一、技術(shù)領域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，具體涉及一種以馬來酸為原料多酶偶聯(lián)制備β-丙氨酸的方法。

二、

背景技術(shù)：

β-丙氨酸是合成泛酸的前體，泛酸是b族維生素的一種，構(gòu)成輔酶a的一部分，對于各種組織內(nèi)的內(nèi)源代謝能量交換非常重要。隨著對β-丙氨酸認識的逐漸加深，β-丙氨酸在醫(yī)藥、食品、化妝品和飼料等領域應用日益廣泛，β-丙氨酸的市場需求也在不斷增長，因此β-丙氨酸具有廣泛的應用價值和開發(fā)前景。

根據(jù)文獻報道，目前β-丙氨酸的制備方法主要有化學合成法和生物酶法。

1、化學合成法

化學合成法有丙烯腈法、丙烯酸法、β-氨基丙腈法、琥珀酰亞胺降解法和雙氰乙基胺法。其中丙烯腈法為丙烯腈與氨在二苯胺和叔丁醇溶液中反應，生產(chǎn)β-氨基丙腈，再進行堿解得到，此法的缺點是產(chǎn)物中存在有40％以上的nacl和雜質(zhì)，需要反復純化收率低；β-氨基丙腈法為β-氨基丙腈與氫氧化鋇反應生成β-氨基丙酸鋇和氮氣，通入co2，鋇鹽析出，產(chǎn)生β-氨基丙酸，鋇離子用樹脂去除，此法的缺點是生產(chǎn)成本高；琥珀酰亞胺降解法為琥珀酰亞胺在堿性氯酸鈉溶液中生成β-氨基丙酸，反應液用鹽酸調(diào)ph，用3倍量的95％乙醇使無機鹽析出，濾液用4倍量的蒸餾水稀釋，離子交換樹脂分離脫色，濃縮結(jié)晶，由于此法需大量的乙醇，生產(chǎn)成本高，生產(chǎn)場地安全性要求高。

2、生物酶法

(1)氨基化酶

裘娟萍(cn1626665a)以微生物濕菌體或粗酶液為酶源，以丙烯酸為底物，于20～80℃酶促條件下攪拌轉(zhuǎn)化反應2～40h，然后轉(zhuǎn)化液經(jīng)脫氨、離子交換、純化得到β-丙氨酸純品。

(2)天冬氨酸-α-脫羧酶

天冬氨酸-α-脫羧酶酶法生產(chǎn)工藝是以l-天冬氨酸為原料、脫羧酶為催化劑的一步生化反應，具有設備簡單，反應條件溫和、酶活力高、反應速度快、專一性強的特點。脫羧酶酶法生產(chǎn)β-丙氨酸已成為近年來人們關(guān)注和研究的方向。

wiliamson(j.biol.chem.1979,254:8074-8082)以微生物濕菌體或粗酶液為酶源，以l-天冬氨酸為底物，0.1mol/lph7.5的磷酸鉀緩沖液，于42℃酶促轉(zhuǎn)化，反應20min，得到含β-丙氨酸的反應液，經(jīng)分離提取制得β-丙氨酸，天冬氨酸-α-脫羧酶km值約為160umol/l。

cronan(j.biol.chem.1980,141(3):1291-1297)以微生物濕菌體或粗酶液為酶源，以l-天冬氨酸為底物，0.1mol/lph6.8的磷酸鉀緩沖液，于37℃酶促轉(zhuǎn)化，反應1-2h，得到含β-丙氨酸的反應液，經(jīng)分離提取制得β-丙氨酸，天冬氨酸-α-脫羧酶km值約為80umol/l。

洪敏等(浙江工業(yè)大學學報,2011,39(3):252-256)以l-天冬氨酸為底物，以天冬氨酸-α-脫羧酶基因工程菌pet-28c(+)-pand酶法合成了β-丙氨酸，酶活達到186u。

高麗娟(浙江工業(yè)大學碩士學位論文,2007)以l-天冬氨酸為底物，以天冬氨酸-α-脫羧酶基因工程菌pet-21c(+)-pand酶法合成了β-丙氨酸，酶活達到224.96u。

三、

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明需要解決的問題是提供一種高效、低成本制備β-丙氨酸的方法。本發(fā)明以馬來酸為原料，以馬來酸異構(gòu)酶、天冬氨酸酶和天冬氨酸-α-脫羧酶多酶偶聯(lián)制備β-丙氨酸。

本發(fā)明可以通過以下技術(shù)方案來達到：

一種以馬來酸為原料多酶偶聯(lián)制備β-丙氨酸的方法，其步驟為：

(1)將分別具有馬來酸異構(gòu)酶、天冬氨酸酶和天冬氨酸-α-脫羧酶活性的菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生高活性的馬來酸異構(gòu)酶、天冬氨酸酶和天冬氨酸-α-脫羧酶；

(2)將一定濃度的馬來酸水溶液用氨水調(diào)ph6～9，分別加入具有馬來酸異構(gòu)酶、天冬氨酸酶和天冬氨酸-α-脫羧酶活性的濕菌體或粗酶液，再加入適量磷酸吡哆醛和表面活性劑，在30～50℃條件下進行酶促反應，利用等電點結(jié)晶或等電點結(jié)晶與離子交換樹脂相結(jié)合的方法分離反應生成的β-丙氨酸。

上述步驟(1)中所述的馬來酸異構(gòu)酶來源于糞產(chǎn)堿菌alcaligenesfaecalis，天冬氨酸酶來源于大腸桿菌escherichiacoli，天冬氨酸-α-脫羧酶來源于谷氨酸棒桿菌corynebacteriumglutamicum，以上三種菌株均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心；

上述步驟(1)中所述的培養(yǎng)基碳源采用葡萄糖或麥芽糖或蔗糖或乳糖，培養(yǎng)基中總碳源質(zhì)量濃度為1～30g/l；氮源采用牛肉膏或酵母膏或玉米漿或蛋白胨或豆餅水解液，培養(yǎng)基中總氮源質(zhì)量濃度為1～30g/l；

上述步驟(2)中馬來酸水溶液質(zhì)量濃度為50～200g/l；磷酸吡哆醛質(zhì)量濃度為0.01～1.0g/l；所述的表面活性劑為吐溫或十六烷基三甲基溴化銨(ctab)或tritonx100，質(zhì)量濃度為0.01～1.0g/l。

目前，β-丙氨酸的生產(chǎn)主要是通過化學合成或采用天冬氨酸-α-脫羧酶以l-天冬氨酸為原料脫羧得到。一步酶法生產(chǎn)成本與化學合成生產(chǎn)成本比較接近；相比之下，以馬來酸為原料三酶偶聯(lián)催化制備β-丙氨酸省去了中間產(chǎn)物富馬酸和l-天冬氨酸的分離提取過程，協(xié)調(diào)酶催化反應條件，使多酶催化反應同時進行，簡化了生產(chǎn)流程，降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率，符合綠色環(huán)保和清潔生產(chǎn)的要求，實施效果突出，具有很好的應用價值。本發(fā)明反應原理如下：

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點：

(1)本發(fā)明采用的糞產(chǎn)堿菌alcaligenesfaecalis、大腸桿菌escherichiacoli和谷氨酸棒桿菌corynebacteriumglutamicum，在優(yōu)選的培養(yǎng)基中可以高效表達馬來酸異構(gòu)酶、天冬氨酸酶和天冬氨酸-α-脫羧酶，使三酶偶聯(lián)合成β-丙氨酸有較高的催化速率和轉(zhuǎn)化率，其中馬來酸摩爾轉(zhuǎn)化率達到95％以上。

(2)本發(fā)明利用成本低廉的馬來酸為原料，三酶偶聯(lián)生產(chǎn)β-丙氨酸簡化了生產(chǎn)流程，降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率，具有良好的經(jīng)濟效益和社會效益。

(3)本發(fā)明采用酶法催化制備β-丙氨酸，底物轉(zhuǎn)化完全，產(chǎn)物分離簡單。

(4)酶法合成β-丙氨酸具有反應條件溫和、酶立體選擇性強、催化效率高、工藝流程簡單等優(yōu)點，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

四、具體實施方式

以下實施例僅用于對本發(fā)明進行具體說明，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于以下實施例。

本發(fā)明所述以馬來酸為原料多酶偶聯(lián)制備β-丙氨酸的方法，由以下步驟構(gòu)成：

(1)將具有馬來酸異構(gòu)酶活性的糞產(chǎn)堿菌，具有天冬氨酸酶活性的大腸桿菌和具有天冬氨酸-α-脫羧酶活性的谷氨酸棒桿菌分別在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生高活性的馬來酸異構(gòu)酶、天冬氨酸酶和天冬氨酸-α-脫羧酶；

(2)培養(yǎng)基碳源采用葡萄糖或麥芽糖或蔗糖或乳糖，培養(yǎng)基中總碳源質(zhì)量濃度為1～30g/l；氮源采用牛肉膏或酵母膏或玉米漿或蛋白胨或豆餅水解液，培養(yǎng)基中總氮源質(zhì)量濃度為1～30g/l；

(3)將質(zhì)量濃度為50～200g/l的馬來酸水溶液用氨水調(diào)ph6～9，分別加入具有馬來酸異構(gòu)酶、天冬氨酸酶和天冬氨酸-α-脫羧酶活性的濕菌體或粗酶液，再加入質(zhì)量濃度為0.01～1.0g/l的磷酸吡哆醛、質(zhì)量濃度為0.01～1.0g/l的吐溫或十六烷基三甲基溴化銨或tritonx100，在30～50℃條件下進行酶促反應，利用等電點結(jié)晶或等電點結(jié)晶與離子交換樹脂相結(jié)合的方法分離反應生成的β-丙氨酸。

實施例一

1.取具有馬來酸異構(gòu)酶活性的糞產(chǎn)堿菌alcaligenesfaecalis濕菌體5g、具有天冬氨酸酶活性的大腸桿菌escherichiacoli濕菌體0.5g和具有天冬氨酸-α-脫羧酶活性的谷氨酸棒桿菌corynebacteriumglutamicum濕菌體10g，加入到1000ml轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含50g/l馬來酸、0.01g/l磷酸吡哆醛和0.01g/l吐溫80，ph6.0，30℃酶促反應15h，反應終止。反應結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中β-丙氨酸濃度為36.1g/l，對馬來酸摩爾轉(zhuǎn)化率為94％。

2.將轉(zhuǎn)化液4000r/min離心15min去除菌體，上清液升溫到70～80℃，加入活性炭脫色，脫色液經(jīng)過超濾和納濾凈化處理，凈化液真空濃縮至40ml，冷卻結(jié)晶至室溫，抽濾、烘干得固體β-丙氨酸14g。

3.將結(jié)晶母液稀釋后通過732型陽離子交換樹脂柱分離，用3％氨水洗脫β-丙氨酸飽和吸附柱，收集含β-丙氨酸的洗脫液500ml，活性炭脫色后真空濃縮至50ml，趁熱加入二倍體積95％乙醇，冷卻結(jié)晶至室溫，抽濾、烘干得固體β-丙氨酸18g，結(jié)晶母液回收乙醇后循環(huán)套用。兩次結(jié)晶共得β-丙氨酸32g，收率88.6％。

實施例二

1.取具有馬來酸異構(gòu)酶活性的糞產(chǎn)堿菌alcaligenesfaecalis濕菌體5g、具有天冬氨酸酶活性的大腸桿菌escherichiacoli濕菌體0.5g和具有天冬氨酸-α-脫羧酶活性的谷氨酸棒桿菌corynebacteriumglutamicum濕菌體15g，加入到1000ml轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含100g/l馬來酸、0.1g/l磷酸吡哆醛和0.1g/ltritonx100，ph7.0，37℃酶促反應20h，反應終止。反應結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中β-丙氨酸濃度為72.9g/l，對馬來酸摩爾轉(zhuǎn)化率為95％。

2.將轉(zhuǎn)化液4000r/min離心15min去除菌體，上清液升溫到70～80℃，加入活性炭脫色，脫色液經(jīng)過超濾和納濾凈化處理，凈化液真空濃縮至80ml，冷卻結(jié)晶至室溫，抽濾、烘干得固體β-丙氨酸29g。

3.將結(jié)晶母液稀釋后通過732型陽離子交換樹脂柱分離，用3％氨水洗脫β-丙氨酸飽和吸附柱，收集含β-丙氨酸的洗脫液1100ml，活性炭脫色后真空濃縮至100ml，趁熱加入二倍體積95％乙醇，冷卻結(jié)晶至室溫，抽濾、烘干得固體β-丙氨酸37g，結(jié)晶母液回收乙醇后循環(huán)套用。兩次結(jié)晶共得β-丙氨酸66g，收率90.5％。

實施例三

1.取具有馬來酸異構(gòu)酶活性的糞產(chǎn)堿菌alcaligenesfaecalis濕菌體10g、具有天冬氨酸酶活性的大腸桿菌escherichiacoli濕菌體1.0g和具有天冬氨酸-α-脫羧酶活性的谷氨酸棒桿菌corynebacteriumglutamicum濕菌體20g，加入到1000ml轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含100g/l馬來酸、0.1g/l磷酸吡哆醛和0.1g/lctab，ph8.0，42℃酶促反應18h，反應終止。反應結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中β-丙氨酸濃度為73.6g/l，對馬來酸摩爾轉(zhuǎn)化率為96％。

2.將轉(zhuǎn)化液4000r/min離心15min去除菌體，上清液升溫到70～80℃，加入活性炭脫色，脫色液經(jīng)過超濾和納濾凈化處理，凈化液真空濃縮至80ml，冷卻結(jié)晶至室溫，抽濾、烘干得固體β-丙氨酸29.5g。

3.將結(jié)晶母液稀釋后通過732型陽離子交換樹脂柱分離，用3％氨水洗脫β-丙氨酸飽和吸附柱，收集含β-丙氨酸的洗脫液1100ml，活性炭脫色后真空濃縮至100ml，趁熱加入二倍體積95％乙醇，冷卻結(jié)晶至室溫，抽濾、烘干得固體β-丙氨酸38g，結(jié)晶母液回收乙醇后循環(huán)套用。兩次結(jié)晶共得β-丙氨酸67.5g，收率91.7％。

實施例四

1.取具有馬來酸異構(gòu)酶活性的糞產(chǎn)堿菌alcaligenesfaecalis濕菌體10g、具有天冬氨酸酶活性的大腸桿菌escherichiacoli濕菌體1.0g和具有天冬氨酸-α-脫羧酶活性的谷氨酸棒桿菌corynebacteriumglutamicum濕菌體25g，加入到1000ml轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含150g/l馬來酸、0.5g/l磷酸吡哆醛和0.5g/l吐溫80，ph7.0，40℃酶促反應22h，反應終止。反應結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中β-丙氨酸濃度為110.5g/l，對馬來酸摩爾轉(zhuǎn)化率為96％。

2.將轉(zhuǎn)化液4000r/min離心15min去除菌體，上清液升溫到70～80℃，加入活性炭脫色，脫色液經(jīng)過超濾和納濾凈化處理，凈化液真空濃縮至120ml，冷卻結(jié)晶至室溫，抽濾、烘干得固體β-丙氨酸44g。

3.將結(jié)晶母液稀釋后通過732型陽離子交換樹脂柱分離，用3％氨水洗脫β-丙氨酸飽和吸附柱，收集含β-丙氨酸的洗脫液1600ml，活性炭脫色后真空濃縮至150ml，趁熱加入二倍體積95％乙醇，冷卻結(jié)晶至室溫，抽濾、烘干得固體β-丙氨酸55.8g，結(jié)晶母液回收乙醇后循環(huán)套用。兩次結(jié)晶共得β-丙氨酸99.8g，收率90.3％。

實施例五

1.取具有馬來酸異構(gòu)酶活性的糞產(chǎn)堿菌alcaligenesfaecalis濕菌體15g、具有天冬氨酸酶活性的大腸桿菌escherichiacoli濕菌體1.0g和具有天冬氨酸-α-脫羧酶活性的谷氨酸棒桿菌corynebacteriumglutamicum濕菌體20g，加入到1000ml轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含150g/l馬來酸、0.3g/l磷酸吡哆醛和0.3g/l吐溫80，ph6.0，40℃酶促反應25h，反應終止。反應結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中β-丙氨酸濃度為110.6g/l，對馬來酸摩爾轉(zhuǎn)化率為96％。

2.將轉(zhuǎn)化液4000r/min離心15min去除菌體，上清液升溫到70～80℃，加入活性炭脫色，脫色液經(jīng)過超濾和納濾凈化處理，凈化液真空濃縮至120ml，冷卻結(jié)晶至室溫，抽濾、烘干得固體β-丙氨酸44.8g。

3.將結(jié)晶母液稀釋后通過732型陽離子交換樹脂柱分離，用3％氨水洗脫β-丙氨酸飽和吸附柱，收集含β-丙氨酸的洗脫液1600ml，活性炭脫色后真空濃縮至150ml，趁熱加入二倍體積95％乙醇，冷卻結(jié)晶至室溫，抽濾、烘干得固體β-丙氨酸55.4g，結(jié)晶母液回收乙醇后循環(huán)套用。兩次結(jié)晶共得β-丙氨酸100.2g，收率90.6％。

實施例六

1.取具有馬來酸異構(gòu)酶活性的糞產(chǎn)堿菌alcaligenesfaecalis濕菌體12g、具有天冬氨酸酶活性的大腸桿菌escherichiacoli濕菌體0.8g和具有天冬氨酸-α-脫羧酶活性的谷氨酸棒桿菌corynebacteriumglutamicum濕菌體15g，加入到1000ml轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含150g/l馬來酸、0.3g/l磷酸吡哆醛和0.3g/l吐溫80，ph9.0，50℃酶促反應25h，反應終止。反應結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中β-丙氨酸濃度為107g/l，對馬來酸摩爾轉(zhuǎn)化率為93％。

2.將轉(zhuǎn)化液4000r/min離心15min去除菌體，上清液升溫到70～80℃，加入活性炭脫色，脫色液經(jīng)過超濾和納濾凈化處理，凈化液真空濃縮至120ml，冷卻結(jié)晶至室溫，抽濾、烘干得固體β-丙氨酸42.2g。

3.將結(jié)晶母液稀釋后通過732型陽離子交換樹脂柱分離，用3％氨水洗脫β-丙氨酸飽和吸附柱，收集含β-丙氨酸的洗脫液1600ml，活性炭脫色后真空濃縮至150ml，趁熱加入二倍體積95％乙醇，冷卻結(jié)晶至室溫，抽濾、烘干得固體β-丙氨酸53.4g，結(jié)晶母液回收乙醇后循環(huán)套用。兩次結(jié)晶共得β-丙氨酸95.6g，收率89.3％。

實施例七

1.取具有馬來酸異構(gòu)酶活性的糞產(chǎn)堿菌alcaligenesfaecalis濕菌體20g、具有天冬氨酸酶活性的大腸桿菌escherichiacoli濕菌體1.0g和具有天冬氨酸-α-脫羧酶活性的谷氨酸棒桿菌corynebacteriumglutamicum濕菌體30g，加入到1000ml轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含200g/l馬來酸、1.0g/l磷酸吡哆醛和1.0g/ltritonx100，ph7.0，40℃酶促反應29h，反應終止。反應結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中β-丙氨酸濃度為145.8g/l，對馬來酸摩爾轉(zhuǎn)化率為95％。

2.將轉(zhuǎn)化液4000r/min離心15min去除菌體，上清液升溫到70～80℃，加入活性炭脫色，脫色液經(jīng)過超濾和納濾凈化處理，凈化液真空濃縮至160ml，冷卻結(jié)晶至室溫，抽濾、烘干得固體β-丙氨酸59.2g。

3.將結(jié)晶母液稀釋后通過732型陽離子交換樹脂柱分離，用3％氨水洗脫β-丙氨酸飽和吸附柱，收集含β-丙氨酸的洗脫液2200ml，活性炭脫色后真空濃縮至200ml，趁熱加入二倍體積95％乙醇，冷卻結(jié)晶至室溫，抽濾、烘干得固體β-丙氨酸72.2g，結(jié)晶母液回收乙醇后循環(huán)套用。兩次結(jié)晶共得β-丙氨酸131.4g，收率90.1％。

實施例八

1.取具有馬來酸異構(gòu)酶活性的糞產(chǎn)堿菌alcaligenesfaecalis濕菌體20g、具有天冬氨酸酶活性的大腸桿菌escherichiacoli濕菌體1.0g和具有天冬氨酸-α-脫羧酶活性的谷氨酸棒桿菌corynebacteriumglutamicum濕菌體40g，加入到1000ml轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含200g/l馬來酸、1.0g/l磷酸吡哆醛和1.0g/lctab，ph6.0，42℃酶促反應24h，反應終止。反應結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中β-丙氨酸濃度為147.4g/l，對馬來酸摩爾轉(zhuǎn)化率為96％。

2.將轉(zhuǎn)化液4000r/min離心15min去除菌體，上清液升溫到70～80℃，加入活性炭脫色，脫色液經(jīng)過超濾和納濾凈化處理，凈化液真空濃縮至160ml，冷卻結(jié)晶至室溫，抽濾、烘干得固體β-丙氨酸60.3g。

3.將結(jié)晶母液稀釋后通過732型陽離子交換樹脂柱分離，用3％氨水洗脫β-丙氨酸飽和吸附柱，收集含β-丙氨酸的洗脫液2200ml，活性炭脫色后真空濃縮至200ml，趁熱加入二倍體積95％乙醇，冷卻結(jié)晶至室溫，抽濾、烘干得固體β-丙氨酸73.9g，結(jié)晶母液回收乙醇后循環(huán)套用。兩次結(jié)晶共得β-丙氨酸134.2g，收率91％。