一、技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸的酶法轉化制備方法。

二、

背景技術：

在醫(yī)藥領域,3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸是合成l-多巴和莫西普利等藥物的重要前體原料。

l-多巴是生物體內(nèi)一種重要的活性物質，通過血腦屏障進入腦組織，經(jīng)多巴脫羧酶脫羧而轉變成多巴胺發(fā)揮作用。適用于原發(fā)性震顫麻痹癥及非藥原性震顫麻痹綜合征，主要用于治療帕金森綜合癥。近年來文獻報道化學法制備l-多巴的方法主要以3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸為前體原料，經(jīng)過酸化，脫甲基過程制備l-多巴。翟寧等(cn104725259a)以3,4-二甲氧基苯丙氨酸酯為原料，l-酒石酸衍生物為拆分劑，得到3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸酯，在經(jīng)過水解，脫保護可以進一步制備左旋多巴合成路線如下。

莫西普利是一種新型長效非巰基的血管緊張素轉化酶抑制劑(acei)，對輕，中，重度高血壓都有效，降低收縮壓作用強于卡托普利?？梢灾委煾鞣N原因引起的心力衰竭。自從莫西普利用于臨床以來，發(fā)展迅速，已成為臨床上治療高血壓、慢性心功能不全等心血管疾病的重要藥物。目前文獻報道莫西普利的制備方法是以3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸為原料經(jīng)過環(huán)化，芐基保護，縮合等四步反應制得。

合成路線如下：

從上面的兩個合成路線可以得出,要想高效、綠色、低成本制備l-多巴和莫西普利,關鍵步驟是能夠高效、綠色、低成本制備前體原料3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸。

根據(jù)目前文獻報道，3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸制備方法主要為化學合成法，分為以下幾種：

n.j.rreilly等(synthesis-stuttgart,1990,7,550-556.)以藜蘆醛為原料，r-prophos為催化劑，經(jīng)縮合，不對稱催化加氫，酸化水解等步驟制得，最終得到產(chǎn)物3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸產(chǎn)率90％，ee值為88.3％。

a.torrado等(j.org.chem.,1996,61,8940-8948.)以藜蘆醇為原料，經(jīng)過溴代，取代，酸化水解得到(dl)3,4-二甲氧基苯丙氨酸，再經(jīng)過甲酯化，用選擇性的蛋白水解酶得到ee值為99％的3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸，收率為76％。

o.f.kuznetsova等(radiochemistry,2002,44(6),527-532)用藜蘆醇為原料，經(jīng)過親核加成，還原等反應再用ni-bpb-gly催化氫化反應制得ee值為84％～95％的3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸，收率為8.4％。

v.r.arava等(synth.commun.,2013,43,2892-2897)以藜蘆醛為原料，[(s)-binaprucl(benzene)]cl為催化劑50℃不對稱催化加氫制得ee值為77.5％的3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸，收率為82.0％。

以上化學法制備3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸的路線中需要大量金屬催化物，有毒反應物和有機溶劑，嚴重污染環(huán)境，成本高、產(chǎn)物得率低且在不對稱合成過程中，步驟較為繁瑣，拆分試劑毒性較大，產(chǎn)品的比旋光不高。尤其是d-多巴對人體有較大毒副作用，化學不對稱合成的l-多巴很難達到藥劑使用要求。因此能否高效、綠色、低成本制備l-多巴和莫西普利前體原料3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸尤為關鍵。

三、

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明需要解決的問題是提供一種高效、綠色、低成本制備3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸的方法。將l-天冬氨酸加入濃度為22.5～135g/l的3,4-二甲氧基苯丙酮酸水溶液中，naoh水溶液調(diào)ph7～11，再加入具有天冬氨酸轉氨酶活性的濕菌體或酶粗提液，濃度為0.01～0.1g/l的磷酸吡哆醛和濃度為0.2～2.0g/l的吐溫-80或十六烷基三甲基溴化銨或tritonx-100，在25～55℃條件下進行酶促反應，等電點結晶法分離制備轉化產(chǎn)物3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸。

本發(fā)明可以通過以下技術方案來達到：

3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸的酶法轉化制備方法，其步驟為：

(1)將具有天冬氨酸轉氨酶活性的菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生高酶活的天冬氨酸轉氨酶；

(2)將l-天冬氨酸加入濃度為22.5～135g/l的3,4-二甲氧基苯丙酮酸轉化液中，naoh水溶液調(diào)ph7～11，再加入具有天冬氨酸轉氨酶活性的濕菌體或酶粗提液，磷酸吡哆醛和表面活性劑，在25～55℃條件下進行酶促反應，等電點結晶法分離制備轉化產(chǎn)物3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸。

上述步驟(1)所述的天冬氨酸轉氨酶菌株為大腸桿菌或檸檬酸桿菌或歐文氏菌。培養(yǎng)基碳源采用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和/或果糖，培養(yǎng)基中總碳源質量濃度為1～30g/l；氮源采用牛肉膏、酵母膏、玉米漿、蛋白胨和/或豆餅水解液，培養(yǎng)基中總氮源質量濃度為1～30g/l。

上述步驟(2)所述的含3,4-二甲氧基-l-苯丙酮酸水溶液，含量為22.5～135g/l，酶促反應中3,4-二甲氧基苯丙酮酸與l-天冬氨酸的摩爾比為1:1；磷酸吡哆醛濃度為0.01～0.1g/l；所述的表面活性劑為吐溫-80或十六烷基三甲基溴化銨或tritonx-100，其濃度為0.2～2.0g/l。

目前文獻報道，3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸制備方法主要為化學合成法，采用不對稱催化氫化法制備，由于使用具有知識產(chǎn)權的手性配體，技術壁壘較高，同時手性配體和重金屬催化劑鎳、銠等，價格較為昂貴，現(xiàn)有技術無法回收，雖然使用量為催化量，但成本依然不低，而且最終產(chǎn)品可能導致重金屬殘留，生產(chǎn)過程環(huán)保壓力大，不適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，滿足不了市場需求。尤其是產(chǎn)品的光學純度不高，d-多巴對人體有較大毒副作用，化學不對稱合成的l-多巴很難達到藥劑使用要求。

本發(fā)明使用具有天冬氨酸轉氨酶活性的菌體細胞或粗酶液，在適當條件下催化3,4-二甲氧基苯丙酮酸制備3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸，具有專一性強、催化效率高、反應條件溫和、反應周期短、產(chǎn)物易于分離等優(yōu)點，3,4-二甲氧基苯丙酮酸的摩爾轉化率達到90％以上，光學純度達到99％，生產(chǎn)成本大幅度降低，符合綠色化工要求，具有重大突出實施效果和工業(yè)化應用價值。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有如下優(yōu)點：

(1)本發(fā)明利用天冬氨酸轉氨酶催化3,4-二甲氧基苯丙酮酸制備3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸，酶法轉化效率高，酶立體選擇性強，其中3,4-二甲氧基苯丙酮酸摩爾轉化率達到90％以上，產(chǎn)品的光學純度達到99％以上，完全可以滿足市場需要。

(2)酶法制備3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸避免使用有毒反應物，有機溶劑，手性配體和重金屬催化劑鎳、銠等催化劑，降低了生產(chǎn)成本，減小了環(huán)保壓力，實施效果突出，具有良好的經(jīng)濟效益和社會效益。

(3)酶促反應生成的3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸在水中溶解度較小，只需用等電點結晶法即可實現(xiàn)分離。

(4)酶法合成3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸具有反應條件溫和，酶立體選擇性強，成本低，工藝流程簡單等優(yōu)點，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

四、具體實施方式

以下實施例僅用于對本發(fā)明進行具體說明，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于以下實施例。

實施例一

1.將13.3gl-天冬氨酸加入到1000ml濃度為22.5g/l3,4-二甲氧基苯丙酮酸轉化液中，30％naoh溶液調(diào)ph7，再加入20g具有天冬氨酸轉氨酶活性的檸檬酸桿菌濕菌體，濃度為0.01g/l的磷酸吡哆醛和0.2g/l的吐溫80，25℃酶促反應24h，反應結束后總體積1050ml。取樣，hplc檢測轉化液中3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸濃度為13.7g/l，對底物摩爾轉化率為61％。

2.將轉化液8000r/min離心15min，收集濕細胞和固體3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸混合物34.5g，用400ml純水溶解固體混合物，滴加30％naoh溶液調(diào)ph11，攪拌將固體3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸溶解完全，加活性炭脫色除去菌體細胞，濾液用6nhcl溶液調(diào)ph6.0～7.0，攪拌結晶，真空抽濾，用少量純水洗滌產(chǎn)品，烘干得3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸11.5g，收率51％，比旋光(c＝1，4mol/lhcl)。

實施例二

1.將79.8gl-天冬氨酸加入到1000ml濃度為135g/l3,4-二甲氧基苯丙酮酸轉化液中，30％naoh溶液調(diào)ph11，再加入20g具有天冬氨酸轉氨酶活性的歐文氏菌濕菌體，濃度為0.1g/l的磷酸吡哆醛和2.0g/l的吐溫80，55℃酶促反應24h，反應結束后總體積1300ml。取樣，hplc檢測轉化液中3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸濃度為36.45g/l，對底物摩爾轉化率為27％。

2.將轉化液8000r/min離心15min，收集濕細胞和固體3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸混合物56.5g，用400ml純水溶解固體混合物，滴加30％naoh溶液調(diào)ph11，攪拌將固體3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸溶解完全，加活性炭脫色除去菌體細胞，濾液用6nhcl溶液調(diào)ph6.0～7.0，攪拌結晶，真空抽濾，用少量純水洗滌產(chǎn)品，烘干得3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸33.75g，收率25％，比旋光(c＝1，4mol/lhcl)。

實施例三

1.將53.2gl-天冬氨酸加入到1000ml濃度為90g/l3,4-二甲氧基苯丙酮酸轉化液中，30％naoh溶液調(diào)ph8，再加入20g具有天冬氨酸轉氨酶活性的大腸桿菌濕菌體，濃度為0.1g/l的磷酸吡哆醛和2.0g/l的吐溫80，40℃酶促反應24h，反應結束后總體積1100ml。取樣，hplc檢測轉化液中3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸濃度為83.7g/l，對底物摩爾轉化率為93％。

2.3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸分離純化方法同實施例二，烘干得3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸81.9g，收率91％，比旋光(c＝1，4mol/lhcl)。

實施例四

1.將66.5gl-天冬氨酸加入到1000ml濃度為112.5g/l3,4-二甲氧基苯丙酮酸轉化液中，30％naoh溶液調(diào)ph8，再加入20g具有天冬氨酸轉氨酶活性的大腸桿菌濕菌體，濃度為0.1g/l的磷酸吡哆醛和2.0g/l的吐溫80，40℃酶促反應24h，反應結束后總體積1230ml。取樣，hplc檢測轉化液中3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸濃度為105.7g/l，對底物摩爾轉化率為94％。

2.3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸分離純化方法同實施例二，烘干得3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸103.5g，收率92％，比旋光(c＝1，4mol/lhcl)。

實施例五

1.將13.3gl-天冬氨酸加入到1000ml濃度為22.5g/l3,4-二甲氧基苯丙酮酸轉化液中，30％naoh溶液調(diào)ph8，再加入20g具有天冬氨酸轉氨酶活性的大腸桿菌濕菌體，濃度為0.1g/l的磷酸吡哆醛和2.0g/l的吐溫80，30℃酶促反應24h，反應結束后總體積1050ml。取樣，hplc檢測轉化液中3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸濃度為18.4g/l，對底物摩爾轉化率為82％。

2.3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸分離純化方法同實施例一，烘干得3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸17.3g，收率77％，比旋光(c＝1，4mol/lhcl)。

實施例六

1.將13.3gl-天冬氨酸加入到1000ml濃度為22.5g/l3,4-二甲氧基苯丙酮酸轉化液中，30％naoh溶液調(diào)ph8，再加入20g具有天冬氨酸轉氨酶活性的大腸桿菌濕菌體，濃度為0.1g/l的磷酸吡哆醛和2.0g/l的吐溫80，40℃酶促反應24h，反應結束后總體積1050ml。取樣naoh溶液溶解hplc檢測轉化液中3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸濃度為20.9g/l，對底物摩爾轉化率為93％。

2.3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸分離純化方法同實施例一，烘干得3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸20.3g，收率90％，比旋光(c＝1，4mol/lhcl)。

實施例七

1.將13.3gl-天冬氨酸加入到1000ml濃度為22.5g/l3,4-二甲氧基苯丙酮酸轉化液中，30％naoh溶液調(diào)ph7，再加入20g具有天冬氨酸轉氨酶活性的大腸桿菌濕菌體，濃度為0.1g/l的磷酸吡哆醛和2.0g/l的吐溫80，40℃酶促反應24h，反應結束后總體積1050ml。取樣，hplc檢測轉化液中3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸濃度為19.1g/l，對底物摩爾轉化率為85％。

2.3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸分離純化方法同實施例一，烘干得3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸18.5g，收率82％，比旋光(c＝1，4mol/lhcl)。

實施例八

1.將13.3gl-天冬氨酸加入到1000ml濃度為22.5g/l3,4-二甲氧基苯丙酮酸轉化液中，30％naoh溶液調(diào)ph9，再加入20g具有天冬氨酸轉氨酶活性的大腸桿菌濕菌體，濃度為0.1g/l的磷酸吡哆醛和2.0g/l的吐溫80，40℃酶促反應24h，反應結束后總體積1050ml。取樣，hplc檢測轉化液中3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸濃度為18.7g/l，對底物摩爾轉化率為83％。

2.3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸分離純化方法同實施例一，烘干得3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸18.4g，收率81％，比旋光(c＝1，4mol/lhcl)。