技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于檢測(cè)ifitm1及其調(diào)控的hervs相關(guān)基因的表達(dá)水平來(lái)診斷結(jié)直腸癌的方法。

背景技術(shù)：
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1.近年來(lái)，多項(xiàng)研究表明ifitm1在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，如ifitm1在子宮頸癌、食管癌、卵巢癌、腦癌中均高表達(dá)，并且在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)并被認(rèn)為是結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物。越來(lái)越多人關(guān)注其在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤早期侵襲中的作用。在結(jié)直腸癌中，其僅在腫瘤組織有ifitm1表達(dá)，在腸道腫瘤形成過(guò)程中wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活能誘導(dǎo)ifitm1的表達(dá)；在慢性髓系白血病中，其在高危組表達(dá)水平低，低危組表達(dá)水平高，表達(dá)水平高的患者具有更好的預(yù)后，因此，有人認(rèn)為ifitm1可能是慢性髓系白血病患者預(yù)后的分子標(biāo)志物。

2.人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄酶病毒(humanendogenousretroviruses,hervs)是可轉(zhuǎn)座的遺傳因子，可以插入人的基因組中，在人基因組中占到8％的比例。其在胚胎發(fā)育過(guò)程中被激活，ifitm1能保護(hù)胚胎和生殖細(xì)胞免受內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄酶病毒和外源性病毒的感染。ervs包含有長(zhǎng)的末端重復(fù)序列(ltrs)，能通過(guò)h3k9me3組蛋白修飾來(lái)抑制其表達(dá)，并且可以通過(guò)增加基因組dna甲基化來(lái)抑制hervs的表達(dá)。hervs過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，異常表達(dá)的hervs甚至與癌癥的發(fā)生相關(guān)聯(lián)。

3.前人研究中提議將ifitm1作為結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中ifitm1的表達(dá)與hervs表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，本發(fā)明中以ifitm1及hervs的表達(dá)作為雙重標(biāo)準(zhǔn)來(lái)作為結(jié)直腸癌的標(biāo)志物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于提供一種ifitm1及其調(diào)控的hervs在結(jié)直腸癌標(biāo)記中的用途。具體說(shuō)，本發(fā)明涉及ifitm1蛋白及其調(diào)控的hervs在結(jié)直腸癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的實(shí)施能提供更加準(zhǔn)確的結(jié)直腸癌的診斷。

本發(fā)明的技術(shù)方案

一種蛋白及其調(diào)控的基因即人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒在制備用于檢測(cè)受試者中存在結(jié)直腸癌的體外方法中的試劑盒中的用途，該用途包括：檢測(cè)該ifitm1及其調(diào)控的基因即人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(hervs)在受試者的測(cè)定細(xì)胞即結(jié)直腸活檢測(cè)樣品中的表達(dá)；將所述的測(cè)定值與參考值相比較，ifitm1明顯高于參考值并且hervs明顯低于參考值，表明受試者可能患有結(jié)直腸癌。

所述參考值水平是ifitm1和hervs相關(guān)基因在正常細(xì)胞即結(jié)直腸活檢測(cè)樣品中的水平。所述正常細(xì)胞是相同受試者中與測(cè)定細(xì)胞相同類型的細(xì)胞。所述正常細(xì)胞是受試者中與測(cè)定細(xì)胞相同類型的細(xì)胞，所述受試者沒(méi)有癌癥。所述樣品已知或被懷疑包含腫瘤細(xì)胞。

1.本發(fā)明至少部分基于對(duì)在人結(jié)直腸中高表達(dá)的ifitm1及在結(jié)直腸癌腫瘤中普遍低表達(dá)的hervs基因的鑒定。本發(fā)明的方法對(duì)于結(jié)直腸癌的檢測(cè)有用。

2.利用ifitm1和hervs作為生物標(biāo)記診斷結(jié)直腸癌。

3.本申請(qǐng)所描述的方法可用于診斷受試者中的結(jié)直腸癌的存在。在一些具體實(shí)施方案中，所述的方法包括，從受試者獲取樣品，評(píng)估所述樣品中ifitm1和hervs存在和/或水平，將所述的存在和/或水平與一個(gè)或以上的參照相比較，例如代表正常ifitm1和hervs水平的對(duì)照參照，如來(lái)自未受影響的受試者或來(lái)自相同個(gè)體的正常細(xì)胞的中的水平。

4.樣品：在本發(fā)明的方法的一些具體實(shí)施方案中，所述的樣品是包括已知的或被懷疑的腫瘤細(xì)胞，例如是活檢樣品。在一些具體實(shí)施方案中，所述的樣品是冷凍的，固定的和/或經(jīng)滲透處理的,例如是福爾馬林固定石蠟包埋(ffpe)的樣品或冰凍在液氮中的樣品。

5.檢測(cè)的方法：a.可以使用本領(lǐng)域任何已知的方法來(lái)檢測(cè)和/或定量本申請(qǐng)所述的生物標(biāo)記的水平。例如可以利用本領(lǐng)域已知的方法評(píng)估ifitm1和hervs的mrna(轉(zhuǎn)錄物)的水平，例如northern印跡,rna原位雜交(rna-ish),rna表達(dá)測(cè)定,例如微陣列分析,rt-pcr,rna測(cè)序(例如利用隨機(jī)引物或寡t引物),深度測(cè)序(deepsequencing)，克隆，northern印跡，和擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄物,例如利用定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qrt-pcr)。b.在一些具體實(shí)施方案中，可以檢測(cè)ifitm1和hervs編碼的蛋白質(zhì)的水平?？衫帽绢I(lǐng)域已知的方法評(píng)估蛋白質(zhì)的存在和/或水平,例如利用定量免疫分析方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisas),免疫沉淀，免疫熒光，免疫組織化學(xué)，酶免疫測(cè)定(eia),放射免疫測(cè)定(ria)和western印跡分析。c.在一些具體實(shí)施方案中，所述的方法包括使選擇性地與生物標(biāo)記結(jié)合的試劑與樣品接觸，以評(píng)估樣品中所述生物標(biāo)記，例如ifitm1及hervs轉(zhuǎn)錄物/mrna或蛋白質(zhì)(例如寡核苷酸探針，抗體或其抗原結(jié)合部分)的水平。在一些具體實(shí)施方案中，所述的試劑帶有可檢測(cè)的標(biāo)記。關(guān)于經(jīng)標(biāo)記的試劑，包括將所述試劑與可檢測(cè)的物質(zhì)相偶聯(lián)(即物理連接)的直接標(biāo)記，以及通過(guò)所述試劑與可檢測(cè)的物質(zhì)的反應(yīng)性進(jìn)行間接標(biāo)記?？蓹z測(cè)的物質(zhì)的示例是本領(lǐng)域已知的，包括化學(xué)發(fā)光的，熒光的，放射性的或顯色的標(biāo)記。例如可檢測(cè)的物質(zhì)包括各種酶,輔基,熒光材料，發(fā)光材料，生物發(fā)光材料和放射性材料。合適的酶的例子包括辣根過(guò)氧化物酶，堿性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物的例子包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素，以及親和素/生物素；合適的熒光物質(zhì)的例子包括傘形酮，熒光素，異硫氰酸熒光素,羅丹明),二氯三嗪氨熒光素(dichlorotriazinylaminefluorescein),丹磺酰氯，量子點(diǎn)(quantumdots)或藻紅蛋白；發(fā)光材料的示例包括魯米諾；生物發(fā)光材料的示例包括熒光素酶，熒光素和水母發(fā)光蛋白；

合適的放射性物質(zhì)的示例包括125i,131i,35sor3h?？傮w而言，可利用抗體檢測(cè)蛋白質(zhì)?？贵w可以是多克隆抗體，更優(yōu)選單克隆抗體?？蓱?yīng)用完整抗體或其抗原結(jié)合片段(例如fab或f(ab')2)。

附圖說(shuō)明：

圖1是免疫熒光圖和柱狀圖，通過(guò)免疫熒光和定量pcr實(shí)驗(yàn)證明ifitm1在結(jié)直腸癌腫瘤部位和hescs(wa26和rues2兩個(gè)細(xì)胞系)中確實(shí)高表達(dá)。

圖2是包括免疫熒光圖(d,e)，柱狀圖(g,i)，凝膠電泳圖(h)，細(xì)胞形態(tài)圖(c),曝光圖片(b,f,j)。圖2驗(yàn)證構(gòu)建的ifitm1敲除細(xì)胞系，并檢驗(yàn)ifitm1敲除后細(xì)胞變化。其中a顯示crispr/cas9敲除基因原理圖。b,d鑒定ifitm1敲除細(xì)胞系。c顯示ifitm1敲除后細(xì)胞形態(tài)無(wú)變化。f顯示ifitm1敲除后干細(xì)胞多能性無(wú)明顯變化。i,j顯示ifitm1敲除后細(xì)胞端粒無(wú)明顯變化。g,h顯示ifitm1敲除后細(xì)胞端粒酶活性物明顯變化。

圖3是柱狀圖，檢測(cè)ifitm1敲除后細(xì)胞內(nèi)hervs的表達(dá)。其中a顯示hervs的結(jié)構(gòu)，黑色箭頭表明我們所設(shè)計(jì)定量pcr(chip-qpcr引物同定量pcr)引物的大致位點(diǎn)。b顯示在hescs中，ifitm1敲除后hervs表達(dá)升高(p15代次)。c通過(guò)chip-qpcr實(shí)驗(yàn)說(shuō)明在hescs(rues2)中，ifitm1敲除后h3k9me3在hervs位點(diǎn)的結(jié)合下降(p15代次)。

圖4是免疫熒光圖和散點(diǎn)圖，檢測(cè)ifitm1敲除后細(xì)胞內(nèi)dna甲基化變化情況。通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)，并且統(tǒng)計(jì)細(xì)胞熒光強(qiáng)度后可以知道5mc/5hmc在ififm1-ko的hescs中下降(即dna甲基化下降)，則可以說(shuō)明ifitm1通過(guò)調(diào)控dna甲基化來(lái)調(diào)控hervs的表達(dá)。

圖5是柱狀圖，檢測(cè)病人樣品中hervs的表達(dá)。說(shuō)明在結(jié)直腸癌中腫瘤部位hervs的表達(dá)比正常部位低。

圖6是免疫熒光圖和散點(diǎn)圖，檢測(cè)腫瘤樣品中dna甲基化情況。說(shuō)明在結(jié)直腸癌中，通過(guò)5mc/5hmc的比值可以知道腫瘤部位5mc(dna甲基化程度高)升高，dna甲基化能抑制hervs的表達(dá)，所以ifitm1能通過(guò)調(diào)控dna甲基化程度來(lái)抑制hervs的表達(dá)。

具體實(shí)施例：

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用限制本發(fā)明的范圍。除非另有描述，本發(fā)明的實(shí)施將采用分子生物學(xué)、和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。

實(shí)施例1：

檢測(cè)ifitm1在結(jié)直腸癌中和hescs中的表達(dá)(圖1)

材料與方法：

1.隨機(jī)選取結(jié)直腸癌病人，取結(jié)直腸癌病人冰凍組織切片(包括腫瘤部位和正常部位)，進(jìn)行免疫熒光染色。

2.隨機(jī)選取結(jié)直腸癌病人，提取rna，通過(guò)定量pcr檢測(cè)其ifitm1的mrna水平；并取hescs細(xì)胞系(wa26和rues2)rna,檢測(cè)ifitm1表達(dá)水平。

3.結(jié)果：ifitm1在結(jié)直腸癌中腫瘤部位表達(dá)量顯著高于正常組織，并且其在hescs細(xì)胞系中表達(dá)高(以hef細(xì)胞作為對(duì)照)。

實(shí)施例2：

利用crispr/cas9技術(shù)構(gòu)建ifitm1敲除的hescs細(xì)胞系(圖2)

1.細(xì)胞培養(yǎng)：利用essential8(invitrogen)培養(yǎng)液在37℃、5％co2條件下培養(yǎng)培養(yǎng)hescs細(xì)胞，需要每天換液。

2.構(gòu)建質(zhì)粒：根據(jù)ncbi公布的ifitm1蛋白的cds區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)擴(kuò)增、連接等將其插入px459質(zhì)粒中，經(jīng)陽(yáng)性克隆pcr鑒定、測(cè)序、blast比對(duì)，結(jié)果顯示px459-ifitm1構(gòu)建成功。

3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染及鑒定：hescs細(xì)胞系在essential8培養(yǎng)液中，于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用核轉(zhuǎn)技術(shù)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)到細(xì)胞中，然后培養(yǎng)細(xì)胞。通過(guò)藥物篩選及挑取單克隆細(xì)胞，然后經(jīng)過(guò)測(cè)序及westernblot實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得到ifitm1敲除細(xì)胞。

實(shí)施例3：

驗(yàn)證ifitm1敲除后對(duì)hescs的影響(圖2,3,4)

1.通過(guò)westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到ifitm1敲除后細(xì)胞多能性沒(méi)有變化；通過(guò)定量pcr實(shí)驗(yàn)和trap實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到ifitm1敲除后細(xì)胞端粒酶沒(méi)有變化；通過(guò)定量pcr(t/sratio)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到細(xì)胞端粒長(zhǎng)度沒(méi)有變化。

2.通過(guò)pcr實(shí)驗(yàn)我們檢測(cè)到ifitm1敲除后，收取細(xì)胞提取rna,檢測(cè)知道細(xì)胞內(nèi)hervs升高。檢測(cè)用到的引物如下：

3.通過(guò)chip-qpcr實(shí)驗(yàn)(用2中引物)，我們發(fā)現(xiàn)在ifitm1敲除后，h3k9me3在hervs位點(diǎn)富集程度下降，因?yàn)閔3k9me3具有抑制hervs表達(dá)的作用，因此導(dǎo)致hervs表達(dá)升高。

4.收集3中同代次細(xì)胞做免疫熒光(5mc和5hmc)，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，通過(guò)5mc/5hmc比值可以知道，ifitm1敲除后細(xì)胞dna甲基化程度降低，dna甲基化能夠抑制抑制hervs的表達(dá)。

5結(jié)論：ifitm1能通過(guò)調(diào)節(jié)表觀遺傳的方式來(lái)抑制hervs的表達(dá)。

實(shí)施例4：

驗(yàn)證結(jié)直腸中hervs的表達(dá)(圖5，6)

1.取結(jié)直腸癌病人腫瘤組織和正常組織，然后提取rna，通過(guò)定量pcr檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織中(ifitm1表達(dá)高)hervs表達(dá)比正常組織低(ifitm1表達(dá)低)。

2.將組織石蠟包埋后切片后，免疫熒光染色(5mc和5hmc)，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，通過(guò)5mc/5hmc比值可以知道，腫瘤組織中(ifitm1表達(dá)高)dna甲基化程度高。

3.結(jié)論：同hescs中一樣，ifitm1能通過(guò)調(diào)節(jié)表觀遺傳的方式來(lái)抑制hervs的表達(dá)，并且確定結(jié)直腸中腫瘤組織ifitm1表達(dá)高，并且hervs表達(dá)降低。