本發(fā)明屬于領(lǐng)域化學(xué)合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酶法合成l-2-氨基丁酸的方法。

背景技術(shù)：

l-2-氨基丁酸是生產(chǎn)新型抗癲癇藥左乙拉西坦的關(guān)鍵中間體，也是合成抑菌抗結(jié)核藥乙胺丁醇的關(guān)鍵手性前體，是多種手性藥物的重要手性中間體。近年來(lái)，l-2-氨基丁酸的合成技術(shù)成為了基因工程制藥的研究熱點(diǎn)。很多研究利用fdh構(gòu)建nadh再生體系，并與亮氨酸脫氫酶共表達(dá)，通過構(gòu)建雙酶偶聯(lián)的催化系統(tǒng)，以2-酮丁酸為底物生成l-2-氨基丁酸，解決了nadh價(jià)格昂貴的問題，很大程度上節(jié)省了成本。

但是目前合成l-2-氨基丁酸的方法一般成本較高，或者轉(zhuǎn)化率較低，比如申請(qǐng)?zhí)枮?0101014469206的發(fā)明專利公開了一種酶法制備l-2-氨基丁酸的方法，其采用的是l-蘇氨酸為起始原料，首先通過蘇氨酸脫氨酶使其反應(yīng)轉(zhuǎn)化為l-2酮酸，然后使用亮氨酸脫氫酶使l-2酮酸反應(yīng)轉(zhuǎn)化為l-2-氨基丁酸，并且反應(yīng)中加入了用于輔酶再生的甲酸脫氫酶。此方法采用的是“一鍋煮”的形式，這種方式雖然操作相對(duì)來(lái)說比較簡(jiǎn)單，但是反應(yīng)中存在未反應(yīng)物或者反應(yīng)不徹底，轉(zhuǎn)化率低的問題，因此，需要一種新的方法來(lái)解決這個(gè)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新的酶法合成l-2-氨基丁酸的方法，用以解決現(xiàn)有技術(shù)中轉(zhuǎn)化率低的問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：

本發(fā)明以2-酮丁酸為底物，通過丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶催化生產(chǎn)l-2-氨基丁酸。

具體技術(shù)方案如下：以甲酸脫氫酶催化甲酸銨產(chǎn)生過量的nh3，然后2-酮丁酸和nh3在丙氨酸脫氫酶的催化下被還原成l-2-氨基丁酸。其中丙氨酸脫氫酶的還原活性需要輔酶nadh，甲酸脫氫酶的氧化活性需要nad+，由此形成循環(huán)的輔酶再生系統(tǒng)，解決了nadh價(jià)格昂貴的問題。

優(yōu)選地，所述丙氨酸脫氫酶來(lái)自于嗜熱脂肪土芽孢桿菌，但不局限于此菌，該菌中所含的丙氨酸脫氫酶對(duì)氨基丁酸的低親和力成為其催化2-酮丁酸的一大優(yōu)勢(shì)。

本發(fā)明中的甲酸脫氫酶來(lái)自于釀酒酵母，但不局限于釀酒酵母，用于輔酶nadh的再生。

本發(fā)明中一種優(yōu)選的實(shí)施方式，將丙氨酸脫氫酶基因和甲酸脫氫酶基因分別克隆至表達(dá)載體，導(dǎo)入到大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)基因的表達(dá)，然后收集表達(dá)丙氨酸脫氫酶的細(xì)胞和表達(dá)甲酸脫氫酶的細(xì)胞，菌體放入-80℃保存24h，菌體融化后直接添加于催化體系中催化生產(chǎn)l-2-氨基丁酸。具體地，所述方法如下：

(1)甲酸脫氫酶fdh和丙氨酸脫氫酶alad的異源表達(dá)：分別構(gòu)建fdh和alad的基因工程菌，經(jīng)發(fā)酵分別制得表達(dá)fdh和alad的菌體——甲酸脫氫酶濕菌體和丙氨酸脫氫酶濕菌體；

(2)然后將2-酮丁酸0.5-1.5mol、甲酸銨0.5-1.5mol、甲酸脫氫酶濕菌體10-30g/l、丙氨酸脫氫酶濕菌體10-30g/l置于反應(yīng)器中混合均勻，調(diào)節(jié)ph值為7.0-9.0，溫度為30-37℃，催化反應(yīng)16-20h，得到l-2-氨基丁酸。

其中步驟(1)的具體方法如下：

(a)構(gòu)建alad載體：

利用bamhi和ecori分別將alad基因和pet32a載體雙酶切，然后二者進(jìn)行連接構(gòu)建得到重組表達(dá)alad的質(zhì)粒pet32a-alad；

(b)構(gòu)建fdh載體：

利用bamhi和ecori分別將fdh基因和pet28a載體雙酶切，然后二者進(jìn)行連接構(gòu)建得到重組表達(dá)fdh的質(zhì)粒pet28a-fdh；

(c)構(gòu)建分別表達(dá)alad和fdh的基因工程菌；

將質(zhì)粒pet32a-alad和質(zhì)粒pet28a-fdh分別轉(zhuǎn)入e.colibl21，得到分別重組表達(dá)alad和fdh的菌株bl21-alad和bl21-fdh；

(d)將菌株bl21-alad在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入0.1-0.5％的乳糖25-30℃誘導(dǎo)表達(dá)16h，離心收集菌體即得所述alad表達(dá)菌體；

(e)將菌株bl21-fdh在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入0.1-0.5％的乳糖25-30℃誘導(dǎo)表達(dá)16h，離心收集菌體即得所述fdh表達(dá)菌體。

其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖2％、硫酸銨0.3％、蛋白胨0.5％、酵母浸粉2％、kh2po41.25％、mgso40.1％、檸檬酸0.15％和乳糖0.1-0.5％，發(fā)酵條件：ph7.0，溫度37℃，誘導(dǎo)后降溫至25-30℃，發(fā)酵結(jié)束后再以6000rpm轉(zhuǎn)速離心10min，-20℃保存菌體備用。

本發(fā)明中的一種優(yōu)選的實(shí)施方式，將丙氨酸脫氫酶基因和甲酸脫氫酶基因分別克隆至表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)入到大腸桿菌進(jìn)行基因的共表達(dá)，然后收集共表達(dá)丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶細(xì)胞的菌體，-80℃凍融后直接添加于催化體系中催化生產(chǎn)l-2-氨基丁酸。具體地，所述方法如下：

(1)甲酸脫氫酶fdh和丙氨酸脫氫酶alad的共表達(dá)：構(gòu)建fdh和alad的共表達(dá)的基因工程菌，經(jīng)發(fā)酵制得共表達(dá)fdh和alad的菌體；

(2)然后將2-酮丁酸0.5-1.5mol、甲酸銨0.5-1.5mol、nad0-0.5g/l、甲酸脫氫酶和丙氨酸脫氫酶共表達(dá)濕菌體15-20g/l置于反應(yīng)器中混合均勻，調(diào)節(jié)ph值為7.0-9.0，溫度為30-37℃，催化反應(yīng)16-20h，得到l-2-氨基丁酸。

其中，步驟(1)的具體方法如下：

(a)構(gòu)建alad載體：

利用bamhi和ecori分別將alad基因和pet32a載體雙酶切，然后二者進(jìn)行連接構(gòu)建得到重組表達(dá)alad的質(zhì)粒pet32a-alad；

(b)構(gòu)建fdh載體：

利用bamhi和ecori分別將fdh基因和pet28a載體雙酶切，然后二者進(jìn)行連接構(gòu)建得到重組表達(dá)fdh的質(zhì)粒pet28a-fdh；

(c)構(gòu)建共表達(dá)alad和fdh的基因工程菌：

將質(zhì)粒pet32a-alad和質(zhì)粒pet28a-fdh轉(zhuǎn)入同一株e.colibl21(de3)，得到共表達(dá)alad和fdh的菌株bl21-alad/fdh；

(d)將菌株bl21-alad/fdh在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入0.1-0.5％的乳糖25-30℃誘導(dǎo)表達(dá)16h，離心收集菌體即得所述alad/fdh共表達(dá)菌體。

更進(jìn)一步地，其中所述alad基因的克隆方法為：以嗜熱脂肪土芽孢桿菌總dna為模板，分別以上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，從而得到所述alad基因，其中，上游引物為5’-aaggatccatgaagatcggcattccaaaag-3’(大寫處為bamhi酶切位點(diǎn))，如seqno.1所示；下游引物為5’-ttgaattctcatccctgcagcaacgaatgaac-3’(大寫處為ecori酶切位點(diǎn))，如seqno.2所示。所述alad基因序列的基因庫(kù)登錄號(hào)為：ef154460。

所述fdh基因的克隆方法為：以釀酒酵母總dna為模板，分別以上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，從而獲得所述fdh基因，其中，上游引物為5’-aaggatccatgtcgaagggaaaggttttgc-3’(大寫處為bamhi酶切位點(diǎn))，如seqno.3所示；下游引物為5’-aagaattcttatttcttctgtccataagctc-3’(大寫處為ecori酶切位點(diǎn))，如seqno.4所示。進(jìn)一步地，所述fdh基因序列的基因庫(kù)登錄號(hào)為：nm_001183808。

更進(jìn)一步地，重組蛋白alad表達(dá)的檢測(cè)方法：將上述得到的表達(dá)菌株bl21-alad在含有amp的lb液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，菌體od600達(dá)到0.4-0.6后，加入iptg(異丙基-β-d-硫代半乳糖苷)至終濃度為0.1mm，25℃誘導(dǎo)表達(dá)16h，分別收集加入iptg誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)結(jié)束后的菌體，利用聚丙烯胺凝膠電泳檢測(cè)重組蛋白alad的表達(dá)。

其中重組蛋白fdh表達(dá)的檢測(cè)方法：所得到的表達(dá)菌株bl21-fdh在含有kana的lb液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，菌體od600達(dá)到0.4-0.6后，加入iptg至終濃度為0.1mm，25℃誘導(dǎo)表達(dá)16h，分別收集加入iptg誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)結(jié)束后的菌體，利用聚丙烯胺凝膠電泳檢測(cè)重組蛋白fdh的表達(dá)。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明采用的來(lái)源于嗜熱脂肪土芽孢桿菌的丙氨酸脫氫酶在氧化脫氨反應(yīng)和還原反應(yīng)中對(duì)底物專一性各不相同，在氧化脫氨反應(yīng)中，除了l-丙氨酸外，對(duì)其它氨基酸具有極低的活性，尤其對(duì)l-2-氨基丁酸的幾乎沒有活性。但是在還原氨化反應(yīng)中，該酶對(duì)2-羰基2-酮丁酸具有一定的活性，并且其反應(yīng)速率大于以丙酮酸為底物時(shí)的反應(yīng)速率，該酶以2-酮丁酸為底物還原氨化形成l-2-氨基丁酸的優(yōu)點(diǎn)在于：反應(yīng)速率快，且逆向氧化脫氨活性極低，大大減少了產(chǎn)物的損失。

本發(fā)明采用丙氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶以2-酮丁酸和甲酸銨為底物生產(chǎn)l-2-氨基丁酸，轉(zhuǎn)化率為95％。沒有副產(chǎn)物的影響，適合工業(yè)生產(chǎn)。

附圖說明

圖1顯示了質(zhì)粒pet32a-alad和質(zhì)粒pet28a-fdh的雙酶切驗(yàn)證，其中泳道1是bamhi/ecori雙酶切驗(yàn)證質(zhì)粒pet32a-alad；泳道2dnamarker；泳道3是bamhi/ecori雙酶切驗(yàn)證質(zhì)粒pet28a-fdh。

圖2顯示了alad重組蛋白的sds-page檢測(cè)，泳道1是蛋白質(zhì)marker，泳道2是bl21-alad誘導(dǎo)前產(chǎn)物，泳道3是bl21-alad誘導(dǎo)后產(chǎn)物。

圖3顯示了fdh重組蛋白的sds-page檢測(cè)，泳道1是bl21-fdh誘導(dǎo)后產(chǎn)物，泳道2是bl21-fdh誘導(dǎo)前產(chǎn)物，泳道3是蛋白質(zhì)marker。

圖4顯示了2，4-二硝基氟苯衍生化-hplc法測(cè)定化合物1的保留時(shí)間；

圖5顯示了共表達(dá)alad/fdh重組蛋白的sds-page檢測(cè)，泳道1是蛋白質(zhì)marker，泳道2是bl21-alad/fdh誘導(dǎo)前產(chǎn)物，泳道3是bl21-alad/fdh誘導(dǎo)后產(chǎn)物。

具體實(shí)施方式

下面將通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。提供這些實(shí)施例是為了能夠更透徹地理解本發(fā)明，并且能夠?qū)⒈景l(fā)明的范圍完整的傳達(dá)給本領(lǐng)域的技術(shù)人員。

如在通篇說明書及權(quán)利要求當(dāng)中所提及的“包含”或“包括”為一開放式用語(yǔ)，故應(yīng)解釋成“包含但不限定于”。說明書后續(xù)描述為實(shí)施本發(fā)明的較佳實(shí)施方式，然所述描述乃以說明書的一般原則為目的，并非用以限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視所附權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。

本發(fā)明中使用的色譜儀是美國(guó)agilent公司生產(chǎn)的1200型高效液相色譜儀。

本發(fā)明中使用的材料如下：大腸桿菌e.colidh5α、e.colibl21(de3)、transtaqdna聚合酶、t4dna連接酶、標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子量(mr)dna(即dnamarker，mr250～10，000)、標(biāo)準(zhǔn)mr蛋白質(zhì)等試劑均可購(gòu)置于北京全式金生物技術(shù)有限公司；酮丁酸和l-2-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)sigma-aldrich公司)；氨芐霉素(amp)、卡那霉素(kana)和nad+均購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司；蛋白胨和酵母提取物(英國(guó)oxoid公司)；其他試劑均購(gòu)自國(guó)藥試劑有限公司。

lb培養(yǎng)基/g·l^-1：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，ph7.0。

實(shí)施例1一種酶法合成2-氨基丁酸的方法，具體步驟如下：

一、丙氨酸脫氫酶alad和甲酸脫氫酶fdh的異源表達(dá)：

1、丙氨酸脫氫酶alad的異源表達(dá)與酶活測(cè)定：

(1)獲得alad基因片段

根據(jù)丙氨酸脫氫酶(alad)基因序列(基因庫(kù)登錄號(hào)：ef154460，seqidno.1)及前后序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過篩選獲得的較佳的丙氨酸脫氫酶(alad)上游引物為上游引物為5’-aaggatccatgaagatcggcattccaaaag-3’(大寫處為bamhi酶切位點(diǎn)，seqidno.2)；下游引物為5’-ttgaattctcatccctgcagcaacgaatgaac-3’(大寫處為ecori酶切位點(diǎn)，seqidno.3)。以上述上下游引物擴(kuò)增可以高效的獲得alad基因片段。

(2)pcr反應(yīng)體系

transtaqdna聚合酶pcr反應(yīng)體系如下所示：

模板(嗜熱脂肪土芽孢桿菌總dna)200ng，上游引物(10μm)1μl，下游引物(10μm)1μl，dntp(10mm)0.4μl，10×緩沖液2μl，transtaqdna聚合酶0.2μl，ddh20補(bǔ)足20μl。

(3)pcr反應(yīng)程序

pcr反應(yīng)程序：共30個(gè)循環(huán)，alad基因片段大小約為1122bp。

步驟1：94℃，40s變性

步驟2：56℃，40s退火

步驟3：72℃，1.5min延伸

將alad基因連入使用bamhi和ecori雙酶切的pet32a載體，構(gòu)建得到重組表達(dá)alad的質(zhì)粒pet32a-alad。使用bamhi和ecori雙酶切驗(yàn)證所構(gòu)建的質(zhì)粒，電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物得到2條條帶(5.9kb和1.1kb)，與預(yù)期相符(見圖1，泳道1為pet32a-alad酶切電泳，泳道2為dna分子量marker)。將pet32a-alad轉(zhuǎn)化入e.colibl21(de3)，得到alad表達(dá)菌株bl21-alad。

將表達(dá)菌株bl21-alad接入lb培養(yǎng)基(含amp100ng/ml)中，37℃培養(yǎng)。當(dāng)od600值達(dá)到0.4～0.6時(shí)，加入異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)至終濃度為0.1mmol/l，25℃誘導(dǎo)16h，sds-page電泳檢測(cè)可溶性蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明加入iptg后，alad(mr約3.95×104d)有明顯表達(dá)條帶，與預(yù)期大小相符。iptg誘導(dǎo)前后alad表達(dá)的sds-page檢測(cè)結(jié)果見圖2(泳道3箭頭所示為誘導(dǎo)蛋白，泳道2為空載體陰性對(duì)照，泳道1為蛋白質(zhì)分子量marker)。

按文獻(xiàn)方法，以2-酮丁酸為底物，測(cè)定alad破菌上清液的酶活力，結(jié)果表明，alad破菌上清液催化產(chǎn)生nad+的活性約為8.12u/ml。一個(gè)酶活力單位(u)定義為在測(cè)定條件下，每分鐘產(chǎn)生1mol產(chǎn)物所需的酶量。

2、fdh的異源表達(dá)和酶活測(cè)定：

(1)獲得fdh基因片段

根據(jù)fdh的基因序列(基因庫(kù)登錄號(hào)：nm_001183808，seqidno.4)設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過篩選獲得較佳的甲酸脫氫酶(fdh)上游引物為5’-aaggatccatgtcgaagggaaaggttttgc-3’(大寫處為bamhi酶切位點(diǎn)，seqidno.5)；下游引物為5’-aagaattcttatttcttctgtccataagctc-3’(大寫處為ecori酶切位點(diǎn)，seqidno.6)。以上述上下游引物擴(kuò)增可以高效的獲得fdh基因片段。

(2)pcr反應(yīng)體系

transtaqdna聚合酶pcr反應(yīng)體系如下所示：

模板(釀酒酵母總dna)200ng，上游引物(10μm)1μl，下游引物(10μm)1μl，dntp(10mm)0.4μl，10×緩沖液2μl，transtaqdna聚合酶0.2μl，ddh2o補(bǔ)足20μl。

(3)pcr反應(yīng)程序

pcr反應(yīng)程序：共30個(gè)循環(huán)，fdh基因片段大小約為1131bp。

步驟1：94℃，40s變性；

步驟2：56℃，40s退火；

步驟3：步驟3：72℃，1.5min延伸。

將fdh基因連入使用bamhi和ecori雙酶切的pet28a載體，構(gòu)建得到重組表達(dá)fdh的質(zhì)粒pet28a-fdh。使用bamhi和ecori雙酶切驗(yàn)證所構(gòu)建的質(zhì)粒，電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物得到2條條帶(5.9kb和1.1kb)，與預(yù)期相符(如圖1，泳道3為pet28a-fdh酶切電泳，泳道2為dna分子量標(biāo)準(zhǔn))。將pet28a-fdh轉(zhuǎn)化入e.colibl21(de3)，得到fdh表達(dá)菌株bl21-fdh。

將表達(dá)菌株bl21-fdh接入lb培養(yǎng)基(含kana50ng/ml)中，37℃培養(yǎng)。當(dāng)od600值達(dá)到0.4～0.6時(shí)，加入異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)至終濃度為0.1mmol/l，25℃誘導(dǎo)16h，sds-page電泳檢測(cè)可溶性蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明加入iptg后，fdh(mr約4.18×104d)有明顯表達(dá)條帶，與預(yù)期大小相符。iptg誘導(dǎo)前后fdh表達(dá)的sds-page檢測(cè)結(jié)果見圖3(泳道1為箭頭所示為誘導(dǎo)蛋白，泳道2為空載體陰性對(duì)照，泳道3為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn))。

按文獻(xiàn)方法，以甲酸銨為底物，測(cè)定fdh破菌上清液中的酶活力，結(jié)果表明，fdh破菌上清液催化產(chǎn)生nadh的活性約為10.5u/ml。一個(gè)酶活力單位(u)定義為在測(cè)定條件下，每分鐘產(chǎn)生1mol產(chǎn)物所需的酶量。

3、分別發(fā)酵所述菌株bl21-alad和bl21-fdh

將菌株bl21-alad在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入0.1％的乳糖30℃誘導(dǎo)表達(dá)16h，離心收集菌體即得所述alad表達(dá)菌體，表達(dá)菌體保存于-20℃；將菌株bl21-fdh在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入0.1％的乳糖30℃誘導(dǎo)表達(dá)16h，離心收集菌體即得所述fdh表達(dá)菌體，表達(dá)菌體保存于-20℃。

二、配制催化反應(yīng)體系制備化合物1：

按步驟一中的方法得到alad和fdh的表達(dá)菌體，向250ml三角瓶中依次加入以下藥品配制催化體系：2-酮丁酸0.5mol，甲酸銨0.5mol，nad0.2g/l，甲酸脫氫酶濕菌體10g/l、丙氨酸脫氫酶濕菌體10g/l，氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系ph8.0，在30℃條件下轉(zhuǎn)化16h。所得2-氨基丁酸含量為48.9g/l，產(chǎn)物光學(xué)純度ee為99％，轉(zhuǎn)化率大于95％。，將反應(yīng)液置70℃水浴中加熱1h，抽濾后將濾液減壓旋干，加入等體積乙醇溶解洗去雜質(zhì)，抽濾后即得到化合物1固體。再次醇洗后，產(chǎn)物用于hplc檢測(cè)與結(jié)構(gòu)鑒定，催化體系中產(chǎn)物化合物1的檢測(cè)。

使用2，4-二硝基氟苯衍生化-hplc法測(cè)定化合物1。色譜條件：色譜柱c18柱(4.6mm×250mm，5m)；流動(dòng)相0.02mol/l磷酸氫二鈉緩沖液(pbs，ph7.2)∶乙腈(70∶30)；流速1.0ml/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)360nm。在上述條件下，化合物1的保留時(shí)間為16.513min(圖4，紅色箭頭所示)。采用外標(biāo)法測(cè)定產(chǎn)物生成量，分別配制0.0625、0.125、0.25、0.5和1mg/ml系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液(2-氨基丁酸溶液)，衍生后進(jìn)樣測(cè)定。以溶液濃度c為橫坐標(biāo)，峰面積a為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程a＝31700c+2450.7(r²＝0.9992)。

實(shí)施例2一種酶法合成2-氨基丁酸的方法

除了以下步驟不同之外，其余步驟同實(shí)施例1。

構(gòu)建alad和fdh共表達(dá)的基因工程菌，經(jīng)發(fā)酵制得共表達(dá)fdh和alad的菌體。其中質(zhì)粒pet32a-alad和pet28a-fdh構(gòu)建與實(shí)施例1相同，將質(zhì)粒pet32a-alad和pet28a-fdh轉(zhuǎn)入同一株e.colibl21(de3)，得到共表達(dá)alad和fdh的菌株bl21-alad/fdh，共表達(dá)菌株的重組蛋白誘導(dǎo)見圖5(泳道3箭頭所示為共表達(dá)的誘導(dǎo)蛋白，誘導(dǎo)2為空載體陰性對(duì)照，誘導(dǎo)1為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn))。

(1)共表達(dá)菌的發(fā)酵與實(shí)施例1相同。

(2)向250ml三角瓶中依次加入以下藥品配制催化體系：2-酮丁酸0.5mol，甲酸銨0.5mol，甲酸脫氫酶和丙氨酸脫氫酶共表達(dá)濕菌體20g/l，氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系ph8.0，在30℃條件下轉(zhuǎn)化16h。所得l-2-氨基丁酸含量為49.5g/l，產(chǎn)物光學(xué)純度ee為99％，轉(zhuǎn)化率大于96％。

實(shí)施例3一種酶法合成2-氨基丁酸的方法

除了下述步驟中“將菌株bl21-alad在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入0.1％的乳糖30℃誘導(dǎo)表達(dá)16h，離心收集菌體即得所述alad表達(dá)菌體，表達(dá)菌體保存于-20℃；將菌株bl21-fdh在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入0.1％的乳糖30℃誘導(dǎo)表達(dá)16h，離心收集菌體即得所述fdh表達(dá)菌體，表達(dá)菌體保存于-20℃”中誘導(dǎo)溫度均為30℃改為25℃，其余同實(shí)施例1。

然后按第一步中的方法得到alad和fdh的表達(dá)菌體，向250ml三角瓶中依次加入以下藥品配制催化體系：2-酮丁酸0.5mol，甲酸銨0.5mol，甲酸脫氫酶濕菌體20g/l、丙氨酸脫氫酶濕菌體20g/l，氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系ph8.0，在30℃條件下轉(zhuǎn)化20h。所得2-氨基丁酸含量為48.5g/l，產(chǎn)物光學(xué)純度ee為99％，轉(zhuǎn)化率大于94％。

實(shí)施例4

除了以下步驟不同之外，其余步驟同實(shí)施例1。

按實(shí)施例1中的方法得到alad和fdh的表達(dá)菌體，向250ml三角瓶中依次加入以下藥品配制催化體系：2-酮丁酸1mol，甲酸銨lmol，nad0.3g/l，甲酸脫氫酶濕菌體20g/l、丙氨酸脫氫酶濕菌體20g/l，氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系ph7.5，在30℃條件下轉(zhuǎn)化20h。所得2-氨基丁酸含量為98.9g/l，產(chǎn)物光學(xué)純度ee為99％，轉(zhuǎn)化率大于96％。

實(shí)施例5

除了下述步驟中“將菌株bl21-alad在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入0.1％的乳糖30℃誘導(dǎo)表達(dá)16h，離心收集菌體即得所述alad表達(dá)菌體，表達(dá)菌體保存于-20℃；將菌株bl21-fdh在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入0.1％的乳糖30℃誘導(dǎo)表達(dá)16h，離心收集菌體即得所述fdh表達(dá)菌體，表達(dá)菌體保存于-20℃”中誘導(dǎo)溫度均為30℃改為25℃，其余同實(shí)施例1。

然后按實(shí)施例1中的方法得到alad和fdh的表達(dá)菌體，向250ml三角瓶中依次加入以下藥品配制催化體系：2-酮丁酸1.5mol，甲酸銨1.5mol，nad0.5g/l，甲酸脫氫酶濕菌體20g/l、丙氨酸脫氫酶濕菌體20g/l，氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系ph7.5，在30℃條件下轉(zhuǎn)化20h。所得2-氨基丁酸含量為143.6g/l，產(chǎn)物光學(xué)純度ee為99％，轉(zhuǎn)化率大于93％。

實(shí)施例6：

除了下述步驟中“將菌株bl21-alad在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入0.1％的乳糖30℃誘導(dǎo)表達(dá)16h，離心收集菌體即得所述alad表達(dá)菌體，表達(dá)菌體保存于-20℃；將菌株bl21-fdh在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入0.1％的乳糖30℃誘導(dǎo)表達(dá)16h，離心收集菌體即得所述fdh表達(dá)菌體，表達(dá)菌體保存于-20℃”中誘導(dǎo)溫度均為30℃改為28℃，其余同實(shí)施例1。

然后按照實(shí)施例1中的方法得到alad和fdh的表達(dá)菌體，向250ml三角瓶中依次加入以下藥品配制催化體系：2-酮丁酸1.0mol，甲酸銨1.0mol，甲酸脫氫酶濕菌體25g/l、丙氨酸脫氫酶濕菌體25g/l，氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系ph8.0，在37℃條件下轉(zhuǎn)化20h。所得2-氨基丁酸含量為99.9g/l，產(chǎn)物光學(xué)純度ee為99％，轉(zhuǎn)化率大于97％。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

sequencelisting

<110>魯東大學(xué)

<120>一種酶法合成l-2-氨基丁酸的方法

<130>2017

<160>6

<170>patentinversion3.5

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<213>alaninedehydrogenase

<400>1

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<213>人工合成

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<213>人工合成

<400>3

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<213>人工合成

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<212>dna

<213>人工合成

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