs，veranip，tittif，ensolib.shiv89.6ppathogenicityincynomolgusmonkeysandcontrolofviralreplicationanddiseaseonsetbyhumanimmunodeficiencyvirustype1tatvaccine(shiv89.6p在食蟹猴中的致病性以及1型人免疫缺陷病毒tat疫苗對病毒復(fù)制和疾病發(fā)作的控制).jmedprimatol(醫(yī)學(xué)靈長類動物學(xué)雜志)2000，29：193-208.cafaroa，tittif，fracassoc，maggiorellamt，baroncellis，caputoa，golettid，borsettia，pacem，fanales-belasioe，ridolfib，negridr，sernicolal，bellir，corriasf，macchiai，leonep，micheliniz，tenhaaftp，buttòs，veranip，ensolib.vaccinationwithdnacontainingtatcodingsequencesandunmethylatedcpgmotifsprotectscynomolgusmonkeysuponinfectionwithsimian/humanimmunodeficiencyvirus(shiv89.6p)(用包含tat編碼序列和未甲基化cpg基序的dna接種在用猿/人免疫缺陷病毒(shiv89.6p)感染時保護食蟹猴).vaccine(疫苗)2001，19：2862-2877.chang，h.k.gallorc和ensolib.regulationofcellulargeneexpressionandfunctionbythehumanimmunodeficiencyvirustype1tatprotein(通過1型人免疫缺陷病毒tat蛋白調(diào)控細胞基因表達和功能).jbiomcdsci(生物醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志)1995，2：189-202.chang，hc，samaniegof，nairbc，lbuonaguro，和b.ensoli.hjv-1tatproteinexitsfromcellsviaaleaderlesssecretorypathwayandbindstoextracellularmatrix-associatedheparansulphateproteoglycansthroughitsbasicregion(hiv-1tat蛋白通過無前導(dǎo)序列的分泌途徑由細胞中出來并且通過其堿性區(qū)結(jié)合胞外基質(zhì)-締合的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖).aids1997，11：1421-1431.demirhani，chandraa，muellerf等.antibodyspectrumagainsttheviraltransactivatorproteininpatientswithhumanimmunodeficiencyvirustype1infectionandkaposi′ssarcoma(在患有1型人免疫缺陷病毒感染和卡波西肉瘤的患者中針對病毒反式激活子蛋白的抗體譜).jhumvirol(人類病毒學(xué)雜志)2000；3：137-43.ensolib，barillarig，salahuddinsz，gallorc，wong-staalf.tatproteinofhiv-1stimulatesgrowthofcellsderivedfromkaposi′ssarcomalesionsofaidspatients(hiv-1的tat蛋白刺激來源于aids患者卡波西肉瘤損傷的細胞的生長).nature(自然)1990，345：84-86.ensolib，barillarig，gallorc.cytokinesandgrowthfactorsinthepathogenesisofaids-associatedkaposi′ssarcoma(在aids-相關(guān)的卡波西肉瘤發(fā)病機理中的細胞因子和生長因子).在：immunolrev(免疫學(xué)綜述)，g.(eds.)，stockholm1992，127：147-155.ensolib，buonagurol，barillarig，fiorelliv，gendelmanr，morganra，wingfieldp，gallorc.release，uptake，andeffectsofextracellularhumanimmunodeficiencyvirustype1tatproteinoncellgrowthandviraltransactivation(胞外1型人免疫缺陷病毒tat蛋白對細胞生長和病毒反式激活的釋放、攝取和作用).jvirol(病毒學(xué)雜志)1993，67：277-287.ensolib，gendelmanr，markhamp，fiorelliv，colombinis，raffeldm，cafaroa，changhk，bradyjn，gallorc.synergybetweenbasicfibroblastgrowthfactorandhiv-1tatproteinininductionofkaposi′ssarcoma(基本成纖維細胞生長因子和hiv-1tat蛋白在誘導(dǎo)卡波西肉瘤中的協(xié)同性).nature(自然)1994，371：674-680.fanales-belasioe，morettis，nappif，barillarig，michelettif，cafaroa，ensolib.nativehiv-1tatproteintargetsmonocyte-deriveddendriticcellsandenhancestheirmaturation，functionandantigen-specifictcellresponses(天然hiv-1tat蛋白靶向單核細胞來源的樹突細胞并且增強其成熟、功能和抗原特異性t細胞反應(yīng)).jimmunol(免疫學(xué)雜志)2002，168：197-206.fisherag，feinbergmb，josephssf，harperme，marsellelm，reyesg，gondama，aldovinia，deboukc，gallorc，等.thetrans-activatorgeneofhtlv-iiiisessentialforvirusreplication(htlv-iii的反式激活子基因?qū)τ诓《緩?fù)制是重要的).nature(自然)1986，320：367-371.frankelad，paboco.cellularuptakeofthetatproteinfromhumanimmunodeficiencyvirus(來自人免疫缺陷病毒的tat蛋白的細胞攝取).cell(細胞)1988，55：1189-1193.gaviolir，galleranie，fortinic，fabrism，bottonia，canellaa，bonaccorsia，marastonim，michelettif，cafaroa，rimessip，caputoa和ensolib.hiv-1tatproteinmodulatesthegenerationofcytotoxictcellepitopesbymodifyingproteasomecompositionandenzymaticactivity(hiv-1tat蛋白通過改變蛋白酶體組成和酶活性而調(diào)節(jié)細胞毒性t細胞表位的產(chǎn)生).jimmunol(免疫學(xué)雜志)，173：3838-3843，2004.hauberj，malimmh，cullenbr.mutationalanalysisoftheconservedbasicdomainofhumanimmunodeficiencyvirustatprotein(人免疫缺陷病毒tat蛋白保守堿性結(jié)構(gòu)域的突變分析).jvirol(病毒學(xué)雜志)1989，63：1181-1187.kimdt，mitchelldj，brockstedtdg，fongl，nolangp，fathmancg，englemaneg，rothbardjb.introductionofsolubleproteinsintothemhcclassipathwaybyconjugationtoanhjvtatpeptide(通過綴合到hivtat肽上將可溶蛋白引入到i類mhc途徑中).jimmunol(免疫學(xué)雜志)1997，159：1666-1668.kronewj，debouckc，epsteinlg，heutinkp，meloenr，goudsmitj.naturalantibodiestohiv-tatepitopesandexpressionofhiv-1genesinvivo(針對hiv-tat表位的天然抗體和hiv-1基因的體內(nèi)表達).jmedvirol(醫(yī)學(xué)病毒學(xué)雜志)1988；26：261-70.lifsonjd，nowakma，goldsteins，rossiojl，kintera，vasquezg，wiltroutta，brownc，schneiderd，wahll，lloydal，williamsj，elkinswr，faucias，hirschvm.theextentofearlyviralreplicationisacriticaldeterminantofthenaturalhistoryofsimianimmunodeficiencyvirusinfection(早期病毒復(fù)制的程度是天然的猿免疫缺陷病毒感染史的重要決定因素).jvirol(病毒學(xué)雜志)1997，71：9508-9514.maggiorellamt，baroncellis，micheliniz，fanales-belasioe，morettis，sernicolal，caraa，negridrm，buttòs，fiorelliv，tripicianoa，scoglioa，caputoa，borsettia，ridolfib，bonar，tenhaaftp，macchiai，leonep，pavone-cossutmr，nappif，ciccozzim，heeneyj，tittif，cafaroa，和ensolib.long-termprotectionagainstshiv89.6preplicationinhiv-1tatvaccinatedcynomolgusmonkeys(hiv-1tat接種的食蟹猴中針對避免shiv89.6p復(fù)制的長期保護作用).vaccine(疫苗)，22：3258-3269，2004.mellorsjw，rinaldocrjr，guptap，whiterm，toddja，kingsleyla.prognosisinhiv-1infectionpredictedbythequantityofvirusinplasma(通過血漿中病毒的量預(yù)測hiv-1感染的預(yù)后).science(科學(xué))1996，272：1167-1170.moyp，daikhy，pepinskyb，thomasd，fawells，barsoumj.tat-mediatedproteindeliverycanfacilitatemhcclassipresentationofantigens(tat介導(dǎo)的蛋白遞送可以促進抗原的i類mhc呈遞).molbiotechnol(分子生物技術(shù))1996，6：105-113.myersg，korberb，hahnbh，jeangkt，mellorsjw，mccutchanfe，hendersonle和pavlakisgn(eds.).humanretrovirusesandaids(人反轉(zhuǎn)錄病毒和aids)1995，losalamos，n.mex：losalamosnationallaboratory.ratnerl，haseltinew，patarcar，livakkj，starcichb，josephssf，doraner，rafalskija，whitehornea，baumeisterk，ivanoffl，pettewaysrjr，pearsonml，lautenbergerja，papasts，ghrayebj，changnt，gallorc，wong-staalf.completenucleotidesequenceoftheaidsvirus，htlv-iii(aids病毒htlv-iii的完整核苷酸序列).nature(自然)1985，313：277-284.remc，furlinig，vignolim，ramazzottie，roderigog，derosav，zaulig，lollis，capitanis，laplacam.jacquirimmunedefic.syndr.hum.retrovirol(獲得性免疫缺陷綜合征人反轉(zhuǎn)錄病毒學(xué)雜志)1995，10：408-416.remc，vignolim，furlinig，gibellinid，colangeliv，vitonef，laplacam.antibodiesagainstfull-lenghttatproteinandsomelow-molecular-weighttat-peptidescorrelatewithloworundetectableviralloadinhiv-1seropositivepatients(針對全長tat蛋白和一些低分子量tat肽的抗體與hiv-1血清陽性患者中的低或不可檢測的病毒負荷相關(guān)).jclinvirol(臨床病毒學(xué)雜志)2001，21：81-89.reissp，langejm，derondea，dewolff，dekkerj，debouckc，goudsmitj.speedofprogressiontoaidsanddegreeofantibodyresponsetoaccessorygeneproductsofhiv-1(aids的進展速度和針對hiv-1輔助基因產(chǎn)物的抗體反應(yīng)程度).jmedvirol(醫(yī)學(xué)病毒學(xué)雜志)1990，30：163-168.rezzag，fiorelliv，dorruccim，ciccozzim，tripicianoa，scoglioa，collacchib，ruiz-alvarezm，giannettoc，caputoa，tomasonil，castellif，sciandram，siniccoa，ensolif，buttòs，和ensolib.thepresenceofanti-tatantibodiesispredictiveoflong-termnon-progressiontoaidsorsevereimmunodeficiency：findingsfromacohortofhivseroconverters(抗tat抗體的存在預(yù)測對aids或嚴重免疫缺陷的長期非進展性：來自hiv血清轉(zhuǎn)化者組的發(fā)現(xiàn)).jinfectdis(傳染病雜志)，inpress(出版中).rodmantc，tose，hashishh，manchesterk.epitopesfornaturalantibodiesofhumanimmunodeficiencyvirus(hiv)-negative(normal)andhiv-positiveseraarecoincidentwithtwokeyfunctionalsequencesofhivtatprotein(關(guān)于人免疫缺陷病毒(hiv)-陰性(正常)和hiv-陽性血清的天然抗體的表位與hivtat蛋白的兩種關(guān)鍵功能序列一致).procnatlacadsciusa(美國國家科學(xué)院學(xué)報)1993，90：7719-7723.rosenbergah，ladebn，chuids，linsw，dunnjj，studierfw.vectorsforselectiveexpressionofcloneddnasbyt7rnapolymerase(通過t7rna聚合酶選擇性表達克隆的dnas的載體).gene(基因).1987，56：125-35.roys，dellingu，chench，rosenca，sonenbergn.abulgestructureinhiv-1tarrnaisrequiredfortatbindingandtat-mediatedtrans-activation(hiv-1tarrna的突出結(jié)構(gòu)是tat結(jié)合和tat介導(dǎo)的反式激活所必需的).genesdev(基因發(fā)育學(xué))1990，4：1365-1373.rubens，perkinsa，purcellr，joungk，siar，burghoffr，haseltinewa，rosenca.structuralandfunctionalcharacterisationofhumanimmunodeficiencyvirustatprotein(人免疫缺陷病毒tat蛋白的結(jié)構(gòu)和功能表征).jvirol(病毒學(xué)雜志)1989，63：1-8.seigellj，ratnerl，josephssf，dersed，feinbergmb，reyesgr，o′briensj，wong-staalf.transactivationinducedbyhumant-lymphotropicvirustypeiii(htlviii)mapstoaviralsequenceencoding58aminoacidsandlackstissuespecificity(由iii型人嗜t淋巴細胞病毒(htlviii)誘導(dǎo)的反式激活對應(yīng)編碼58個氨基酸的病毒序列，并且缺乏組織特異性).virology(病毒學(xué)).1986，148：226-231.sodroskij，patarcar，rosenc，wong-staalf，haseltinew.locationofthetrans-activatingregiononthegenomeofhumant-celllymphotropicvirustypeiii(iii型人嗜t淋巴細胞病毒基因組上的反式激活區(qū)的定位).science(科學(xué)).1985，229：74-77.stapranssi，daileypj，rosenthala，hortonc，grantrm，lerchen，feinbergmb.simianimmunodeficiencyvirusdiseasecourseispredictedbytheextentofvirusreplicationduringprimaryinfection(在原發(fā)性感染過程中通過病毒復(fù)制的程度預(yù)測猿免疫缺陷病毒疾病病程).jvirol(病毒學(xué)雜志)1999，73：4829-4839.studierfw，moffattba.useofbacteriophaget7rnapolymerasetodirectselectivehigh-levelexpressionofclonedgenes(噬菌體t7rna聚合酶用于指導(dǎo)克隆基因的選擇性高水平表達的應(yīng)用).jmolbiol(分子生物學(xué)雜志).1986，189：113-130.studierfw，rosenbergah，dunnjj，dubendorffjw.useoft7rnapolymerasetodirectexpressionofclonedgenes(t7rna聚合酶用于指導(dǎo)克隆基因表達的應(yīng)用).methodsenzymol(酶學(xué)方法).1990，185：60-89.tenhaaftp，verstrepenb，uberlak，rosenwirthb，heeneyj.apathogenicthresholdofvirusloaddefinedinsimianimmunodeficiencyvirus-orsimian-humanimmunodeficiencyvirus-infectedmacaques(在猿免疫缺陷病毒或猿-人免疫缺陷病毒感染的獼猴中定義的致病性病毒負荷閾值).jvirol(病毒學(xué)雜志)1998，72：10281-10285.tyagim，rusnatim，prestam，giaccam.internalisationofhiv-1tatrequirescellsurfaceheparansulphateproteoglycans(hiv-1tat的內(nèi)在化需要細胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖).jbiolchem(生物化學(xué)雜志)2001，276：3254-3261wahrenb，ljungbergk，rollmane，levim，zuberb，kjerrstromzubera，hinkulaj，leanderssonac，calarotas，hejdemanb，brattg，sandstrome.hivsubtypesandrecombinationstrains-strategiesforinductionofimmuneresponsesinman(hiv亞型和重組毒株--在人類中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的策略).vaccine(疫苗)2002，20：1988-1993.watsona，ranchalisj，travisb，mcclurej，suttonw，johnsonpr，husl，haigwoodnl.plasmaviremiainmacaquesinfectedwithsimianimmunodeficiencyvirus：plasmaviralloadearlyininfectionpredictssurvival(在感染猿免疫缺陷病毒的獼猴中的血漿病毒血癥：在感染早期的血漿病毒負荷預(yù)測存活).jvirol(病毒學(xué)雜志)1997，71：284-290.wuy，marshjw.selectivetranscriptionandmodulationofrestingtcellactivitybypreintegratedhivdna(通過預(yù)先整合hivdna選擇性轉(zhuǎn)錄和調(diào)控靜息t細胞活性).science(科學(xué))2001，293：1503-1506.zaguryjf，silla，blattnerw，lachgara，lebuanech，richardsonm，rappaportj，hendelh，bizzinib，gringeria，carcagnom，criscuolom，burnya，gallorc，zaguryd.antibodiestothehiv-1tatproteincorrelatedwithnonprogressiontoaids：arationalefortheuseoftattoxoidasanhiv-1vaccine(針對hiv-1tat蛋白的抗體與aids的不進展性相關(guān)：使用tat類毒素作為hiv-1疫苗的基本原理).jhumvirol(人類病毒學(xué)雜志)1998b，1：282-292.序列表描述seqidnos1-6在上文描述。pet-3c載體序列顯示在seqidno.7中。plyss載體序列顯示在seqidno.8中。序列表<110>國家高等衛(wèi)生院烏爾比諾大學(xué)<120>生產(chǎn)疫苗成分的方法<130>wpp98249<150>gb0802224.6<151>2008-02-06<160>8<170>patentinversion3.3<210>1<211>60<212>dna<213>人工的<220><223>質(zhì)粒pet-3c克隆表達區(qū)<220><221>misc_feature<222>(48)..(48)<223>n為a,c,g,或t<400>1tctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatatgnggatccggggct60<210>2<211>352<212>dna<213>人工的<220><223>質(zhì)粒pet-3c<220><221>cds<222>(63)..(323)<400>2tgggcgactgaattggtgtcgacatagcagaataggcgttactcgacagaggagagcaag60aaatggagccagtagatcctagactagagccctggaagcatccagga107metgluprovalaspproargleugluprotrplyshisprogly151015agtcagcctaaaactgcttgtaccaattgctattgtaaaaagtgttgc155serglnprolysthralacysthrasncystyrcyslyslyscyscys202530tttcattgccaagtttgtttcataacaaaagccttaggcatctcctat203phehiscysglnvalcyspheilethrlysalaleuglyilesertyr354045ggcaggaagaagcggagacagcgacgaagacctcctcaaggcagtcag251glyarglyslysargargglnargargargproproglnglysergln505560actcatcaagtttctctatcaaagcaacccacctcccaatcccgaggg299thrhisglnvalserleuserlysglnprothrserglnserarggly657075gacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagac352aspprothrglyprolysglu8085<210>3<211>86<212>prt<213>人工的<220><223>合成的構(gòu)建體<400>3metgluprovalaspproargleugluprotrplyshisproglyser151015glnprolysthralacysthrasncystyrcyslyslyscyscysphe202530hiscysglnvalcyspheilethrlysalaleuglyilesertyrgly354045arglyslysargargglnargargargproproglnglyserglnthr505560hisglnvalserleuserlysglnprothrserglnserargglyasp65707580prothrglyprolysglu85<210>4<211>72<212>dna<213>人工的<220><223>圖5261bp的tat基因的克隆<220><221>misc_feature<222>(58)..(58)<223>n為a，c，g，或t<400>4tctagaaataattttgtttaactttaactttaactttaagaaggagatatacatatgnta60ggatccggggct72<210>5<211>327<212>dna<213>人工的<220><223>圖6：pet-3c載體<220><221>cds<222>(22)..(282)<400>5ctttaagaaggagatatacatatggagccagtagatcctagactagagccc51metgluprovalaspproargleuglupro1510tggaagcatccaggaagtcagcctaaaactgcttgtaccaattgctat99trplyshisproglyserglnprolysthralacysthrasncystyr152025tgtaaaaagtgttgctttcattgccaagtttgtttcataacaaaagcc147cyslyslyscyscysphehiscysglnvalcyspheilethrlysala303540ttaggcatctcctatggcaggaagaagcggagacagcgacgaagacct195leuglyilesertyrglyarglyslysargargglnargargargpro455055cctcaaggcagtcagactcatcaagtttctctatcaaagcaacccacc243proglnglyserglnthrhisglnvalserleuserlysglnprothr606570tcccaatcccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagggatccggct292serglnserargglyaspprothrglyprolysglu758085gctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgc327<210>6<211>86<212>prt<213>人工的<220><223>合成的構(gòu)建體<400>6metgluprovalaspproargleugluprotrplyshisproglyser151015glnprolysthralacysthrasncystyrcyslyslyscyscysphe202530hiscysglnvalcyspheilethrlysalaleuglyilesertyrgly354045arglyslysargargglnargargargproproglnglyserglnthr505560hisglnvalserleuserlysglnprothrserglnserargglyasp65707580prothrglyprolysglu85<210>7<211>4638<212>dna<213>人工的<220><223>pet-3c載體序列<400>7ttctcatgtttgacagcttatcatcgataagctttaatgcggtagtttatcacagttaaa60ttgctaacgcagtcaggcaccgtgtatgaaatctaacaatgcgctcatcgtcatcctcgg120caccgtcaccctggatgctgtaggcataggcttggttatgccggtactgccgggcctctt180gcgggatatcgtccattccgacagcatcgccagtcactatggcgtgctgctagcgctata240tgcgttgatgcaatttctatgcgcacccgttctcggagcactgtccgaccgctttggccg300ccgcccagtcctgctcgcttcgctacttggagccactatcgactacgcgatcatggcgac360cacacccgtcctgtggatatccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctcaaga420cccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagccaact480cagcttcctttcgggctttgttagcagccggatccgacccatttgctgtccaccagtcat540gctagccatatgtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagagggaaaccg600ttgtggtctccctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcgagatctcgatcctctac660gccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatc720gccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttc780ggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcat840gcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttccta900atgcaggagtcgcataagggagagcgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtc960agctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttcttt1020atcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgc1080tttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgcc1140ctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccatt1200atcgccggcatggcggccgacgcgctgggctacgtcttgctggcgttcgcgacgcgaggc1260tggatggccttccccattatgattcttctcgcttccggcggcatcgggatgcccgcgttg1320caggccatgctgtccaggcaggtagatgacgaccatcagggacagcttcaaggatcgctc1380gcggctcttaccagcctaacttcgatcactggaccgctgatcgtcacggcgatttatgcc1440gcctcggcgagcacatggaacgggttggcatggattgtaggcgccgccctataccttgtc1500tgcctccccgcgttgcgtcgcggtgcatggagccgggccacctcgacctgaatggaagcc1560ggcggcacctcgctaacggattcaccactccaagaattggagccaatcaattcttgcgga1620gaactgtgaatgcgcaaaccaacccttggcagaacatatccatcgcgtccgccatctcca1680gcagccgcacgcggcgcatctcgggcagcgttgggtcctggccacgggtgcgcatgatcg1740tgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatg1800aatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgag1860caacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcag1920cgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtggaa1980cacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtccc2040gccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcat2100catcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatga2160acagaaatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaaca2220tggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacg2280cggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgca2340gctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggaga2400cggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcag2460cgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgt2520atactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcgg2580tgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcc2640tcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactca2700aaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagca2760aaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccatagg2820ctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccg2880acaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt2940ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctt3000tctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggc3060tgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtctt3120gagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggatt3180agcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggc3240tacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaa3300agagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtt3360tgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttct3420acggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatta3480tcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaa3540agtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatc3600tcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataact3660acgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgc3720tcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagt3780ggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagta3840agtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctgcaggcatcgtggtg3900tcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagtt3960acatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtc4020agaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctctt4080actgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattc4140tgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaacacgggataatacc4200gcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaa4260ctctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaac4320tgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaa4380aatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctt4440tttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaa4500tgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacct4560gacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgagg4620ccctttcgtcttcaagaa4638<210>8<211>4886<212>dna<213>人工的<220><223>plyss載體序列<400>8gaattccggatgagcattcatcaggcgggcaagaatgtgaataaaggccggataaaactt60gtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagctgaacggtctggtt120ataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaatgttctttacgatgccattggga180tatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagcttccttagctcctga240aaatctcgataactcaaaaaatacgcccggtagtgatcttatttcattatggtgaaagtt300ggaacctcttacgtgccgatcaacgtctcattttcgccaaaagttggcccagggcttccc360ggtatcaacagggacaccaggatttatttattctgcgaagtgatcttccgtcacaggtat420ttattcggcgcaaagtgcgtcgggtgatgctgccaacttactgatttagtgtatgatggt480gtttttgaggtgctccagtggcttctgtttctatcagctgtccctcctgttcagctactg540acggggtggtgcgtaacggcaaaagcaccgccggacatcagcgctagcggagtgtatact600ggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtggcaggagaaaa660aaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccgcttcctcgctc720actgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacgaacggggc780ggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaagtgagagggccgcggcaa840agccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatctgacgctcaaatc900agtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttcccctggcggctccct960cgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgcg1020tttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggact1080gtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttg1140agtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcagccactggtaattgattta1200gaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactgaaaggacaagttttggt1260gactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaaccttc1320gaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaagagattacgcgcagacca1380aaacgatctcaagaagatcatcttattaatcagataaaatatttctagatttcagtgcaa1440tttatctcttcaaatgtagcacctgaagtcagccccatacgatataagttgtaattctca1500tgtttgacagcttatcatcgataagctttaatgcggtagtttatcacagttaaattgcta1560acgcagtcaggcaccgtgtatgaaatctaacaatgcgctcatcgtcatcctcggcaccgt1620caccctggatgctgtaggcataggcttggttatgccggtactgccgggcctcttgcggga1680tatcgtccattccgacagcatcgccagtcactatggcgtgctgctagcgctatatgcgtt1740gatgcaatttctatgcgcacccgttctcggagcactgtccgaccgctttggccgccgccc1800agtcctgctcgcttcgctacttggagccactatcgactacgcgatcatggcgaccacacc1860cgtcctgtggatccggcccattggctgcctcccacacttggatatgcctcctcggagcct1920tatagaattgtttataagacttgcgcattatttgacctccaatgcgaacaaagggaaacc1980gctgtggtctccctttagtgagttcaattaattatccacggtcagaagtgaccagttcgt2040tcttctcccaccaacgcttaaggtcgaacgaagggcaagccttcggcgccacctcatgat2100gggcgcgaagaccagcgccttcgtacttagccagcagtgtgacaagcagtgagcgaaggg2160attgcatttgggctggcgtaaagttagcgtcgaacttacctttatcgtcgataccaccaa2220caaggcagacgccgatagagttgtggttgtaacccttagcgtgagagcctacagccatct2280catctcgtcctgcctccacagtaccgtctcgcttgatgataaagtggtatcccacatcga2340gccaaccctgctctttgtgccactggcgaatctcacggacaccaacattctgacttggct2400tggtagccgagcagtgaacaaagattgcgtcagtagattcacgttgtttaaactgtacac2460gagccattatttctttcctcctttcctttttaatctatcaaaggggacccggatcctcta2520cgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatat2580cgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgttt2640cggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgca2700tgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcct2760aatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagt2820cagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctt2880tatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccg2940ctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgc3000cctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccat3060tatcgccggcatggcggccgacgcgctgggctacgtcttgctggcgttcgcgacgcgagg3120ctggatggccttccccattatgattcttctcgcttccggcggcatcgggatgcccgcgtt3180gcaggccatgctgtccaggcaggtagatgacgaccatcagggacagcttcaaggatcgct3240cgcggctcttaccagcctaacttcgatcactggaccgctgatcgtcacggcgatttatgc3300cgcctcggcgagcacatggaacgggttggcatggattgtaggcgccgccctataccttgt3360ctgcctccccgcgttgcgtcgcggtgcatggagccgggccacctcgacctgaatggaagc3420cggcggcacctcgctaacggattcaccactccaagaattggagccaatcaattcttgcgg3480agaactgtgaatgcgcaaaccaacccttggcagaacatatccatcgcgtccgccatctcc3540agcagccgcacgcggcgcatctcgggcagcgttgggtcctggccacgggtgcgcatgatc3600gtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaat3660gaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctga3720gcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcc3780cctacgtgctgctgaagttgcccgcaacagagagtggaaccaaccggtgataccacgata3840ctatgactgagagtcaacgccatgagcggcctcatttcttattctgagttacaacagtcc3900gcaccgctgtccggtagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcactt3960atgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgcccaacagtccc4020ccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgccctgcaccattatgttc4080cggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtggaacacctacatctgtattaacg4140aagcgctaaccgtttttatcaggctctgggaggcagaataaatgatcatatcgtcaatta4200ttacctccacggggagagcctgagcaaactggcctcaggcatttgagaagcacacggtca4260cactgcttccggtagtcaataaaccggtaaaccagcaatagacataagcggctatttaac4320gaccctgccctgaaccgacgaccgggtcgaatttgctttcgaatttctgccattcatccg4380cttattatcacttattcaggcgtagcaccaggcgtttaagggcaccaataactgccttaa4440aaaaattacgccccgccctgccactcatcgcagtactgttgtaattcattaagcattctg4500ccgacatggaagccatcacagacggcatgatgaacctgaatcgccagcggcatcagcacc4560ttgtcgccttgcgtataatatttgcccatggtgaaaacgggggcgaagaagttgtccata4620ttggccacgtttaaatcaaaactggtgaaactcacccagggattggctgagacgaaaaac4680atattctcaataaaccctttagggaaataggccaggttttcaccgtaacacgccacatct4740tgcgaatatatgtgtagaaactgccggaaatcgtcgtggtattcactccagagcgatgaa4800aacgtttcagtttgctcatggaaaacggtgtaacaagggtgaacactatcccatatcacc4860agctcaccgtctttcattgccatacg4886當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12